Impattatore automatizzato per il modello di lesione del midollo spinale contusivo nei topi

Riepilogo

Qui viene presentato un nuovo dispositivo automatizzato per la contusione da lesione del midollo spinale per topi, in grado di produrre con precisione modelli di contusione da lesione del midollo spinale con vari gradi.

Abstract

La lesione del midollo spinale (SCI) dovuta a lesioni traumatiche come incidenti stradali e cadute è associata a una disfunzione permanente del midollo spinale. La creazione di modelli di contusione della lesione del midollo spinale impattando sul midollo spinale provoca patologie simili alla maggior parte delle lesioni del midollo spinale nella pratica clinica. Modelli animali accurati, riproducibili e convenienti di lesione del midollo spinale sono essenziali per lo studio della lesione del midollo spinale. Presentiamo un nuovo dispositivo automatizzato per la contusione delle lesioni del midollo spinale per topi, il sistema intelligente per lesioni del midollo spinale dell'Università di Guangzhou Jinan, in grado di produrre modelli di contusione per lesioni del midollo spinale con precisione, riproducibilità e praticità. Il sistema produce con precisione modelli di vari gradi di lesione del midollo spinale tramite sensori di distanza laser combinati con una piattaforma mobile automatizzata e un software avanzato. Abbiamo utilizzato questo sistema per creare tre livelli di modelli di topi con lesione del midollo spinale, abbiamo determinato i loro punteggi della scala di topo Basso (BMS) e abbiamo eseguito saggi comportamentali e di colorazione per dimostrarne l'accuratezza e la riproducibilità. Mostriamo ogni fase dello sviluppo dei modelli di lesione utilizzando questo dispositivo, formando una procedura standardizzata. Questo metodo produce modelli murini riproducibili di contusione per lesioni del midollo spinale e riduce i fattori di manipolazione umana attraverso comode procedure di manipolazione. Il modello animale sviluppato è affidabile per lo studio dei meccanismi di lesione del midollo spinale e degli approcci terapeutici associati.

Introduzione

La lesione del midollo spinale di solito provoca una disfunzione permanente del midollo spinale al di sotto del segmento lesionato. È principalmente causato da oggetti che colpiscono la colonna vertebrale e dall'iperestensione della colonna vertebrale, come incidenti stradali e cadute¹. A causa della limitata disponibilità di opzioni terapeutiche efficaci per le lesioni del midollo spinale, la delucidazione della patogenesi delle lesioni del midollo spinale utilizzando modelli animali sarà informativa per lo sviluppo di approcci terapeutici appropriati. Il modello di contusione della lesione del midollo spinale causata dall'impatto sul midollo spinale porta allo sviluppo di modelli animali con patologie simili alla maggior parte dei casi clinici di lesione del midollo spinale ^2,3. Pertanto, è importante produrre modelli animali accurati, riproducibili e convenienti per la contusione della lesione del midollo spinale.

Dall'invenzione da parte di Allen del primo modello animale di lesione del midollo spinale nel 1911, ci sono stati importanti progressi nello sviluppo di strumenti per stabilire modelli animali di lesione del midollo spinale ^4,5. Sulla base dei meccanismi di lesione, i modelli di lesione del midollo spinale sono classificati come contusione, compressione, distrazione, lussazione, transezione o chimica⁶. Tra questi, i modelli di contusione, che utilizzano forze esterne per spostare e danneggiare il midollo spinale, sono i più vicini all'eziologia clinica della maggior parte dei pazienti con lesione del midollo spinale. Pertanto, il modello della contusione è stato utilizzato da molti ricercatori negli studi sulle lesioni del midollo spinale ^3,7. Vari strumenti vengono utilizzati per sviluppare modelli di contusione da lesione del midollo spinale. L'impattatore MASCIS (Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies) della New York University (NYU) produce contusioni da lesioni del midollo spinale mediante un dispositivo di caduta del peso⁸. Dopo diverse versioni aggiornate, l'impattatore MASCIS è ampiamente utilizzato per sviluppare modelli animali di contusione da lesioni del midollo spinale⁹. Tuttavia, quando l'asta d'impatto di MASCIS cade e colpisce il midollo spinale, possono verificarsi lesioni multiple, che influenzano il grado di lesione nei modelli di lesione del midollo spinale. Inoltre, è difficile raggiungere la precisione meccanica per garantire l'accuratezza dello strumento e la ripetibilità del modello di produzione. Gli impattatori dell'orizzonte infinito causano contusioni controllando la forza applicata al midollo spinale piuttosto che pesanti cadute¹⁰. Utilizza un computer collegato a un sensore per misurare direttamente la forza d'impatto tra l'impattatore e il midollo spinale. Quando viene raggiunta la soglia, il dispositivo d'urto viene immediatamente retratto, evitando così il rimbalzo del peso e migliorando la precisione^10,11. Tuttavia, l'uso di questa modalità motoria fine per infliggere danni può causare danni incoerenti e deficit funzionali⁶. Il dispositivo dell'Ohio State University (OSU) comprime la superficie dorsale del midollo spinale a una velocità transitoria mediante un driver elettromagnetico^12,13. Questo dispositivo è simile agli impatti a orizzonte infinito, in quanto utilizza compressioni a breve distanza per causare lesioni al midollo spinale. Tuttavia, presenta vari limiti in quanto la determinazione iniziale del punto zero causerà errori dovuti alla presenza del liquido cerebrospinale ^6,14. In sintesi, ci sono molti strumenti che possono essere utilizzati per sviluppare modelli animali di contusione da lesione del midollo spinale, ma tutti hanno alcune limitazioni che portano a un'insufficiente accuratezza e riproducibilità dei modelli animali. Pertanto, al fine di creare in modo più accurato, conveniente e riproducibile modelli di contusione murina di lesione del midollo spinale, è necessario un impattatore di lesioni del midollo spinale automatizzato e intelligente.

Presentiamo un nuovo impattatore per lesioni del midollo spinale, il sistema intelligente per lesioni del midollo spinale dell'Università di Guangzhou Jinan (sistema SCI intelligente G; Figura 1), per la produzione di modelli di contusione con lesione del midollo spinale. Il dispositivo utilizza un telemetro laser come dispositivo di posizionamento, combinato con una piattaforma mobile automatizzata per automatizzare i colpi in base ai parametri di sciopero impostati, tra cui la velocità di colpo, la profondità di colpo e il tempo di permanenza. Il funzionamento automatizzato riduce i fattori umani e migliora l'accuratezza e la riproducibilità dei modelli animali.

Protocollo

Gli studi sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico dell'Università di Jinan.

1. Anestetizzazione degli animali e laminectomia spinale T10

1. Per questo studio, utilizzare topi C57/6J giovani adulti femmine di 8 settimane. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg) e diazepam (5 mg/kg). Verificare che l'anestesia sia riuscita indicata dalla perdita del riflesso del dolore. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia.
2. Radere i peli sul dorso dei topi usando un rasoio per rivelare la pelle. Disinfettare la pelle con tre cicli alternati di iodoforo e alcool.
3. Praticare un'incisione longitudinale mediale di 2,5 cm nella pelle dorsale utilizzando un bisturi ed esporre la colonna vertebrale a livello T9-T11 utilizzando una pinzetta.
4. Fissare bilateralmente le faccette T10 utilizzando un fissatore spinale. Assicurarsi che la colonna vertebrale sia fissata in modo stabile. Assicurarsi che i muscoli paravertebrali siano spogliati e rimuovere il processo spinoso e le lamine utilizzando un trapano di micro-macinazione per esporre il midollo spinale del segmento T10.

2. Contusione del midollo spinale T10 utilizzando il sistema G smart SCI

1. Accendi l'interruttore e attendi che il dispositivo torni automaticamente al suo stato originale. Posizionare il fissatore spinale nel sistema G smart SCI e fissarlo con le viti.
2. Utilizzando il touch screen operativo (Figura 2A), impostare i parametri di danno, tra cui la velocità di impatto (1 m/s), la profondità di impatto (0,5 mm, 0,8 mm e 1,1 mm per tre diversi set di mouse) e il tempo di permanenza (500 ms)¹⁵.
3. Allineare il telemetro laser al centro del midollo spinale esposto spostando la piattaforma. (Figura 2B)
4. Fare clic sul pulsante Pronto sul touch screen (Figura 2C). La testa d'impatto si regolerà automaticamente a un'altezza specifica in base ai parametri di impostazione. Il tavolo portante sposta automaticamente il sito d'impatto del midollo spinale al di sotto della testa d'impatto.
5. Premere manualmente la testa d'impatto per determinare ulteriormente il sito d'impatto. Fare clic sul pulsante Start , la testa d'impatto colpirà il midollo spinale in base ai parametri impostati.
6. Rimuovere i topi dal dispositivo e osservarli al microscopio stereoscopico (20x) per determinare la lesione del midollo spinale (Figura 3). Per determinare il successo dello sviluppo del modello, osservare la congestione locale, il collasso e la rottura della membrana spinale.
7. Suturare il muscolo, la fascia e la pelle strato per strato utilizzando punti di sutura 3-0. Metti i topi in una scatola calda e attendi che si riprendano.

3. Cure post-operatorie

1. Iniettare meloxicam (5 mg/kg) per via sottocutanea ogni giorno per 7 giorni dopo l'intervento. Svuotare manualmente la vescica ogni 8 ore fino al ripristino delle funzioni della vescica.
2. A 14 giorni dall'operazione, rimuovere i fili di sutura.

4. Testare gli effetti della lesione spinale

1. Calcolare i punteggi BMS per i topi dal primo giorno postoperatorio ^16,17.
2. Il 30^° giorno postoperatorio, eseguire esperimenti comportamentali sugli animali, tra cui passerella, guasto al piede e rotarod^16,17. Passerella: distanza record di 45 cm; Durata massima della corsa 8 s; Guadagno fotocamera 28,02; Soglia di intensità 0,01. Errore del piede: registra 60 passi per ogni mouse. Rotarod: Velocità 20 giri/min. Registrare il tempo di caduta del mouse e registrarlo come 120 s per più di 120 s.
3. Il 31° giorno postoperatorio, anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg) e diazepam (5 mg/kg) e quindi eutanasia i topi mediante perfusione utilizzando PFA al 4%. Rimuovere con cautela il midollo spinale e intercettare 5 mm sopra e sotto il sito della lesione per l'inclusione della paraffina. Fare una sezione di 5 μm del centro della lesione del midollo spinale del topo ed eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina¹⁷.
4. Per l'analisi statistica utilizzare software commerciali. Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM) e confrontarli utilizzando l'ANOVA unidirezionale; p < 0,05 è stato considerato significativo.

Risultati

La laminectomia è stata eseguita su 24 topi femmina (8 settimane di età) come descritto sopra. I topi del gruppo sham (n = 6) non sono stati sottoposti a lesioni del midollo spinale, mentre il resto dei topi, compreso il gruppo da 0,5 mm (n = 6), il gruppo da 0,8 mm (n = 6) e il gruppo da 1,1 mm (n = 6) sono stati sottoposti a diverse profondità di conflitto del midollo spinale. I punteggi BMS sono stati regolarmente registrati fino a 1 mese dopo l'intervento (Figura 4). Ci sono state dif...

Discussione

La lesione del midollo spinale può portare a deficit sensoriali e motori, che possono provocare gravi menomazioni fisiche e mentali. In Cina, l'incidenza di lesioni del midollo spinale nelle diverse province varia da 14,6 a 60,6 per milione¹⁸. L'aumento della prevalenza della lesione midollare eserciterà una maggiore pressione sul sistema sanitario. Attualmente, le opzioni terapeutiche efficaci per le lesioni del midollo spinale e le lesioni sono limitate, perché i suoi meccanismi patologici e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01M PBS (powder, pH7.2-7.4)	Solarbio Life Sciences	P1010
2,2,2-Tribromoethanol	Macklin	75-80-9
4% paraformaldehyde tissue fixative	Biosharp life science	BL539A
Biomicroscope	Leica	LCC50 HD
CatWalk	Noldus Information Technology	CatWalk XT 9.1
Cover glass	CITOTEST Scientific	10212432C
Embedding machine	Changzhou Zhongwei Electronic Instrument	BMJ-A
Ethanol absolute	DAMAO	64-17-5
FootFaultScan	Clever Sys Inc.	-
Glass slide	CITOTEST Scientific	80302-2104
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
micro-grinding drill	FEIYUBIO	19-7010
Mouse spinal fixator	RWD Life Science	68094
Paraffin microtome	Thermo	shandon finesse 325
RotaRod for Mice	Ugo Basile	47600
Stereomicroscope	KUY NICE	SZM-7045
Tert-Amyl alcohol	Macklin	75-85-4
Xylene	China National Pharmaceutical	#10023418