Metodología para la inactivación metabólica de bacterias para la investigación de Caenorhabditis elegans

Resumen

La fuente de alimento para Caenorhabditis elegans en el laboratorio es Escherichia coli viva. Dado que las bacterias son metabólicamente activas, presentan una variable de confusión en los estudios metabólicos y farmacológicos en C. elegans. Aquí se describe un protocolo detallado para inactivar metabólicamente las bacterias utilizando paraformaldehído.

Resumen

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo común para la investigación en genética, desarrollo, envejecimiento, metabolismo y comportamiento. Debido a que C. elegans consume una dieta de bacterias vivas, la actividad metabólica de su fuente de alimento puede confundir los experimentos que buscan los efectos directos de diversas intervenciones en el gusano. Para evitar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano, los investigadores de C. elegans han utilizado múltiples métodos para inactivar metabólicamente las bacterias, incluida la irradiación ultravioleta (UV), la eliminación del calor y los antibióticos. El tratamiento UV tiene un rendimiento relativamente bajo y no se puede utilizar en cultivos líquidos porque cada placa debe examinarse para detectar una eliminación bacteriana exitosa. Un segundo método de tratamiento, la eliminación por calor, afecta negativamente la textura y la calidad nutricional de las bacterias, lo que lleva a la detención del desarrollo de C. elegans. Por último, el tratamiento con antibióticos puede alterar directamente la fisiología de C. elegans , además de prevenir el crecimiento bacteriano. Este manuscrito describe un método alternativo para inactivar metabólicamente bacterias utilizando paraformaldehído (PFA). El tratamiento con PFA retila las proteínas dentro de las células bacterianas para prevenir la actividad metabólica al tiempo que preserva la estructura celular y el contenido nutricional. Este método es de alto rendimiento y se puede utilizar en cultivos líquidos o placas sólidas, ya que la prueba de crecimiento de una placa de bacterias tratadas con PFA valida todo el lote. La inactivación metabólica a través del tratamiento con PFA se puede utilizar para eliminar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano en los estudios de suplementación con fármacos o metabolitos, resistencia al estrés, metabolómica y comportamiento en C. elegans.

Introducción

Caenorhabditis elegans fue propuesto originalmente como un organismo modelo en 1965¹ y desde entonces ha sido ampliamente adoptado en estudios de genética, desarrollo, comportamiento, envejecimiento y metabolismo². Debido a su gran tamaño de cría y a su cutícula transparente, C. elegans es especialmente adecuado para el cribado de alto rendimiento con reporteros fluorescentes³. Su corto ciclo de vida, su reproducción hermafrodita y su homología genética con los humanos también hacen de C. elegans un valioso sistema modelo para estudios sobre el desarrollo⁴ y la biología del envejecimiento⁵. Además, C. elegans es relativamente fácil de mantener. Los gusanos pueden cultivarse en cultivo líquido o en placas de agar sólido y consumir una dieta de bacterias vivas Escherichia coli OP50⁴.

Sin embargo, la fuente de alimento vivo de C. elegans puede confundir los estudios sobre el metabolismo, la suplementación con medicamentos y el comportamiento. Debido a que las bacterias vivas tienen su propio metabolismo, las condiciones experimentales que afectan a las bacterias también alteran los nutrientes y metabolitos disponibles para los gusanos. Por ejemplo, las diferencias en las concentraciones bacterianas de hierro, aminoácidos y folato tienen diversos efectos en el desarrollo, la fisiología y la esperanza de vida de C. elegans. Muchas prácticas comunes de laboratorio pueden provocar tales cambios en la composición de nutrientes y metabolitos producidos por OP50. Específicamente, la exposición a la 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR), un compuesto comúnmente utilizado para prevenir la reproducción en C. elegans, provoca amplios cambios en la expresión génica de OP50, incluidas las vías de biosíntesis de aminoácidos⁷. Las bacterias vivas también pueden confundir los estudios en los que C. elegans se complementa con moléculas pequeñas porque las bacterias pueden metabolizar parcial o completamente los compuestos activos. Además, los efectos de estas pequeñas moléculas sobre las bacterias pueden, a su vez, alterar la fisiología de C. elegans, como se informó con el fármaco metformina⁸, que prolonga la vida útil. Finalmente, las bacterias vivas pueden cambiar el entorno del gusano de maneras que alteran el comportamiento, como la secreción de olores atractivos⁹, la producción de neuromoduladores exógenos¹⁰ y la creación de gradientes de oxígeno en un césped de bacterias densas¹¹.

Para mitigar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano en la investigación de C. elegans , se han desarrollado múltiples métodos para matar bacterias (Tabla 1). Tres estrategias comunes para eliminar la OP50 son la irradiación UV, la eliminación del calor y el tratamiento con antibióticos. Si bien son sencillos y de costo relativamente bajo, cada uno de estos métodos puede tener efectos indeseables tanto en las bacterias como en C. elegans. La eliminación de UV a través de un reticulante UV¹² es de bajo rendimiento y la velocidad está limitada por el número de placas que pueden caber en el reticulante UV. Además, la eficacia de la eliminación de los rayos UV puede variar de una placa a otra dentro de un lote, y las pruebas de crecimiento en todas las placas pueden resultar difíciles en experimentos grandes. Matar el calor de OP50 al exponer el cultivo a temperaturas de >60 °C conlleva un conjunto separado de desafíos. Las altas temperaturas pueden dañar los nutrientes esenciales para la lombriz y destruir la estructura celular de las bacterias, creando una textura más suave que disminuye la cantidad de tiempo que las lombrices pasan en^{la comida.} Este método tampoco se puede utilizar durante todo el ciclo de vida de C. elegans porque los gusanos alimentados con bacterias muertas por calor pueden detenerse en las primeras etapas del desarrollo¹³. El tratamiento con antibióticos es un tercer método común para suprimir el metabolismo bacteriano¹⁴, pero los antibióticos también pueden alterar el crecimiento y el metabolismo de las lombrices¹⁵.

Una solución para eliminar los efectos metabólicos de las bacterias vivas mientras se preserva la estructura bacteriana y los nutrientes esenciales es matar el OP50 con paraformaldehído (PFA)¹⁶. El PFA es un polímero de formaldehído que puede reticularmente proteínas dentro de las células¹⁷ para evitar la replicación bacteriana sin destruir las estructuras celulares internas como la membrana plasmática interna¹⁸. Debido a esta preservación de la estructura celular interna, las bacterias tratadas con PFA no exhiben crecimiento ni actividad metabólica, pero siguen siendo una fuente de alimento comestible y rica en nutrientes para C. elegans¹⁶. Aquí, se proporciona un protocolo detallado que muestra cómo inactivar metabólicamente las bacterias usando paraformaldehído.

Método	Materiales requeridos	¿Escalable?		¿Nutricional?	¿Efectos en Worm?
UV	Reticulante UV	Limitado por:		Sí	Efectos variables sobre la esperanza de vida en NGM12, 23, 24
		Número de placas que caben en el reticulante UV			Efectos variables sobre la vida útil en FUdR24, 26, 27
		Tiempo de irradiación por placa			Disminución de la preferencia alimentaria16
		Capacidad para revisar el crecimiento de cada placa8
Calor	Incubadora a >60 °C	Sí		No: destruye la pared celular, disminuye el valor nutricional	Detención del desarrollo 13
					Disminución de la preferencia alimentaria13
					Prolonga la vida útil de NGM31
Antibióticos	Antibióticos (kanamicina, carbenicilina, etc.)	Sí		Sí	Retrasa el crecimiento y el desarrollo15
					Prolonga la vida útil en medios líquidos19
					Prolonga la vida útil de NGM15
PFA	0,5% Paraformaldehído	Sí		Sí	Disminución del tamaño de las crías pequeñas16
					Pequeño aumento del tiempo de desarrollo16
					Disminución de la preferencia alimentaria16

Tabla 1. Comparaciones de métodos para matar OP50. La eliminación de los rayos UV, la eliminación del calor, el tratamiento con antibióticos y el tratamiento con PFA tienen efectos variados sobre el estado nutricional de las bacterias y la salud de las lombrices alimentadas con bacterias tratadas. Estos métodos para inactivar replicativamente E. coli también difieren en sus materiales requeridos y escalabilidad.

Protocolo

1. Inoculación de bacterias

1. Preparar caldo de Luria (LB) disolviendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro de sodio (NaCl) en 950 mL de agua destilada.
2. Ajuste el pH del LB a 7.0 agregando hidróxido de sodio (NaOH) 5M. Esto solo debería requerir alrededor de 0.2 mL de NaOH.
3. Autoclave el medio LB ajustado por pH en un ciclo de líquido durante 45 minutos a 15 psi. Deje que la solución se enfríe y guárdela a temperatura ambiente.
4. Inocular una sola colonia de bacterias en 100 mL de LB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Cultive las bacterias durante la noche en una incubadora agitadora a 37 °C.
5. Dependiendo de la salud de la colonia bacteriana, el tamaño del matraz y la velocidad a la que esté ajustado el agitador, el tiempo que tardan las bacterias en crecer puede variar. Después de ~14 h, verifique la densidad óptica (OD) de las bacterias a 600 nm (OD₆₀₀).
6. Retire las bacterias del agitador cuando el diámetro exterior₆₀₀ sea 3.0 (1 x 10⁹ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml). Si el diámetro exterior₆₀₀ es inferior a 3,0, devuelva el matraz a la incubadora agitadora hasta alcanzar el diámetro exterior deseado.
7. Alícuota de las bacterias en tubos cónicos de 50 ml y almacenarlas a 4 °C o continuar con el siguiente paso.

2. Trabajar con paraformaldehído

NOTA: La concentración de paraformaldehído (PFA) utilizada y la duración de la exposición pueden variar un poco según el clima, la ubicación y el tipo de bacteria que se esté tratando. Un buen punto de partida para OP50 es la exposición a PFA al 0,5% durante 1 h, mientras que el PFA al 0,25% durante 1 h puede ser suficiente para HT115.

1. Prepare existencias de PFA al 32 % o use una solución de PFA al 32 % comprada comercialmente. Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando trabaje con PFA. Use guantes y protección para los ojos.
2. Agregue PFA dentro de una campana de extracción de gases químicos con ventilación adecuada. Deseche los lavados y puntas que contengan PFA en recipientes adecuados para productos químicos peligrosos en la campana extractora.

3. Tratamiento bacteriano con paraformaldehído

1. Una vez que las bacterias alcancen un OD₆₀₀ de 3,0, utilice una pipeta serológica para transferir 50 ml a un nuevo matraz Erlenmeyer de 250 ml. Guarde el resto para un control en vivo, un control simulado (consulte el paso 4) o para tratar también con PFA según sea necesario.
2. Evite verter de un matraz a otro y tenga cuidado de no salpicar los lados del nuevo matraz con bacterias. Las colonias en el costado del matraz pueden recibir una dosis más baja de PFA.
3. En la campana química, agregue 781 μL de PFA al 32% a 50 ml de bacterias para llevar la concentración final al 0,5%. Deseche la punta utilizada en un contenedor de desechos sólidos para productos químicos peligrosos.
4. Cubra el matraz con papel de aluminio y vuelva a colocarlo en la incubadora agitadora a 37 °C durante 1 h. Después de 1 h, retire el matraz de la incubadora y continúe con el paso 5.

4. Control simulado

1. Una vez que las bacterias alcancen un OD₆₀₀ de 3,0, utilice una pipeta serológica para transferir 50 ml de las bacterias a un tubo cónico de 50 ml.
2. Continúe con el paso 5.3 para completar los pasos de lavado similares a los del grupo tratado con PFA.

5. Lavar las bacterias para eliminar los residuos de PFA

1. En la campana química, utilice una pipeta serológica para transferir las bacterias tratadas del matraz Erlenmeyer a un tubo cónico de 50 ml. El uso de una pipeta serológica en lugar de verter las bacterias evitará la contaminación de cualquier colonia bacteriana en el borde del matraz que pueda haber evitado el tratamiento directo con PFA.
2. Centrifugar las bacterias tratadas a aproximadamente 3000 x g durante 20 min. Retire el sobrenadante desechándolo en un contenedor de residuos líquidos peligrosos para productos químicos en la campana química.
3. Agregue 25 ml de LB y vórtice para resuspender el gránulo bacteriano (llenar el tubo por completo dificulta la resuspensión del gránulo). Repetir la centrifugación y la resuspensión de pellets 4 veces.
4. Vuelva a suspender el gránulo en volúmenes óptimos para diferentes ensayos. Para los ensayos de vida útil, siembre placas de 60 mm con 200 μL de bacterias resuspendidas en 10 mL de LB. La resuspensión de las bacterias en 10 mL de LB da como resultado una concentración de 5 veces mayor que el cultivo original de 50 mL.
5. Almacenar las bacterias a 4 °C.

6. Control de calidad del crecimiento bacteriano

1. Después del lavado final y la resuspensión, raye una placa LB (con una punta de pipeta estéril) con las bacterias preparadas. Es una buena práctica rayar el LB utilizado para lavar y volver a suspender en una placa separada para asegurarse de que el LB utilizado no esté contaminado.
2. Coloque las placas en una incubadora a 37 °C durante la noche. Compruebe si hay algún crecimiento. Las bacterias se consideran muertas replicativamente cuando las colonias no crecen en la placa LB.

7. Control de calidad del metabolismo bacteriano mediante un respirómetro

1. Después del lavado final y la resuspensión del paso 5.4, confirme que las bacterias están metabólicamente muertas utilizando las herramientas disponibles, como los respirómetros^19,20 y midiendo la tasa de consumo basal de oxígeno (OCR).
2. Preparar la solución M9: Disolver 3 g de fosfato de potasio monobásico (KH 2 PO 4),6 g de fosfato de sodio dibásico (Na₂HPO₄) y 5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 950 ml de agua destilada. Autoclave en un ciclo de líquido durante 45 minutos a 15 psi, luego deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Agregue 1 mL de sulfato de magnesio 1 M (MgSO₄) y guárdelo a temperatura ambiente.
3. Hidratar el cartucho del respirómetro: Agregue 200 μL de calibrante a todos los pocillos de una placa de 96 pocillos. Coloque el cartucho en la placa de 96 pocillos e incube durante la noche en una incubadora a 37 °C.
4. Calibración del ensayo: Al día siguiente, coloque el cartucho hidratado en la máquina y comience la calibración.
5. Configuración de la placa de prueba de ensayo: Con una nueva placa de 96 pocillos, agregue 160 μL de M9 y 40 μL de las bacterias preparadas (1 x 10⁹ UFC/mL) para probar los pocillos. Agregue 200 μL de M9 a los 4 pocillos de esquina para usarlos como pocillos en blanco. Añadir 160 μL de M9 y 40 μL de LB utilizados para lavar y resuspender para usar como controles negativos. Añadir 200 μL de M9 al resto de pocillos que no se vayan a utilizar.
6. Ejecute el ensayo: Una vez completada la calibración del cartucho, inserte la placa de ensayo del paso 7.5 en la máquina para su análisis. Los ajustes incluyen pasos para mezclar, esperar, medir y hacer un bucle. Los resultados se mostrarán como tasa de consumo de oxígeno (OCR). Las bacterias están metabólicamente muertas y listas para usar cuando el OCR es cero.

Figura 1. Flujo de trabajo para el tratamiento con paraformaldehído. Una sola colonia de la bacteria E. coli OP50 se cultiva durante la noche. Se añade PFA a una concentración final del 0,5% y el cultivo tratado con PFA se agita durante 1 h a 37 °C. Finalmente, el PFA se elimina lavando el cultivo con LB fresco 5x. Para confirmar que las bacterias tratadas están inactivas de forma replicativa, saque una placa LB de las bacterias tratadas y crezca durante la noche. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

En la Figura 1 se muestra un flujo de trabajo detallado del protocolo. Se desarrolló y optimizó un método de alto rendimiento para inactivar consistentemente la replicación bacteriana (Figura 2A) y el metabolismo (Figura 2B) para estudios metabólicos y de fármacos en la investigación de C. elegans utilizando paraformaldehído¹⁶. El objetivo era determinar la concentración más baja de PFA nec...

Discusión

Beneficios de la eliminación de PFA en relación con otros métodos de eliminación de bacterias
El tratamiento con PFA es un método de alto rendimiento para prevenir el metabolismo bacteriano mientras se mantiene una fuente de alimento nutritivo para C. elegans. La eliminación de bacterias mediante el tratamiento con PFA tiene múltiples ventajas sobre otros métodos. A diferencia del tratamiento UV, en el que cada placa debe probarse para comprobar si se ha eliminado con éxito, se puede...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Foil	Staples	2549291
Bunsen burner	VWR	470121-700
Cell Density Meter	Denville	80-3000-45
Centrifuge	Eppendorg	5430
Chemical fume hood	Labcono	975050411384RG
Conincal tubes (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Erlenmyer flasks	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Inoculation loop	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Liquid waste collection bottle	Thomas Scientific	1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldehyde (32%)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm)	Fisher	FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate	Agilent	101085-004
Serological pipettes (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
Shaker incubator	Thermo	11 676 083
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Solid waste collection bucket	M&M Industries	5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Weighing balance	C Goldenwall	HZ10K6B
Yeast Extract	Genesee Scientific	20-255