מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר Caenorhabditis elegans

Summary

מקור המזון של Caenorhabditis elegans במעבדה הוא Escherichia coli חי. מכיוון שחיידקים פעילים מטבולית, הם מציגים משתנה מבלבל במחקרים מטבוליים ותרופתיים ב- C. elegans. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לנטרול מטבולי של חיידקים באמצעות פרפורמלדהיד.

Abstract

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל נפוץ למחקר בגנטיקה, התפתחות, הזדקנות, מטבוליזם והתנהגות. מכיוון ש-C. elegans צורכים תזונה של חיידקים חיים, הפעילות המטבולית של מקור המזון שלהם יכולה לבלבל ניסויים המחפשים את ההשפעות הישירות של התערבויות שונות על התולעת. כדי להימנע מההשפעות המבלבלות של חילוף החומרים של חיידקים, חוקרי C. elegans השתמשו בשיטות רבות כדי להשבית חיידקים מבחינה מטבולית, כולל קרינה אולטרה סגולה (UV), הרג חום ואנטיביוטיקה. טיפול UV הוא בעל תפוקה נמוכה יחסית ולא ניתן להשתמש בו בתרבית נוזלית מכיוון שיש לבדוק כל צלחת להרג חיידקים מוצלח. שיטת טיפול שנייה, קוטלת חום, משפיעה לרעה על המרקם והאיכות התזונתית של החיידק, מה שמוביל למעצר התפתחותי של C. elegans. לבסוף, טיפול אנטיביוטי יכול לשנות ישירות את הפיזיולוגיה של C. elegans בנוסף למניעת צמיחת חיידקים. כתב יד זה מתאר שיטה חלופית לנטרול מטבולי של חיידקים באמצעות פרפורמלדהיד (PFA). טיפול PFA מצליב חלבונים בתוך תאי חיידקים כדי למנוע פעילות מטבולית תוך שמירה על מבנה התא ותכולת התזונה. שיטה זו היא בעלת תפוקה גבוהה וניתן להשתמש בה בתרבית נוזלית או בצלחות מוצקות, שכן בדיקת צלחת אחת של חיידקים שטופלו ב- PFA לגדילה מאמתת את כל האצווה. ניתן להשתמש בהשבתה מטבולית באמצעות טיפול PFA כדי לחסל את ההשפעות המבלבלות של מטבוליזם חיידקי על מחקרים של תוספי תרופות או מטבוליטים, עמידות ללחץ, מטבוליזם והתנהגות ב- C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans הוצע במקור כאורגניזם מודל בשנת 1965¹ ומאז אומץ באופן נרחב במחקרים על גנטיקה, התפתחות, התנהגות, הזדקנות ומטבוליזם². בשל גודלם הגדול והציפורן השקופה שלהם, C. elegans מתאים במיוחד לסינון בתפוקה גבוהה עם כתבי פלורסנט³. מחזור החיים הקצר שלהם, הרבייה ההרמפרודיטית וההומולוגיה הגנטית שלהם עם בני אדם הופכים גם את C. elegans למערכת מודל רבת ערך למחקרים על התפתחות⁴ וביולוגיה של הזדקנות⁵. יתר על כן, C. elegans הם יחסית קל לתחזוקה. ניתן לגדל תולעים בתרבית נוזלית או על צלחות אגר מוצקות ולצרוך תזונה של חייד....

Protocol

1. חיסון חיידקים

1. הכינו ציר לוריא (LB) על ידי המסת 10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים ו-10 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב-950 מ"ל מים מזוקקים.
2. התאם את ה- pH של LB ל- 7.0 על ידי הוספת 5M נתרן הידרוקסידי (NaOH). זה צריך לדרוש רק כ 0.2 מ"ל של NaOH.
3. בצע Autoclave של מדיית LB מותאמת pH במחזור נוזל למשך 45 דקות ב- 15 psi. אפשר לתמיסה להתקרר ולאחסן בטמפרטורת החדר.
4. חסן מושבה אחת של חיידקים ב 100 מ"ל של LB בבקבוק Erlenmeyer 500 מ"ל. תרבית את החיידקים למשך הלילה באינקובטור שייקר של 37 מעלות צלזיוס.
5. בהתאם לבריאות מושבת החיידקים, גודל הבקבוק והמהירות אליה מכוון השייקר, הזמן שלוקח לחיידקים לגדול עשוי להשתנות. לאחר ~14 שעות,....

תוצאות

זרימת עבודה מפורטת של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. שיטה בעלת תפוקה גבוהה פותחה ועברה אופטימיזציה כדי להשבית באופן עקבי שכפול חיידקים (איור 2A) ומטבוליזם (איור 2B) עבור מחקרים מטבוליים ותרופתיים במחקר C. elegans באמצעות פרפורמלדהיד¹⁶. .......

Discussion

היתרונות של הרג PFA ביחס לשיטות הרג חיידקים אחרות
טיפול PFA הוא שיטה בעלת תפוקה גבוהה למניעת חילוף חומרים חיידקי תוך שמירה על מקור מזון מזין עבור C. elegans. להרג חיידקים באמצעות טיפול PFA יש יתרונות רבים על פני שיטות אחרות. שלא כמו טיפול UV, שבו כל צלחת חייבת להיבדק להרג מוצלח, צלחת אח.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Foil	Staples	2549291
Bunsen burner	VWR	470121-700
Cell Density Meter	Denville	80-3000-45
Centrifuge	Eppendorg	5430
Chemical fume hood	Labcono	975050411384RG
Conincal tubes (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Erlenmyer flasks	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Inoculation loop	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Liquid waste collection bottle	Thomas Scientific	1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldehyde (32%)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm)	Fisher	FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate	Agilent	101085-004
Serological pipettes (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
Shaker incubator	Thermo	11 676 083
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Solid waste collection bucket	M&M Industries	5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Weighing balance	C Goldenwall	HZ10K6B
Yeast Extract	Genesee Scientific	20-255