Methodik zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien für die Caenorhabditis elegans-Forschung

Zusammenfassung

Die Nahrungsquelle für Caenorhabditis elegans im Labor sind lebende Escherichia coli. Da Bakterien metabolisch aktiv sind, stellen sie eine Störvariable in metabolischen und medikamentösen Studien an C. elegans dar. Ein detailliertes Protokoll zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien mit Paraformaldehyd ist hier beschrieben.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans ist ein gängiger Modellorganismus für die Erforschung von Genetik, Entwicklung, Alterung, Stoffwechsel und Verhalten. Da C. elegans sich von lebenden Bakterien ernährt, kann die Stoffwechselaktivität ihrer Nahrungsquelle Experimente verwirren, die nach den direkten Auswirkungen verschiedener Eingriffe auf den Wurm suchen. Um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels zu vermeiden, haben die Forscher von C. elegans mehrere Methoden zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien eingesetzt, darunter ultraviolette (UV)-Bestrahlung, Hitzeabtötung und Antibiotika. Die UV-Behandlung hat einen relativ geringen Durchsatz und kann nicht in der Flüssigkultur eingesetzt werden, da jede Platte auf eine erfolgreiche bakterielle Abtötung untersucht werden muss. Eine zweite Behandlungsmethode, die Hitzeabtötung, wirkt sich negativ auf die Textur und die Nährstoffqualität der Bakterien aus, was zum Entwicklungsstillstand von C. elegans führt. Schließlich kann die Behandlung mit Antibiotika die Physiologie von C. elegans direkt verändern und das Bakterienwachstum verhindern. Dieses Manuskript beschreibt eine alternative Methode zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien mittels Paraformaldehyd (PFA). Bei der PFA-Behandlung werden Proteine in Bakterienzellen vernetzt, um die Stoffwechselaktivität zu verhindern und gleichzeitig die Zellstruktur und den Nährstoffgehalt zu erhalten. Diese Methode hat einen hohen Durchsatz und kann in Flüssigkulturen oder festen Platten verwendet werden, da das Testen einer Platte mit PFA-behandelten Bakterien auf Wachstum die gesamte Charge validiert. Die metabolische Inaktivierung durch PFA-Behandlung kann verwendet werden, um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels auf Studien zur Arzneimittel- oder Metaboliten-Supplementierung, Stressresistenz, Metabolomik und Verhalten bei C. elegans zu eliminieren.

Einleitung

Caenorhabditis elegans wurde ursprünglich 1965 als Modellorganismus^{vorgeschlagen 1 und} hat sich seitdem in Studien zu Genetik, Entwicklung, Verhalten, Altern und Stoffwechsel 2^{durchgesetzt.} Aufgrund ihrer großen Brutgröße und transparenten Kutikula eignet sich C. elegans besonders gut für das Hochdurchsatz-Screening mit fluoreszierenden Reportern³. Ihr kurzer Lebenszyklus, ihre hermaphroditische Vermehrung und ihre genetische Homologie mit dem Menschen machen C. elegans auch zu einem wertvollen Modellsystem für Studien zur Entwicklung⁴ und zur Alterungsbiologie⁵. Darüber hinaus sind C. elegans relativ pflegeleicht. Würmer können in Flüssigkultur oder auf festen Agarplatten gezüchtet werden und ernähren sich von lebenden Escherichia coli OP50-Bakterien⁴.

Die Lebendnahrungsquelle von C. elegans kann jedoch Studien über den Stoffwechsel, die Einnahme von Medikamenten und das Verhalten verfälschen. Da lebende Bakterien ihren eigenen Stoffwechsel haben, verändern Versuchsbedingungen, die auf die Bakterien einwirken, auch die Nährstoffe und Metaboliten, die den Würmern zur Verfügung stehen. Zum Beispiel haben Unterschiede in den bakteriellen Eisen-, Aminosäure- und Folatkonzentrationen unterschiedliche Auswirkungen auf die Entwicklung, Physiologie und Lebensdauer von C. elegans ⁶. Viele gängige Laborpraktiken können solche Veränderungen in der Nährstoffzusammensetzung und den von OP50 produzierten Metaboliten hervorrufen. Insbesondere die Exposition gegenüber 5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUdR), einer Verbindung, die üblicherweise zur Verhinderung der Fortpflanzung bei C. elegans verwendet wird, löst breite Veränderungen in der OP50-Genexpression aus, einschließlich der Aminosäurebiosynthesewege⁷. Lebende Bakterien können auch Studien verfälschen, in denen C. elegans mit kleinen Molekülen ergänzt wird, da Bakterien die Wirkstoffe teilweise oder vollständig verstoffwechseln können. Darüber hinaus können die Auswirkungen dieser kleinen Moleküle auf die Bakterien wiederum die Physiologie von C. elegans verändern, wie mit dem lebensverlängernden Medikament Metformin⁸ berichtet wurde. Schließlich können lebende Bakterien die Umgebung des Wurms auf eine Weise verändern, die das Verhalten ändert, wie z. B. die Sekretion attraktiver Geruchsstoffe⁹, die Produktion exogener Neuromodulatoren¹⁰ und die Schaffung von Sauerstoffgradienten in einem dichten Bakterienrasen¹¹.

Um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels auf die Forschung an C. elegans abzuschwächen, wurden mehrere Methoden zur Abtötung von Bakterien entwickelt (Tabelle 1). Drei gängige Strategien zur Abtötung von OP50 sind UV-Bestrahlung, Hitzeabtötung und Antibiotikabehandlung. Obwohl sie unkompliziert und relativ kostengünstig sind, kann jede dieser Methoden unerwünschte Auswirkungen sowohl auf Bakterien als auch auf C. elegans haben. Die UV-Abtötung über einen UV-Vernetzer¹² ist ein geringer Durchsatz, und die Geschwindigkeit ist durch die Anzahl der Platten begrenzt, die in den UV-Vernetzer passen können. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit der UV-Abtötung von Platte zu Platte innerhalb einer Charge variieren, und das Testen auf Wachstum auf allen Platten kann in großen Experimenten schwierig werden. Die hitzeabtötende OP50 durch die Aussetzung der Kultur gegenüber Temperaturen von >60 °C bringt eine Reihe anderer Herausforderungen mit sich. Hohe Hitze kann die für den Wurm wichtigen Nährstoffe schädigen und die Zellstruktur von Bakterien zerstören, wodurch eine weichere Textur entsteht, die die Zeit, die Würmer mit dem Futter verbringen, verringert¹³. Diese Methode kann auch nicht während des gesamten Lebenszyklus von C. elegans angewendet werden, da Würmer, die mit hitzeabgetöteten Bakterien gefüttert werden, in einem frühen Entwicklungsstadium zum Stillstand kommen können¹³. Die Behandlung mit Antibiotika ist eine dritte gängige Methode zur Unterdrückung des bakteriellen Stoffwechsels¹⁴, aber Antibiotika können auch das Wachstum und den Stoffwechsel von Würmern verändern¹⁵.

Eine Lösung, um die metabolischen Auswirkungen lebender Bakterien zu eliminieren und gleichzeitig die Bakterienstruktur und die essentiellen Nährstoffe zu erhalten, besteht darin, OP50 mit Paraformaldehyd (PFA)¹⁶ abzutöten. PFA ist ein Polymer aus Formaldehyd, das Proteine innerhalb von Zellen¹⁷ vernetzen kann, um die bakterielle Replikation zu verhindern, ohne interne Zellstrukturen wie die innere Plasmamembran¹⁸ zu zerstören. Aufgrund dieser Erhaltung der inneren Zellstruktur zeigen PFA-behandelte Bakterien kein Wachstum oder Stoffwechselaktivität, bleiben aber eine essbare und nährstoffreiche Nahrungsquelle für C. elegans¹⁶. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, das zeigt, wie Bakterien mit Paraformaldehyd metabolisch inaktiviert werden können.

Methode	Benötigte Materialien	Skalierbar?		Ernährungs?	Auswirkungen auf Worm?
UV	UV-Vernetzer	Begrenzt durch:		Ja	Unterschiedliche Auswirkungen auf die Lebensdauer von NGM12, 23, 24
		Anzahl der Platten, die in den UV-Vernetzer passen			Unterschiedliche Auswirkungen auf die Lebensdauer von FUdR24, 26, 27
		Bestrahlungszeit pro Platte			Verminderte Lebensmittelpräferenz16
		Fähigkeit, jede Platte auf Wachstum zu überprüfen8
Wärme	>60 °C Inkubator	Ja		Nein: zerstört die Zellwand, vermindert den Nährwert	Entwicklungsstillstand 13
					Verminderte Lebensmittelpräferenz13
					Verlängert die Lebensdauer des NGM31
Antibiotika	Antibiotika (Kanamycin, Carbenicillin, etc.)	Ja		Ja	Verzögert Wachstum und Entwicklung15
					Verlängert die Lebensdauer in flüssigen Medien19
					Verlängert die Lebensdauer des NGM15
PFA	0,5 % Paraformaldehyd	Ja		Ja	Verkleinerung der kleinen Brut16
					Geringe Erhöhung der Entwicklungszeit16
					Verminderte Lebensmittelpräferenz16

Tabelle 1. Vergleiche von Methoden zur Abtötung von OP50. UV-Abtötung, Hitzeabtötung, Antibiotikabehandlung und PFA-Behandlung haben unterschiedliche Auswirkungen auf den Ernährungszustand der Bakterien und die Gesundheit von Würmern, die mit behandelten Bakterien gefüttert werden. Diese Methoden zur replikativen Inaktivierung von E. coli unterscheiden sich auch in ihren benötigten Materialien und ihrer Skalierbarkeit.

Protokoll

1. Bakterien-Inokulation

1. Bereiten Sie Luria-Brühe (LB) zu, indem Sie 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid (NaCl) in 950 ml destilliertem Wasser auflösen.
2. Stellen Sie den pH-Wert des LB auf 7,0 ein, indem Sie 5 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzufügen. Dies sollte nur etwa 0,2 ml NaOH erfordern.
3. Autoklavieren Sie das pH-angepasste LB-Medium in einem Flüssigkeitszyklus für 45 Minuten bei 15 psi. Lassen Sie die Lösung abkühlen und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
4. Eine einzelne Bakterienkolonie wird in 100 ml LB in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in einem 37 °C heißen Schüttel-Inkubator.
5. Abhängig von der Gesundheit der Bakterienkolonie, der Größe des Kolbens und der Geschwindigkeit, auf die der Schüttler eingestellt ist, kann die Zeit, die das Wachstum der Bakterien benötigt, variieren. Nach ~14 h ist die optische Dichte (OD) der Bakterien bei 600 nm (OD₆₀₀) zu überprüfen.
6. Entfernen Sie die Bakterien aus dem Schüttler, wenn der OD₆₀₀ 3,0 beträgt (1 x 10⁹ koloniebildende Einheiten (KBE)/ml). Wenn der Außendurchmesser₆₀₀ kleiner als 3,0 ist, wird der Kolben wieder in den Schüttelinkubator gegeben, bis der gewünschte Außendurchmesser erreicht ist.
7. Aliquotieren Sie die Bakterien in konische 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 °C oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.

2. Arbeiten mit Paraformaldehyd

HINWEIS: Die verwendete Konzentration von Paraformaldehyd (PFA) und die Dauer der Exposition können je nach Klima, Standort und Art der zu behandelnden Bakterien etwas variieren. Ein guter Ausgangspunkt für OP50 ist die Exposition gegenüber 0,5 % PFA für 1 h, während 0,25 % PFA für 1 h für HT115 ausreichend sein können.

1. Bereiten Sie 32 % PFA-Brühe vor oder verwenden Sie eine im Handel erhältliche 32 %ige PFA-Lösung. Verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA), wenn Sie mit PFA arbeiten. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz.
2. Fügen Sie PFA in einen chemischen Abzug mit ausreichender Belüftung ein. Entsorgen Sie PFA-haltige Waschmittel und Spitzen in geeigneten Behältern für chemische Gefahren im Abzug.

3. Bakterielle Behandlung mit Paraformaldehyd

1. Sobald die Bakterien einen OD₆₀₀ von 3,0 erreicht haben, verwenden Sie eine serologische Pipette, um 50 ml in einen neuen 250-ml-Erlenmeyerkolben zu überführen. Bewahren Sie den Rest für eine Live-Kontrolle, eine simulierte Kontrolle (siehe Schritt 4) oder für die Behandlung mit PFA nach Bedarf auf.
2. Vermeiden Sie es, von einem Kolben in einen anderen zu gießen, und achten Sie darauf, die Seiten des neuen Kolbens nicht mit Bakterien zu bespritzen. Kolonien an der Seite des Kolbens können eine niedrigere Dosis von PFA erhalten.
3. In der Chemikalienhaube 781 μl 32 % PFA auf 50 ml Bakterien geben, um die Endkonzentration auf 0,5 % zu bringen. Entsorgen Sie die verwendete Spitze in einem Behälter für feste chemische Abfälle.
4. Decken Sie den Kolben mit Folie ab und stellen Sie ihn für 1 h in den 37 °C heißen Schüttelinkubator. Nach 1 h nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und fahren Sie mit Schritt 5 fort.

4. Simulierte Kontrolle

1. Sobald die Bakterien einen OD₆₀₀ von 3,0 erreicht haben, verwenden Sie eine serologische Pipette, um 50 ml der Bakterien in ein konisches 50-ml-Röhrchen zu überführen.
2. Fahren Sie mit Schritt 5.3 fort, um die Waschschritte ähnlich wie bei der PFA-behandelten Gruppe abzuschließen.

5. Waschen der Bakterien, um PFA-Reste zu entfernen

1. In der Chemikalienhaube werden die behandelten Bakterien mit einer serologischen Pipette aus dem Erlenmeyerkolben in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt. Die Verwendung einer serologischen Pipette anstelle des Ausgießens der Bakterien verhindert eine Kontamination durch Bakterienkolonien am Rand des Kolbens, die möglicherweise eine direkte Behandlung mit PFA vermieden haben.
2. Behandelte Bakterien bei ca. 3000 x g für 20 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn in einem Behälter für chemische Gefahren aus flüssigen Abfällen in der Chemikalienhaube entsorgen.
3. Fügen Sie 25 ml LB und Vortex hinzu, um das Bakterienpellet zu resuspendieren (Wenn Sie das Röhrchen vollständig füllen, wird es schwieriger, das Pellet zu resuspendieren). Zentrifugation und Pellet-Resuspension 4x wiederholen.
4. Resuspendieren Sie das Pellet in Volumina, die für verschiedene Assays optimal sind. Für Lifelife-Assays werden 60-mm-Platten mit 200 μl Bakterien in 10 ml LB resuspendiert. Die Resuspendierung der Bakterien in 10 ml LB führt zu einer 5-fachen Konzentration gegenüber der ursprünglichen 50-ml-Kultur.
5. Lagern Sie die Bakterien bei 4 °C.

6. Qualitätskontrolle des Bakterienwachstums

1. Nach dem abschließenden Waschen und Resuspension wird eine LB-Platte (mit einer sterilen Pipettenspitze) mit den vorbereiteten Bakterien bestrichen. Es empfiehlt sich, das zum Waschen und Resuspendieren verwendete LB ebenfalls auf eine separate Platte zu streichen, um sicherzustellen, dass das verwendete LB nicht kontaminiert wurde.
2. Stellen Sie die Platten über Nacht in einen 37 °C warmen Inkubator. Prüfen Sie, ob es Wachstum gibt. Die Bakterien gelten als replikativ tot, wenn auf der LB-Platte keine Kolonien wachsen.

7. Qualitätskontrolle des bakteriellen Stoffwechsels mittels Respirometer

1. Vergewissern Sie sich nach dem abschließenden Waschen und der Resuspension aus Schritt 5.4, dass die Bakterien metabolisch abgestorben sind, indem Sie die verfügbaren Instrumente wie Respirometer^19,20 verwenden und die basale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR⁾ messen.
2. M9-Lösung vorbereiten: 3 g einbasisches Kaliumphosphat (KH₂PO 4), 6 g dibasisches Natriumphosphat (Na2_HPO4) und 5 g Natriumchlorid (NaCl) in 950 ml destilliertem Wasser lösen. Autoklavieren Sie in einem Flüssigkeitszyklus 45 Minuten lang bei 15 psi und lassen Sie die Lösung dann auf Raumtemperatur abkühlen. 1 ml 1 M Magnesiumsulfat (MgSO₄) zugeben und bei Raumtemperatur lagern.
3. Befeuchten Sie die Respirometerkartusche: Geben Sie 200 μl Kalibrant in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Legen Sie die Kartusche in die 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht in einem 37 °C warmen Inkubator.
4. Assay-Kalibrierung: Legen Sie am nächsten Tag die hydratisierte Kartusche in das Gerät und beginnen Sie mit der Kalibrierung.
5. Aufbau der Assay-Testplatte: Mit einer neuen 96-Well-Platte 160 μl M9 und 40 μl der vorbereiteten Bakterien (1 x 10⁹ KBE/ml) in die Testwells geben. Geben Sie 200 μl M9 in die 4 Eckvertiefungen, um sie als Blindvertiefungen zu verwenden. Fügen Sie 160 μl M9 und 40 μl LB hinzu, die zum Waschen und Resuspendieren verwendet werden, um sie als Negativkontrollen zu verwenden. Geben Sie 200 μl M9 in die restlichen Vertiefungen, die nicht verwendet werden.
6. Führen Sie den Assay durch: Sobald die Kartuschenkalibrierung abgeschlossen ist, setzen Sie die Assay-Platte aus Schritt 7.5 zur Analyse in das Gerät ein. Die Einstellungen umfassen Schritte zum Mischen, Warten, Messen und Loopen. Die Ergebnisse werden als Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) angezeigt. Die Bakterien sind metabolisch tot und einsatzbereit, wenn die OCR Null ist.

Abbildung 1. Arbeitsablauf für die Paraformaldehyd-Behandlung. Eine einzelne Kolonie von E. coli OP50-Bakterien wird über Nacht gezüchtet. PFA wird zu einer Endkonzentration von 0,5 % zugegeben und die PFA-behandelte Kultur wird 1 h bei 37 °C geschüttelt. Zum Schluss wird das PFA entfernt, indem die Kultur mit frischem LB 5x gewaschen wird. Um zu bestätigen, dass die behandelten Bakterien replizierend inaktiv sind, streifen Sie eine LB-Platte der behandelten Bakterien aus und wachsen Sie über Nacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Ein detaillierter Workflow des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Es wurde eine Hochdurchsatzmethode entwickelt und optimiert, um die bakterielle Replikation (Abbildung 2A) und den Stoffwechsel (Abbildung 2B) für Stoffwechsel- und Wirkstoffstudien in der C. elegans-Forschung unter Verwendung von Paraformaldehyd¹⁶ konsistent zu inaktivieren. Ziel war es, die niedrigste PFA-Konzentration und d...

Diskussion

Vorteile der PFA-Abtötung im Vergleich zu anderen bakterienabtötenden Methoden
Die PFA-Behandlung ist eine Hochdurchsatzmethode, um den bakteriellen Stoffwechsel zu verhindern und gleichzeitig eine nahrhafte Nahrungsquelle für C. elegans zu erhalten. Die Abtötung von Bakterien durch PFA-Behandlung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden. Im Gegensatz zur UV-Behandlung, bei der jede Platte auf eine erfolgreiche Abtötung getestet werden muss, kann eine einzelne Platte aus einer Ch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Foil	Staples	2549291
Bunsen burner	VWR	470121-700
Cell Density Meter	Denville	80-3000-45
Centrifuge	Eppendorg	5430
Chemical fume hood	Labcono	975050411384RG
Conincal tubes (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Erlenmyer flasks	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Inoculation loop	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Liquid waste collection bottle	Thomas Scientific	1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldehyde (32%)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm)	Fisher	FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate	Agilent	101085-004
Serological pipettes (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
Shaker incubator	Thermo	11 676 083
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Solid waste collection bucket	M&M Industries	5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Weighing balance	C Goldenwall	HZ10K6B
Yeast Extract	Genesee Scientific	20-255