Methodik zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien für die Caenorhabditis elegans-Forschung

Zusammenfassung

Die Nahrungsquelle für Caenorhabditis elegans im Labor sind lebende Escherichia coli. Da Bakterien metabolisch aktiv sind, stellen sie eine Störvariable in metabolischen und medikamentösen Studien an C. elegans dar. Ein detailliertes Protokoll zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien mit Paraformaldehyd ist hier beschrieben.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans ist ein gängiger Modellorganismus für die Erforschung von Genetik, Entwicklung, Alterung, Stoffwechsel und Verhalten. Da C. elegans sich von lebenden Bakterien ernährt, kann die Stoffwechselaktivität ihrer Nahrungsquelle Experimente verwirren, die nach den direkten Auswirkungen verschiedener Eingriffe auf den Wurm suchen. Um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels zu vermeiden, haben die Forscher von C. elegans mehrere Methoden zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien eingesetzt, darunter ultraviolette (UV)-Bestrahlung, Hitzeabtötung und Antibiotika. Die UV-Behandlung hat einen relativ geringen Durchsatz und kann nicht in der Flüssigkultur eingesetzt werden, da jede Platte auf eine erfolgreiche bakterielle Abtötung untersucht werden muss. Eine zweite Behandlungsmethode, die Hitzeabtötung, wirkt sich negativ auf die Textur und die Nährstoffqualität der Bakterien aus, was zum Entwicklungsstillstand von C. elegans führt. Schließlich kann die Behandlung mit Antibiotika die Physiologie von C. elegans direkt verändern und das Bakterienwachstum verhindern. Dieses Manuskript beschreibt eine alternative Methode zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien mittels Paraformaldehyd (PFA). Bei der PFA-Behandlung werden Proteine in Bakterienzellen vernetzt, um die Stoffwechselaktivität zu verhindern und gleichzeitig die Zellstruktur und den Nährstoffgehalt zu erhalten. Diese Methode hat einen hohen Durchsatz und kann in Flüssigkulturen oder festen Platten verwendet werden, da das Testen einer Platte mit PFA-behandelten Bakterien auf Wachstum die gesamte Charge validiert. Die metabolische Inaktivierung durch PFA-Behandlung kann verwendet werden, um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels auf Studien zur Arzneimittel- oder Metaboliten-Supplementierung, Stressresistenz, Metabolomik und Verhalten bei C. elegans zu eliminieren.

Einleitung

Caenorhabditis elegans wurde ursprünglich 1965 als Modellorganismus^{vorgeschlagen 1 und} hat sich seitdem in Studien zu Genetik, Entwicklung, Verhalten, Altern und Stoffwechsel 2^{durchgesetzt.} Aufgrund ihrer großen Brutgröße und transparenten Kutikula eignet sich C. elegans besonders gut für das Hochdurchsatz-Screening mit fluoreszierenden Reportern³. Ihr kurzer Lebenszyklus, ihre hermaphroditische Vermehrung und ihre genetische Homologie mit dem Menschen machen C. elegans auch zu einem wertvollen Modellsystem für Studien zur Entwicklung⁴ und zur Alt....

Protokoll

1. Bakterien-Inokulation

1. Bereiten Sie Luria-Brühe (LB) zu, indem Sie 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid (NaCl) in 950 ml destilliertem Wasser auflösen.
2. Stellen Sie den pH-Wert des LB auf 7,0 ein, indem Sie 5 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzufügen. Dies sollte nur etwa 0,2 ml NaOH erfordern.
3. Autoklavieren Sie das pH-angepasste LB-Medium in einem Flüssigkeitszyklus für 45 Minuten bei 15 psi. Lassen Sie die Lösung abkühlen und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
4. Eine einzelne Bakterienkolonie wird in 100 ml LB in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in ei....

Diskussion

Vorteile der PFA-Abtötung im Vergleich zu anderen bakterienabtötenden Methoden
Die PFA-Behandlung ist eine Hochdurchsatzmethode, um den bakteriellen Stoffwechsel zu verhindern und gleichzeitig eine nahrhafte Nahrungsquelle für C. elegans zu erhalten. Die Abtötung von Bakterien durch PFA-Behandlung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden. Im Gegensatz zur UV-Behandlung, bei der jede Platte auf eine erfolgreiche Abtötung getestet werden muss, kann eine einzelne Platte aus einer Ch.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Foil	Staples	2549291
Bunsen burner	VWR	470121-700
Cell Density Meter	Denville	80-3000-45
Centrifuge	Eppendorg	5430
Chemical fume hood	Labcono	975050411384RG
Conincal tubes (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Erlenmyer flasks	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Inoculation loop	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Liquid waste collection bottle	Thomas Scientific	1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldehyde (32%)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm)	Fisher	FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate	Agilent	101085-004
Serological pipettes (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
Shaker incubator	Thermo	11 676 083
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Solid waste collection bucket	M&M Industries	5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Weighing balance	C Goldenwall	HZ10K6B
Yeast Extract	Genesee Scientific	20-255