Un modelo de rata prematura para estudios del dolor

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo conciso para crear un modelo de rata prematura, facilitando la investigación sobre el manejo temprano del dolor posnatal. El método consiste en realizar una cesárea tres días antes del parto previsto, extraer crías de rata prematuras mediante histerectomía e integrarlas con la descendencia biológica de una madre sustituta.

Resumen

Esta investigación profundiza en las consecuencias de la estimulación constante de pinchazos en la descendencia prematura para determinar sus implicaciones a largo plazo para la sensibilidad al dolor. El objetivo principal de este protocolo fue investigar el impacto de los estímulos neonatales de pinchazo en el umbral del dolor en las últimas etapas de la vida utilizando un modelo de rata prematura. Al establecer este modelo, nuestro objetivo es avanzar en la investigación sobre la comprensión y el manejo del dolor posnatal temprano asociado con la prematuridad. Los hallazgos de este estudio indican que, si bien los umbrales basales a los estímulos mecánicos no se vieron afectados, hubo un aumento notable en la hipersensibilidad mecánica después de la inyección completa del adyuvante de Freund (CFA) en ratas adultas. Curiosamente, en comparación con las ratas macho, las ratas hembra demostraron una mayor hipersensibilidad inflamatoria. En particular, el comportamiento materno, el peso de las camadas y la trayectoria de crecimiento de las crías permanecieron inalterados por la estimulación. La manifestación de respuestas nociceptivas alteradas en la edad adulta después de estímulos dolorosos neonatales podría ser indicativa de cambios en el procesamiento sensorial y el funcionamiento de los receptores de glucocorticoides. Sin embargo, se necesita más investigación para comprender los mecanismos subyacentes involucrados y desarrollar intervenciones para las consecuencias de la prematuridad y el dolor neonatal en adultos.

Introducción

Durante el período neonatal, las vías nociceptivas experimentan una maduración estructural y funcional significativa, y la presencia de daño tisular y dolor asociado tiene profundas implicaciones para el desarrollo del procesamiento somatosensorial¹.

La utilización de modelos animales permite la manipulación experimental controlada de animales no humanos, lo que permite una comprensión más profunda de las consecuencias del dolor neonatal en el comportamiento posterior en la vida, al tiempo que mitiga las posibles variables de confusión ^2,3. Un resultado comúnmente observado es la influencia del dolor neonatal en el aumento de la sensibilidad al dolor en la edad adulta ^2,4,5. En la unidad de cuidados intensivos neonatales (UCIN), el dolor neonatal es una fuente de estrés muy prevalente, ya que los recién nacidos prematuros suelen someterse a una mediana de 10 procedimientos invasivos al día⁶. Los neonatos prematuros en la UCIN se encuentran con una serie de factores estresantes, que abarcan el dolor, el contacto materno limitado, los estímulos auditivos y la iluminación excesiva ^7,8,9.

La utilización de modelos animales es esencial para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes involucrados en estos procesos y facilitar nuevos avances en esta área. En particular, el empleo de modelos animales prematuros en los estudios puede contribuir en gran medida a ampliar el cuerpo de conocimientos sobre los recién nacidos prematuros y proporcionar información valiosa sobre las intervenciones de tratamiento del dolor para los recién nacidos prematuros¹⁰.

En la actualidad, existe un número limitado de modelos de roedores que abordan específicamente la prematuridad, y la mayoría de estos estudios investigan principalmente los efectos de la prematuridad en el cerebro¹¹, el desarrollo pulmonar¹², la enterocolitis necrotizante¹³ o los estudios nutricionales inmunitarios¹⁴. Sin embargo, ninguno de estos modelos examina la maduración del sistema del dolor, que es particularmente vulnerable en casos de prematuridad.

El parto prematuro y sus consecuencias para el manejo temprano del dolor postnatal siguen siendo áreas cruciales de estudio. Por lo tanto, el presente trabajo tuvo como objetivo contribuir a la literatura mediante el establecimiento de un modelo de rata pretérmino. Este modelo proporciona información sobre el impacto de los estímulos neonatales en los umbrales de dolor durante las etapas posteriores de la vida, mejorando nuestra comprensión del dolor relacionado con la prematuridad.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales siguieron la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio adoptada por el Comité Ético para la Experimentación Animal de la Universidad Federal de Alfenas (protocolo 32/2016).

1. Animales

1. Obtener ratas adultas macho y hembras nulíparas Wistar (aproximadamente ocho semanas de edad) del Animalario Central de la Universidad Federal de Alfenas.
2. Alojar a las ratas en condiciones controladas de temperatura y humedad en un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 h y alimentarlas con comida y agua ad libitum en las instalaciones de la Facultad de Fisioterapia para animales (Universidad Federal de Alfenas).

2. Comprobar si hay embarazo

1. Durante 1 mes, todas las mañanas entre las 8:00 y las 9:00 a.m., transporte cada jaula de animales a la sala experimental. Para realizar un lavado vaginal, introduzca con cuidado una pipeta de plástico que contenga 10 μL de solución de NaCl al 0,9% en la vagina de la rata. Asegúrese de una inserción poco profunda para evitar una penetración profunda y luego retírese suavemente para recoger las secreciones vaginales.
2. Coloque el fluido vaginal recolectado en portaobjetos de vidrio individuales, asignando un portaobjetos separado a cada jaula de animales.
   1. Obtenga una sola gota de material sin manchar de cada rata con una punta de pipeta limpia. Examine el material bajo un microscopio óptico usando lentes de objetivo de 10x y 40x, sin usar la lente de condensador.
   2. Identificar tres tipos de células distintas en función de sus características: células epiteliales redondas y nucleadas, células cornificadas irregulares sin núcleo y leucocitos pequeños y redondos¹⁵.
3. Exponga al apareamiento a ratas Wistar hembras con queratinización intensa y descamación vaginal, características del ciclo estral e indicativas de una mayor receptividad masculina. Aparea a las ratas colocando 2 hembras y 1 macho por jaula. Determine el día gestacional 0 verificando la presencia de espermatozoides y células de la fase estral en los frotis vaginales.

3. Clasificación y gestión de las madres gestantes y sus crías

1. Deseche tres tipos de madres embarazadas (2 madres cada una) según su etapa gestacional: madres prematuras, a término y madres sustitutas. Permita que las madres embarazadas a término den a luz de forma natural el día 22 de gestación y utilice sus camadas para el grupo a término.
2. El día 19 de gestación, realizar una cesárea a las gestantes pretérmino, es decir, 3 días antes de la fecha prevista de parto. Utilice estas camadas para el grupo de prematuros. Dado que este procedimiento no es propicio para la supervivencia de la madre, confíe las crías prematuras a madres sustitutas, que habían dado a luz de forma natural 2 días antes de la cesárea de las madres pretérmino.
3. Mantenga a los cachorros de la madre sustituta con ella durante unas horas, permitiendo que sus olores se entremezclen con las camadas prematuras. Pasado este período, introducir las camadas de prematuros y retirar las crías originales de la gestante, sacrificándolas posteriormente con altas dosis de inhalación de isoflurano.
   NOTA: Este paso es esencial para asegurar que las madres sustitutas ya hayan estimulado la producción de leche en sus glándulas mamarias, posicionándolas para amamantar eficazmente a las crías prematuras¹⁶.

4. Cirugía de cesárea

1. Anestesiar parcialmente a las madres embarazadas prematuras con isoflurano al 2% y practicarles la eutanasia 3 días antes de la fecha prevista de parto mediante luxación cervical. Después de la eutanasia, extraiga a las crías una por una a través de una histerectomía.
2. Haz un corte de 3 cm en la línea media de la parte inferior del abdomen, seguido de un corte longitudinal de 2 cm. Haga una incisión a lo largo del borde antimesentérico en la porción media de cada trompa uterina a partir de estos cortes.
3. Extraiga suavemente las crías de rata y la placenta mediante histerectomía^17,18. Extraiga las crías una por una de inmediato.

5. Cuidados postoperatorios y preparación de cachorros para adopción

1. Utilice el procedimiento de adopción para evitar que la madre operada exhiba un comportamiento inapropiado debido al procedimiento quirúrgico y al dolor potencial, lo que podría afectar el comportamiento adulto de los cachorros.
2. Limpie las vías respiratorias de las crías de rata con toallas de papel después del nacimiento. Limpie a las crías de rata dándoles un baño para evitar el canibalismo por madres sustitutas. Lavar las crías de rata en agua a 28 °C y secarlas.
3. Retire cualquier rastro de sangre y coloque a los cachorros en placas de Petri bajo iluminación infrarroja calentada, manteniendo una temperatura de aproximadamente 28 ° C hasta que su respiración se vuelva regular.
4. Corta sus cordones umbilicales justo debajo de la placenta y usa algodón empapado en H₂O₂ para detener cualquier sangrado del cordón umbilical. Por último, ofrecerlos a las madres de acogida para que los den en adopción.

6. Interacción de la madre adoptiva y adopción de crías prematuras

1. Aloja a cada madre adoptiva con su camada en jaulas de plástico separadas. Antes de transferirlo, marque cada término cachorro de la mano de acogida. Esta marca es crucial para los análisis posteriores del comportamiento materno. Mantener la integridad de las jaulas de las madres de acogida durante todo el proceso de adopción.
2. Inicialmente, coloque a las crías prematuras fuera del nido. Esta estrategia permite que la madre sustituta reconozca y se familiarice con el olor de los nuevos cachorros en un territorio neutral. Además, seleccione uno o dos de los cachorros de la madre adoptiva y colóquelos fuera del nido junto a los cachorros prematuros. Esta mezcla incita a la madre sustituta a recolectar tanto sus propias crías como las prematuras, promoviendo así la aceptación e integración de las nuevas crías en su nido.
3. Mezclar inicialmente la descendencia adoptiva con la descendencia biológica. Confirmar la adopción efectiva. Retira a los cachorros de la madre adoptiva del nido y sacrifícalos¹⁹.
   NOTA: En este estudio, la viabilidad de las ratas prematuras fue del 100% y no fueron rechazadas por la madre sustituta.

7. Estandarización de camadas

1. Mantener un tamaño de camada de 8 crías por camada en todos los grupos de crías criadas por madres sustitutas, con 4 machos y 4 hembras. Sacrifique las ratas cachorro restantes después de la estandarización.

8. Diseño experimental e implementación del protocolo

NOTA: El objetivo de este protocolo fue obtener crías pretérmino viables para el desarrollo de los siguientes procedimientos experimentales.

1. Utilice un total de 20 madres embarazadas para los procedimientos. Divídelos en dos grupos experimentales, cada uno de los cuales consta de 10 presas.
   1. Estimular a las crías del primer grupo, el grupo PP, con estímulos punzantes desde el PND 2 hasta el PND 15.
   2. Designe al segundo grupo como el grupo CC, que sirve como control, y los cachorros de este grupo no reciben estimulación con pinchazos.
   3. Monitorear diligentemente el comportamiento materno de las madres y el peso de las camadas durante todo este período.

9. Evaluaciones posteriores al destete y pruebas de comportamiento

1. Destetar a las crías en PND 22. Clasifícalos por sexo y alójalos en jaulas con una capacidad máxima de 4 animales cada uno hasta que alcancen aproximadamente las 8 semanas de edad.
2. Posteriormente, someta a estos animales a evaluaciones de sensibilidad a estímulos dolorosos utilizando la prueba electrónica de von Frey. Concéntrese específicamente en el dolor inducido por la inflamación de la CFA.
3. Para mitigar cualquier posible influencia relacionada con la camada, seleccione 1 rata macho y 1 rata hembra de cada camada para cada grupo experimental para someterlo a pruebas de comportamiento durante la edad adulta.
4. Utilice cada animal en un solo experimento para evitar la interferencia de factores hormonales en las respuestas nociceptivas de las ratas hembras descendientes. En concreto, asegúrese de que las pruebas se realizan en las hembras durante la fase de diestro de su ciclo estral.

10. Inducción repetida del dolor neonatal

1. Inducir dolor neonatal de repetición mediante una técnica de pinchazo similar a la descrita en un estudio previo²⁰. Iniciar estímulos diarios de pinchazos para las crías de rata a partir del día postnatal 2 (PND 2) y continuar esta práctica hasta PND 15.
2. Inserte con cuidado una aguja de 22 g a poca profundidad en el área plantar media de la pata trasera derecha.
   1. Asegúrese de que la penetración sea suficiente para estimular sin causar lesiones indebidas. Calibra el calibre para evitar una penetración más profunda, teniendo en cuenta el riesgo de que pase por completo a través de la pata a esta edad.
   2. Si se produce sangrado, deténgalo de inmediato con un hisopo con punta de algodón; Por lo general, esta intervención dura solo unos segundos. Administrar estímulos 4 veces, manteniendo un intervalo de 2 minutos entre cada una, totalizando 8 pinchazos al día.
3. Para minimizar los posibles factores de confusión relacionados con la separación materna y el manejo neonatal, separe a las crías de rata de sus madres durante un máximo de 5 minutos. Aplique la misma duración de separación al grupo de control. Después de cada conjunto de estímulos, devuelva rápidamente las crías de rata a sus madres ^5,21,22.

11. Evaluación de las conductas maternas

1. Para evaluar el comportamiento materno, se evaluó el comportamiento de las madres en ambos grupos experimentales (n = 10 por grupo) desde el PND 2 hasta el PND 15. Realizar la evaluación en dos sesiones: una por la mañana, antes de los estímulos de pinchazo en las crías de rata (entre las 08:00 y las 09:30), y otra por la tarde, después de los estímulos de pinchazo en las crías de rata (entre las 15:00 y las 16:30).
2. Durante estas sesiones, observe, registre y califique diligentemente el comportamiento de cada madre cada 3 minutos durante estas sesiones, lo que lleva a 30 observaciones por período por día. Esto acumula un total de 60 observaciones por madre por día.

12. Registro de comportamientos maternos y no maternos

1. Registre los parámetros de comportamiento materno que abarcan acciones como el acicalamiento o lamido (en el cuerpo o en la región anogenital), la lactancia, el mantenimiento de una espalda arqueada en una postura similar a la de una "manta" acostándose sobre los cachorros, acostándose pasivamente boca arriba o de lado mientras amamantan, participando en la construcción de nidos y el autoaseo materno (incluida la estimulación de los senos a través de la autolimpieza).
2. Documente los parámetros de comportamiento no materno, incluidas acciones como alimentarse, explorar el alojamiento de la jaula, no explorar y la ausencia de autoacicalamiento materno.
3. Presentar los datos como el porcentaje del comportamiento materno total y el comportamiento no materno. Divida el número de observaciones registradas del comportamiento objetivo por el número total de observaciones y multiplique el resultado por 100 ^5,23,24.

13. Evaluación del peso de la camada

1. A lo largo de la fase de estimulación del pinchazo (PND 2-15), controle el peso de las camadas en los grupos PP y CC, cada uno compuesto por 8 camadas.
2. Durante la fase de estimulación del pinchazo (PND 2-15), mantener un control continuo del peso de las camadas en los grupos PP y CC, cada uno de los cuales consta de 8 camadas.

14. Prueba de umbral mecánico

1. En este experimento, administre inyecciones de solución salina o CFA, cada una en un volumen de 100 μL, a ratas (de 8 semanas de edad) de los grupos PP y CC. Posteriormente, colóquelos individualmente en jaulas acrílicas (42 cm × 24 cm × 15 cm) con pisos de rejilla de alambre 15-30 min antes de la prueba para evaluar la hiperalgesia mecánica.
2. En la prueba, induzca un reflejo de flexión de la pata trasera utilizando un transductor de fuerza manual equipado con una punta de polipropileno de 0,5^mm2 (Electronic von Frey).
   1. Aplique gradualmente la punta entre las cinco almohadillas distales de la pata trasera derecha, aumentando la presión hasta que se observe una respuesta.
      NOTA: Cuando se produce la retracción de la pata, el estímulo cesa automáticamente y se documenta su fuerza. La prueba concluye con una clara respuesta de temblor seguida de la retirada de la pata. La administración subcutánea de CFA induce una inflamación prolongada, que alcanza su punto máximo a las 24 h y persiste durante al menos 7 días²⁵.
3. Realizar pruebas en los animales antes y a las 4 h, 7 h, 10 h y 24 h después de la administración de suero fisiológico o CFA⁴. Presentar los resultados en términos de umbral de retirada, medido en gramos (g), y calcularlo promediando tres mediciones.
4. Para evitar la interferencia de posibles factores hormonales en las respuestas nociceptivas entre las crías femeninas, asegúrese de que las pruebas se realicen exclusivamente durante la fase de diestro de su ciclo estral.

15. Análisis de datos

1. Procesar los datos utilizando software de análisis estadístico y presentarlos como media ± Error Estándar de la Media (SEM). Para identificar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos, se aplique un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con medidas repetidas, considerando factores como la evaluación de los parámetros maternos versus no maternos y la evaluación del peso de la camada.
2. En concreto, se analizaron los estímulos PND y pinprick para los parámetros maternos y von Frey: CFA y los estímulos pinprick para la evaluación del peso de la camada. Realizar análisis post hoc utilizando la prueba de Bonferroni cuando sea necesario.

Resultados

En este estudio, no hubo diferencias en el comportamiento materno o no materno entre las madres, independientemente de si sus crías se sometieron a experimentación con pinchazos durante el período neonatal o fueron prematuros o a término (Figura 1). En cuanto al comportamiento materno de madres adoptivas de crías prematuras, el ANOVA de dos factores mostró que hubo un efecto de la PND (día postnatal) pero no hubo efecto de los estímulos de pinchazo n...

Discusión

En esta investigación, observamos que los comportamientos maternos y no maternos de las madres no se vieron afectados por la experimentación con pinchazos neonatales. Esta tendencia se extendió también al comportamiento no materno. Además, el aumento de peso de las camadas prematuras durante el período de estímulo del pinchazo no fue significativamente diferente entre los grupos control y pinchazo. Los análisis del umbral de retirada de las patas revelaron una reducción notable ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl solution	Concare, Brazil
Acrylic cages (42 cm × 24 cm × 15 cm) with wire grid floors	Insight Equipamentos, Brazil
Complete Freund's Adjuvant (CFA)	Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,	Insight Equipamentos, Brazil
H2O2 (hydrogen peroxide)	ACS Cientifica, Brazil
Infrared lighting	Carci, Brazil
Isoflurane (2%)	Cristália, Brazil
Upright microscope	Nikon, Brazil	ECLIPSE Ei	Microscope with 10x and 40x objective lenses