疼痛研究のための早産ラットモデル

要約

ここでは、早産ラットモデルを作成するための簡潔なプロトコルを提示し、出生後早期の疼痛管理に関する研究を促進します。この方法では、出産予定日の3日前に帝王切開を行い、子宮摘出術によって早産ラットの子犬を摘出し、代理母の生物学的子孫と統合します。

要約

この研究では、継続的なピンプリック刺激が早産児に及ぼす影響を掘り下げ、疼痛感受性に対する長期的な影響を確認します。このプロトコルの主な目的は、早産ラットモデルを使用して、新生児のピンプリック刺激が人生の後期の痛みの閾値に与える影響を調査することでした。このモデルを確立することにより、未熟児に関連する産後早期の痛みの理解と管理に関する研究を進めることを目指しています。この研究の結果は、機械的刺激に対するベースラインの閾値は影響を受けなかったが、成体ラットでのフロイントアジュバント(CFA)の完全注射後に機械的過敏症が顕著に増加したことを示しています。興味深いことに、雄ラットと比較して、雌ラットは炎症性過敏症の増加を示しました。特に、母親の行動、同腹児の体重、および子孫の成長軌道は、刺激によって変化しなかった。新生児の痛みを伴う刺激後の成人期における侵害受容反応の変化の発現は、感覚処理とグルココルチコイド受容体の機能の変化を示している可能性があります。.しかし、関与する根本的なメカニズムを理解し、成人の未熟児および新生児の痛みの結果に対する介入を開発するためには、さらなる研究が必要である。

概要

新生児期には、侵害受容経路は構造的および機能的に著しい成熟を遂げ、組織損傷とそれに伴う疼痛の存在は、体性感覚処理の発達に深い影響を及ぼします¹。

動物モデルを利用することで、ヒト以外の動物を実験的に制御して操作することが可能となり、新生児の痛みが後年の行動に及ぼす影響をより深く理解すると同時に、潜在的な交絡変数^{を軽減することができる2,3}。一般的に観察される結果は、新生児の疼痛が成人期の痛み感受性の増加に及ぼす影響です^2,4,5。新生児集中治療室(NICU)では、新生児の痛みが非常に一般的なストレスの原因であり、早産児は通常、1日あたり中央値10回の侵襲的処置を受けています⁶。NICUの未熟児は、痛み、母親との接触の制限、聴覚刺激、過度の照明など、さまざまなストレス要因に遭遇します^7,8,9。

動物モデルの利用は、これらのプロセスに関与する根本的なメカニズムの理解を深め、この分野での新たな進歩を促進するために不可欠です。特に、早産動物モデルを研究に採用することは、未熟児に関する知識体系の拡大に大きく貢献し、早産児の疼痛管理介入に関する貴重な洞察を提供することができます¹⁰。

現在、未熟児を特に扱うげっ歯類モデルは限られており、これらの研究の大部分は主に未熟児が脳¹¹、肺の発達¹²、壊死性腸炎¹³、または免疫栄養研究¹⁴に及ぼす影響を調査しています。しかし、これらのモデルのいずれも、未熟児の場合に特に脆弱である疼痛システムの成熟を調べていません。

早産とそれが産後早期の疼痛管理に及ぼす影響は、依然として重要な研究分野です。したがって、本研究は、早産ラットモデルを確立することにより文献に貢献することを目指しました。このモデルは、新生児のピンプリック刺激が人生の後期の痛みの閾値に与える影響についての洞察を提供し、未熟児関連の痛みについての理解を深めます。

プロトコル

すべての実験手順は、アルフェナス連邦大学の動物実験倫理委員会が採択した実験動物の手入れと使用に関するガイド(プロトコル32/2016)に従っていました。

1. 動物たち

1. アルフェナス連邦大学の中央動物施設から、成体の雄と未経産の雌ラット(約8週齢)を入手します。
2. 12:12 hの光で制御された温度と湿度の条件下でラットを収容します:暗いサイクルで、理学療法動物施設(アルフェナス連邦大学)の学部で 自由に 餌をやります。

2. 妊娠確認

1. 1ヶ月間、毎朝8:00から9:00の間に、各動物ケージを実験室に運びます。膣洗浄を行うには、10μLの0.9%NaCl溶液が入ったプラスチックピペットをラットの膣に慎重に導入します。深い挿入を避けるために浅い挿入を確保し、その後、ゆっくりと抜いて膣分泌物を集めます。
2. 集めた膣液を個々のスライドガラスの上に置き、動物の各ケージに別々のスライドを割り当てます。
   1. 清潔なピペットチップを使用して、各ラットから染色されていない物質を1滴採取します。集光レンズを使用せずに、10倍と40倍の対物レンズを使用して光学顕微鏡で材料を調べます。
   2. その特性に基づいて、3つの異なる細胞タイプを特定します:丸い上皮細胞と有核上皮細胞、核のない不規則な角化細胞、および小さくて丸い白血球¹⁵。
3. 発情周期の特徴であり、雄の受容性の増加を示す激しい角質化と ?? 沈下を伴う雌のWistarラットを交配にさらします。.ケージごとに2匹のメスと1匹のオスを配置して、ラットを交配させます。膣塗抹標本中の精子と発情期細胞の存在を確認して、妊娠0日目を決定します。

3. 妊娠中の母子とその子孫の分類と管理

1. 妊娠した母子(各2母)は、妊娠期に基づいて3種類(早産、正期産、代理母)を処分します。満期の妊娠中の母が妊娠22日目に自然に分娩することを許可し、その同腹仔を満期のグループに使用します。
2. 妊娠19日目に、出産予定日の3日前である早産の母に帝王切開を行います。これらの同腹児を早産児に活用してください。この手順が母親の生存に役立たないことを考えると、早産児を代理母に任せてください。これは、早産母の帝王切開の2日前に自然に出産しました。
3. 代理母の子犬を数時間彼女と一緒に保ち、彼らの香りが早産児と混ざり合うようにします。この期間の後、早産児を導入し、代理母の元の子犬を取り除き、その後、イソフルランを高用量で吸入して犠牲にします。
   注:このステップは、代理母がすでに乳腺での乳生産を刺激し、早産児¹⁶を効果的に授乳するように配置するために不可欠です。

4.帝王切開手術

1. 早産のダムに 2% イソフルランで部分的に麻酔をかけ、出産予定日の 3 日前に子宮頸部脱臼を使用して安楽死させます。安楽死後、子宮摘出術で子孫を1つずつ抽出します。
2. 下腹部の正中線に3cmの切り込みを入れ、続いて縦に2cmの切り込みを入れます。これらの切り傷から各子宮管の中央部分の無腸境界に沿って切開を行います。
3. 子宮摘出術^17,18により、ラットの子犬と胎盤を穏やかに抽出します。すぐに子孫を1つずつ抽出します。

5.術後のケアと養子縁組のための子犬の準備

1. 養子縁組手順を使用して、手術を受けた母親が外科的処置や潜在的な痛みのために不適切な行動を示すのを防ぎ、子犬の大人の行動に影響を与える可能性があります。
2. 出生後、ペーパータオルを使用してラットの子犬の気道をきれいにします。代理母による共食いを防ぐために、ネズミの子犬をお風呂に入れてきれいにします。ラットの子犬を28°Cの水で洗い、乾かします。
3. 血の痕跡を取り除き、子犬を加熱された赤外線照明の下でシャーレに入れ、呼吸が規則的になるまで約28°Cの温度を維持します。
4. 胎盤のすぐ下でへその緒を切り、H₂O₂ に浸した綿を使用して、へその緒からの出血を防ぎます。最後に、養子縁組のためにそれらを里親に提供します。

6. 早産児の養子縁組と母親の交流の里親

1. 各里親は、別々のプラスチックケージにトイレを収容します。移す前に、里親の手から各学期の子犬に印を付けます。このマーキングは、その後の母親の行動分析にとって重要です。養子縁組プロセス全体を通じて、里親のケージの完全性を維持します。
2. 最初に、早産児を巣の外に置きます。この戦略により、代理母は中立的な領域で新しい子犬の香りを認識し、親しむことができます。また、里親自身の子犬を1〜2匹選び、早産児と一緒に巣の外に置きます。この組み合わせにより、代理母は自分の子犬と早産児の両方を集めるように促し、新しい子犬の受け入れと巣への統合を促進します。
3. 最初に養子縁組の子孫と生物学的な子孫を混ぜます。効果的な導入を確認します。里親の子犬を巣から取り出し、犠牲にする¹⁹.
   注:この研究では、早産ラットの生存率は100%であり、代理母によって拒絶されませんでした。

7.同腹児の標準化

1. 代理出産で育てられた子犬のすべてのグループで、同腹仔あたり8匹の子犬(4人の男性と4人の女性)の同腹児数を維持します。標準化後、残りの子ネズミを犠牲にします。

8. 実験デザインとプロトコールの実装

注:このプロトコルの目的は、以下の実験手順の開発のために生存可能な早産児を取得することでした。

1. 手順には、合計20個の妊娠中のダムを利用します。それらを2つの実験グループに分け、それぞれが10個のダムで構成されています。
   1. 最初のグループであるPPグループの子犬を、PND2からPND15までのピン刺し刺激で刺激します。
   2. 2番目のグループをCCグループとして指定し、CCグループをコントロールとして、このグループの子犬はピン刺し刺激を受けないようにします。
   3. この期間中、母性的な母性の行動と同腹児の体重を熱心に監視します。

9.離乳後の評価と行動試験

1. PND 22で子孫を離乳させます。性別で分類し、生後約8週間に達するまで、それぞれ最大4匹のケージに収容します。
2. その後、これらの動物を電子フォンフレイテストを使用して、痛みを伴う刺激に対する感受性の評価にかけます。特にCFAによる炎症誘発性の痛みに焦点を当てます。
3. 同腹仔に関連する潜在的な影響を軽減するために、各実験グループごとに各同腹仔から1匹の雄と1匹の雌ラットを選択し、成体期に行動試験を受けます。
4. 雌の仔ラットの侵害受容反応に対するホルモン因子の干渉を避けるために、各動物を1回の実験で使用します。具体的には、発情周期の発情期に女性に対してテストが実施されることを確認してください。

10. 新生児疼痛誘発の繰り返し

1. 以前の研究²⁰で説明したものと同様のピンプリック技術を使用して、新生児の痛みを繰り返し誘発します。出生後2日目(PND 2)からラットの子犬に毎日のピンプリック刺激を開始し、PND15までこの練習を続けます。
2. 22Gの針を右後足の中央足底部に浅い深さまで慎重に挿入します。
   1. 挿入が過度の怪我を引き起こすことなく刺激するのに十分であることを確認してください。ゲージが深く浸透しないようにキャリブレーションを行い、この年齢でゲージが完全に足を通過するリスクを考慮してください。
   2. 出血が発生した場合は、綿の先端の綿棒を使用してすぐに出血を止めてください。通常、この介入は数秒しか続きません。刺激を4回投与し、それぞれの間に2分の間隔を保ち、1日合計8回の刺し傷を行います。
3. 母親の分離と新生児の取り扱いに関連する潜在的な交絡因子を最小限に抑えるために、ラットの子犬を最大5分間母親から分離します。コントロールグループに同じ分離期間を適用します。刺激の各セットに続いて、ラットの子犬を速やかに彼らのダム^5,21,22に戻します。

11. 母性行動の評価

1. 母体の行動を評価するには、PND 2 から PND 15 までの両方の実験グループ(グループあたりn = 10)のダムの行動を評価します。評価は、午前中のラットの子犬へのピン刺し刺激の前(08:00〜09:30)と、ラットの子犬へのピン刺し刺激後の午後(15:00〜16:30)の2つのセッションで実施します。
2. これらのセッションでは、これらのセッション中に各母親の行動を3分ごとに熱心に観察、記録、採点し、1日1ピリオドあたり30回の観察につながります。これは、母親1人あたり1日あたり合計60回の観察結果に蓄積されます。

12. 母性行動と非母性行動の記録

1. グルーミングや舐める(体または肛門性器領域)、授乳、子犬の上に横たわることによる「毛布」のような姿勢でのアーチ型背中の維持、授乳中に仰向けまたは横向きに横たわる、巣作りに従事する、母親のセルフグルーミング(セルフクリーニングによる乳房の刺激を含む)などの行動を含む母親の行動パラメーターを記録します。
2. 餌をやる、ケージハウジングを探索する、探索しない、母親のセルフグルーミングがないなどの行動を含む、母親以外の行動パラメーターを文書化します。
3. データを、母親の行動と母親以外の行動の合計に対する割合として提示します。記録されたターゲット動作の観測値の数を観測値の合計数で割り、結果に 100 ^5,23,24 を掛けます。

13.同腹児体重評価

1. ピンプリック刺激フェーズ(PND 2-15)全体を通して、それぞれ8つの同腹児を含むPPグループとCCグループの両方で同腹児の重量を監視します。
2. ピンプリック刺激段階(PND 2-15)では、PPグループとCCグループの両方で、それぞれ8リットルで構成される同腹児の重量を継続的にチェックしてください。

14.機械的しきい値テスト

1. この実験では、生理食塩水またはCFAのいずれかを、それぞれ100μLの容量で、PPおよびCCグループのラット(8週齢)に注射します。その後、テストの 15 〜 30 分前に、ワイヤー グリッドの床を備えたアクリル ケージ (42 cm × 24 cm × 15 cm) に個別に配置して、機械的痛覚過敏を評価します。
2. このテストでは、0.5 mm² ポリプロピレンチップ (Electronic von Frey) を装備したハンドヘルド力トランスデューサーを使用して、後肢屈曲反射を誘発します。
   1. 右後足の5つの遠位フットパッドの間に先端を徐々に適用し、反応が観察されるまで圧力を上げます。
      注:足の収縮が発生すると、刺激は自動的に停止し、その強度が記録されます。テストは、明確なひるみ反応とそれに続く足の引き抜きで終了します。CFAの皮下投与は、長期にわたる炎症を誘発し、24時間でピークに達し、少なくとも7日間持続します²⁵。
3. 生理食塩水または^CFA4の投与前および投与後4時間、7時間、10時間、および24時間後に動物で試験を実施します。結果をグラム(g)で測定した引き出ししきい値で提示し、3つの測定値を平均して計算します。
4. 女性の子孫の侵害受容反応における潜在的なホルモン因子の干渉を防ぐために、テストが発情周期の発情期にのみ行われることを確認してください。.

15. データ分析

1. 統計解析ソフトウェアを使用してデータを処理し、平均の平均±標準誤差(SEM)として表示します。グループ間で統計的に有意な差を特定するには、母性パラメータと非母性パラメータの評価、同腹児の体重評価などの要素を考慮して、反復測定を伴う二元配置分散分析(ANOVA)を適用します。
2. 具体的には、母性パラメータのPNDとピンプリック刺激を解析し、同腹児体重評価のためのフォン・フレイ:CFAとピンプリック刺激を解析します。必要に応じて、Bonferroniテストを使用して事後分析を実施します。

結果

この研究では、新生児期にピンプリック実験を受けたか、早産児か正期産児かに関係なく、母親間の母性行動または非母性行動に差はありませんでした(図1)。早産児の養母の母性行動に関して、二元配置ANOVAは、午前8時に観察された母性行動の評価において、PND(出生後日)の影響はあるが、ピンプリック刺激の影響や2つの因子間の相互作用はな...

ディスカッション

この調査では、母親の母性行動と非母性行動が新生児ピンプリック実験の影響を受けないことを観察しました。この傾向は、非母親の行動にも広がりました。さらに、ピンプリック刺激期間中の早産児の体重増加は、対照群とピンプリック群の間で有意差はありませんでした。足の離脱閾値分析では、ピンプリック群とCFA群の雄と雌の両方の子犬が、対照群の子犬と...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl solution	Concare, Brazil
Acrylic cages (42 cm × 24 cm × 15 cm) with wire grid floors	Insight Equipamentos, Brazil
Complete Freund's Adjuvant (CFA)	Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,	Insight Equipamentos, Brazil
H2O2 (hydrogen peroxide)	ACS Cientifica, Brazil
Infrared lighting	Carci, Brazil
Isoflurane (2%)	Cristália, Brazil
Upright microscope	Nikon, Brazil	ECLIPSE Ei	Microscope with 10x and 40x objective lenses