Модель недоношенных крыс для изучения боли

Резюме

В этой статье мы представляем краткий протокол создания модели недоношенных крыс, облегчающий исследования по лечению боли в раннем периоде после рождения. Метод включает в себя проведение кесарева сечения за три дня до ожидаемых родов, извлечение недоношенных крыс с помощью гистерэктомии и их интеграцию с биологическим потомством суррогатной матери.

Аннотация

В этом исследовании подробно изучаются последствия последовательной стимуляции булавочными уколами для недоношенного потомства, чтобы выяснить ее долгосрочные последствия для чувствительности к боли. Основной целью этого протокола было исследование влияния неонатальных стимулов булавочным уколом на болевой порог на более поздних этапах жизни с использованием модели недоношенных крыс. Создавая эту модель, мы стремимся продвинуть исследования по пониманию и лечению ранней постнатальной боли, связанной с недоношенностью. Результаты этого исследования показывают, что, хотя исходные пороги к механическим стимулам остались неизменными, наблюдалось заметное увеличение механической гиперчувствительности после полной инъекции адъюванта Фрейнда (КФА) у взрослых крыс. Интересно, что по сравнению с самцами крыс, самки крыс демонстрировали повышенную гиперчувствительность к воспалительным процессам. Примечательно, что материнское поведение, вес пометов и траектория роста потомства оставались неизменными при стимуляции. Проявление измененных ноцицептивных реакций во взрослом возрасте после неонатальных болевых стимулов может свидетельствовать об изменениях в сенсорной обработке и функционировании глюкокортикоидных рецепторов. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для понимания основных задействованных механизмов и разработки вмешательств для устранения последствий недоношенности и неонатальной боли у взрослых.

Введение

В неонатальном периоде ноцицептивные пути претерпевают значительную структурную и функциональную зрелость, а наличие повреждений тканей и связанной с этим боли имеет глубокие последствия для развития соматосенсорного^{процессинга}.

Использование животных моделей позволяет проводить контролируемые экспериментальные манипуляции с животными, что позволяет глубже понять последствия неонатальной боли для поведения в более позднем возрасте, смягчая при этом потенциальные искажающие переменные ^2,3. Часто наблюдаемым исходом является влияние неонатальной боли на повышенную болевую чувствительность во взрослом возрасте ^2,4,5. В отделении интенсивной терапии новорожденных (ОИТН) неонатальная боль является широко распространенным источником стресса, при этом недоношенные дети обычно подвергаются в среднем 10 инвазивным процедурам в день⁶. Недоношенные новорожденные в отделении интенсивной терапии новорожденных сталкиваются с целым рядом стрессоров, включая боль, ограниченный контакт с матерью, слуховые стимулы и чрезмерное освещение ^7,8,9.

Использование животных моделей имеет важное значение для углубления нашего понимания основных механизмов, участвующих в этих процессах, и содействия новым достижениям в этой области. В частности, использование моделей недоношенных животных в исследованиях может внести значительный вклад в расширение знаний о недоношенных детях и предоставить ценную информацию о вмешательствах по лечению боли у недоношенных новорожденных^.

В настоящее время существует ограниченное число моделей на грызунах, которые специально посвящены недоношенности, причем большинство из этих исследований в первую очередь изучают влияние недоношенности на мозг¹¹, развитие легких¹², некротизирующий энтероколит¹³ или исследования иммунного питания¹⁴. Тем не менее, ни одна из этих моделей не изучает созревание болевой системы, которая особенно уязвима в случаях недоношенности.

Преждевременные роды и их последствия для раннего постнатального лечения боли остаются важнейшими областями исследований. Таким образом, настоящая работа была направлена на то, чтобы внести вклад в литературу путем создания модели недоношенных крыс. Эта модель дает представление о влиянии неонатальных стимулов булавочным уколом на болевой порог на более поздних этапах жизни, улучшая наше понимание боли, связанной с недоношенностью.

протокол

Все экспериментальные процедуры соответствовали Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию, принятому Этическим комитетом по экспериментам на животных Федерального университета Альфенас (протокол 32/2016).

1. Животные

1. Приобретите взрослых самцов и нерожавших самок крыс линии Вистар (в возрасте примерно восьми недель) в Центральном животноводческом центре Федерального университета Альфенаса.
2. Содержание крыс в условиях контролируемой температуры и влажности в 12:12 ч в темное время суток и кормление их кормом и водой в неограниченном количестве в помещениях для животных факультета физиотерапии (Федеральный университет Альфенаса).

2. Проверка на беременность

1. В течение 1 месяца, каждое утро с 8:00 до 9:00 утра, перевозите каждую клетку с животными в экспериментальную комнату. Чтобы выполнить вагинальное промывание, осторожно введите во влагалище крысы пластиковую пипетку, содержащую 10 мкл 0,9% раствора NaCl. Обеспечьте неглубокое введение, чтобы избежать глубокого проникновения, а затем аккуратно извлеките, чтобы собрать вагинальные выделения.
2. Собранную вагинальную жидкость расположите на отдельных стеклянных предметных стеклах, назначив каждой клетке с животными отдельную горку.
   1. Получите по одной капле неокрашенного материала от каждой крысы с помощью чистого наконечника для пипетки. Исследуйте материал под световым микроскопом, используя объективы с 10-кратным и 40-кратным увеличением, не используя линзу конденсора.
   2. Определите три различных типа клеток на основе их характеристик: круглые и ядрообразные эпителиальные клетки, неправильные ороговевшие клетки без ядра, а также маленькие и круглые лейкоциты¹⁵.
3. Подвергать к спариванию самок крыс Вистар с интенсивной кератинизацией и вагинальной десквамацией, характерными для эстрального цикла и свидетельствующими о повышенной восприимчивости самцов. Спаривайте крыс, помещая 2 самок и 1 самца в клетку. Определите 0-й день беременности, проверив наличие сперматозоидов и клеток эстральной фазы в мазках из влагалища.

3. Классификация и управление беременными самками и их потомством

1. Утилизируйте три типа беременных самок (по 2 самки каждая) в зависимости от стадии беременности: недоношенные, доношенные и суррогатные самки. Дайте доношенным сукам родиться естественным путем на 22-й день беременности и используйте их пометы для доношенной группы.
2. На 19-й день беременности проведите кесарево сечение у недоношенных беременных матерей, которое происходит за 3 дня до предполагаемой даты родов. Используйте эти наполнители для группы недоношенных. Учитывая, что эта процедура не способствует выживанию матери, доверьте недоношенных щенков суррогатным матерям, которые родили естественным путем за 2 дня до кесарева сечения недоношенных матерей.
3. Оставьте щенков суррогатной матери с собой на несколько часов, позволяя их запахам смешиваться с пометами недоношенных. По истечении этого срока вводят недоношенным пометы и удаляют первоначальных щенков суррогатной матери, впоследствии жертвуя их высокими дозами ингаляции изофлурана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для того, чтобы убедиться, что суррогатные матери уже стимулировали выработку молока в своих молочных железах, что позволяет им эффективно выхаживать недоношенных щенков^.

4. Кесарево сечение

1. Частично обезболить недоношенных беременных самок 2% изофлураном и усыпить их за 3 дня до предполагаемой даты родов с помощью вывиха шейки матки. После эвтаназии извлекайте потомство одного за другим с помощью гистерэктомии.
2. Сделайте разрез 3 см по средней линии нижней части живота, а затем продольный разрез 2 см. Из этих надрезов сделайте надрез по межжелудочной границе в средней части каждой маточной трубки.
3. Аккуратно извлеките крысят и плаценту с помощью гистерэктомии^17,18. Немедленно извлекайте потомство по одному.

5. Послеоперационный уход и подготовка щенков к усыновлению

1. Используйте процедуру усыновления, чтобы предотвратить неадекватное поведение прооперированной матери из-за хирургической процедуры и потенциальной боли, которая может повлиять на поведение щенков во взрослом возрасте.
2. После рождения очистите дыхательные пути крысят с помощью бумажных полотенец. Очистите крысят, искупав их, чтобы предотвратить каннибализм суррогатных матерей. Вымойте крысят в воде при температуре 28 °C и высушите их.
3. Удалите все следы крови и поместите щенков в чашки Петри под нагретое инфракрасное освещение, поддерживая температуру примерно 28 °C, пока их дыхание не станет регулярным.
4. Разрежьте их пуповину чуть ниже плаценты и используйте вату, смоченную в_H2O₂ , чтобы остановить кровотечение из пуповины. Наконец, предложите их приемным матерям на усыновление.

6. Взаимодействие приемной матери и усыновление недоношенного потомства

1. Разместите каждую приемную маму с пометом в отдельных пластиковых клетках. Перед переводом отметьте каждый термин щенка с приемной руки. Эта маркировка имеет решающее значение для последующего анализа материнского поведения. Поддерживайте целостность клеток приемных матерей на протяжении всего процесса усыновления.
2. Первоначально поместите недоношенных детенышей за пределы гнезда. Эта стратегия позволяет суррогатной матери распознать и ознакомиться с запахом новых щенков на нейтральной территории. Кроме того, выберите одного или двух собственных щенков приемной матери и поместите их за пределы гнезда рядом с недоношенными щенками. Эта смесь побуждает суррогатную мать собирать как своих, так и недоношенных щенков, тем самым способствуя принятию и интеграции новых щенков в свое гнездо.
3. Сначала смешайте приемное потомство с биологическим. Подтвердите эффективное внедрение. Извлеките из гнезда детенышей приемной матери и принесите их в жертву¹⁹.
   Примечание: В этом исследовании жизнеспособность недоношенных крыс составила 100%, и они не были отторгнуты суррогатной матерью.

7. Стандартизация помета

1. Поддерживайте размер помета 8 щенков в помете во всех группах щенков, выращенных суррогатными матерями, с 4 самцами и 4 самками. После стандартизации принесите в жертву оставшихся детенышей крыс.

8. Дизайн эксперимента и реализация протокола

ПРИМЕЧАНИЕ: Целью данного протокола было получение жизнеспособных недоношенных щенков для разработки следующих экспериментальных процедур.

1. Используйте в общей сложности 20 беременных матерей для проведения процедур. Разделите их на две экспериментальные группы, каждая из которых состоит из 10 плотин.
   1. Стимулируйте щенков в первой группе, группе ПП, с помощью стимулов от PND 2 до PND 15.
   2. Обозначьте вторую группу как группу CC, которая служит в качестве контрольной, при этом щенки в этой группе не получают стимуляции булавочным уколом.
   3. Внимательно следите за материнским поведением матерей и весом пометов в течение всего этого периода.

9. Оценка после отлучения от груди и поведенческое тестирование

1. Отлучите потомство от груди на ПНД 22. Отсортируйте их по полу и поместите в клетки вместимостью не более 4 животных каждая, пока они не достигнут возраста примерно 8 недель.
2. После этого подвергните этих животных оценке чувствительности к болевым раздражителям с помощью электронного теста фон Фрея. Сосредоточьтесь конкретно на боли, вызванной воспалением от CFA.
3. Чтобы смягчить любые потенциальные влияния, связанные с пометом, выберите 1 самца и 1 самку крысы из каждого помета для каждой экспериментальной группы, чтобы пройти поведенческое тестирование во взрослом возрасте.
4. Используйте каждое животное в одном эксперименте, чтобы избежать вмешательства гормональных факторов в ноцицептивные реакции самок потомства крыс. В частности, убедитесь, что тесты проводятся на самках во время диэструсной фазы эстрального цикла.

10. Повторная индукция боли у новорожденных

1. Вызвать повторную неонатальную боль с помощью техники булавочного укола, аналогичной описанной в предыдущем исследовании²⁰. Начните ежедневные уколы для щенков крыс, начиная со 2-го дня после рождения (ПНД 2) и продолжайте эту практику до ПНД 15.
2. Осторожно введите иглу 22 G на небольшую глубину в среднеподошвенную область правой задней лапы.
   1. Убедитесь, что проникновения достаточно для стимуляции, не причиняя чрезмерной травмы. Калибруйте манометр, чтобы предотвратить более глубокое проникновение, учитывая риск его полного прохождения через лапу в этом возрасте.
   2. При возникновении кровотечения следует незамедлительно остановить его с помощью тампона с ватным наконечником; Как правило, это вмешательство длится всего несколько секунд. Вводите стимулы 4 раза, сохраняя интервал в 2 минуты между каждым, всего 8 уколов в день.
3. Чтобы свести к минимуму возможные мешающие факторы, связанные с разлучением матери и обращением с новорожденными, отделите крысят от матерей максимум на 5 минут. Примените ту же продолжительность разделения к контрольной группе. Следуя каждому набору стимулов, немедленно возвращайте крысят к их матам ^5,21,22.

11. Оценка материнского поведения

1. Чтобы оценить поведение матерей, оцените поведение самок в обеих экспериментальных группах (n = 10 в группе) от ПНД 2 до ПНД 15. Проводите оценку в два сеанса: один утром, перед булавочным уколом на крысятах (между 08:00 и 09:30), и один во второй половине дня, после булавочного укола на крысятах (между 15:00 и 16:30).
2. Во время этих сеансов усердно наблюдайте, записывайте и оценивайте поведение каждой матери каждые 3 минуты во время этих сеансов, что приводит к 30 наблюдениям за период в день. В общей сложности получается 60 наблюдений на одну мать в день.

12. Учет материнского и нематеринского поведения

1. Запишите параметры материнского поведения, которые включают в себя такие действия, как вылизывание или вылизывание (на теле или в аногенитальной области), кормление, поддержание выгнутой спины в позе, похожей на «одеяло», лежание на спине или боку во время кормления, участие в строительстве гнезд и материнский самоуход (включая стимуляцию груди путем самоочищения).
2. Задокументируйте параметры, не связанные с материнским поведением, включая такие действия, как кормление, исследование клетки, отсутствие исследования и отсутствие материнского ухода за собой.
3. Представьте данные в процентном соотношении от общего материнского поведения и нематеринского поведения. Разделите количество записанных наблюдений за поведением цели на общее количество наблюдений и умножьте результат на 100 ^5,23,24.

13. Оценка веса помета

1. На протяжении всей фазы стимуляции булавочным уколом (PND 2-15) контролируйте вес пометов в группах ПП и СС, каждая из которых состоит из 8 пометов.
2. Во время фазы стимуляции булавочным уколом (PND 2-15) постоянно контролируйте вес пометов в группах ПП и СС, каждая из которых состоит из 8 пометов.

14. Механический пороговый тест

1. В этом эксперименте проводили инъекции физраствора или КФА, каждая в объеме 100 мкл, крысам (в возрасте 8 недель) из групп ПП и КК. После этого по отдельности поместите их в акриловые клетки (42 см × 24 см × 15 см) с проволочной сеткой за 15-30 минут до теста для оценки механической гипералгезии.
2. В тесте вызовите рефлекс сгибания задней лапы с помощью ручного преобразователя силы, оснащенного полипропиленовым наконечником 0,5 мм² (Electronic von Frey).
   1. Постепенно прикладывайте кончик между пятью дистальными подушечками лапы правой задней лапы, увеличивая давление до тех пор, пока не будет замечена реакция.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда происходит втягивание лапы, стимул автоматически прекращается, и его сила документируется. Тест завершается четкой реакцией вздрагивания, за которой следует отдергивание лапы. Подкожное введение КФА вызывает длительное воспаление, достигающее пика в течение 24 ч и сохраняющееся в течение не менее 7 дней²⁵ дней.
3. Проводите испытания на животных до и через 4 ч, 7 ч, 10 ч и 24 ч после введения физиологического раствора или CFA⁴. Представьте результаты в терминах порога отмены, измеряемого в граммах (г), и рассчитайте его путем усреднения трех измерений.
4. Чтобы предотвратить вмешательство потенциальных гормональных факторов в ноцицептивные реакции у потомства женского пола, убедитесь, что тесты проводятся исключительно во время фазы диэструса их эстрального цикла.

15. Анализ данных

1. Обрабатывайте данные с помощью программного обеспечения для статистического анализа и представляйте их в виде среднего ± стандартной погрешности среднего (SEM). Чтобы выявить статистически значимые различия между группами, примените двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями, учитывая такие факторы, как оценка материнских и нематеринских параметров и оценка веса помета.
2. В частности, анализируйте стимулы PND и булавочные уколы для материнских параметров, а также стимулы фон Фрея: CFA и булавочные стимулы для оценки веса помета. При необходимости проведите апостериорный анализ с использованием теста Бонферрони.

Результаты

В этом исследовании не было различий в материнском или нематеринском поведении между матерями, независимо от того, подвергались ли их дети экспериментам с булавочными уколами в неонатальном периоде или были недоношенными или доношенными (Рисунок 1). Ч...

Обсуждение

В этом исследовании мы заметили, что материнское и нематеринское поведение матерей остается неизменным при экспериментах с неонатальными булавочными уколами. Эта тенденция распространялась и на нематеринское поведение. Кроме того, прибавка в весе недоношенных поме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl solution	Concare, Brazil
Acrylic cages (42 cm × 24 cm × 15 cm) with wire grid floors	Insight Equipamentos, Brazil
Complete Freund's Adjuvant (CFA)	Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,	Insight Equipamentos, Brazil
H2O2 (hydrogen peroxide)	ACS Cientifica, Brazil
Infrared lighting	Carci, Brazil
Isoflurane (2%)	Cristália, Brazil
Upright microscope	Nikon, Brazil	ECLIPSE Ei	Microscope with 10x and 40x objective lenses