Ağrı Çalışmaları için Preterm Sıçan Modeli

Özet

Burada, erken postnatal ağrı yönetimi ile ilgili araştırmaları kolaylaştıran bir preterm sıçan modeli oluşturmak için kısa bir protokol sunuyoruz. Yöntem, beklenen doğumdan üç gün önce sezaryen yapılmasını, erken doğmuş sıçan yavrularının histerektomi yoluyla çıkarılmasını ve bunların bir vekil barajın biyolojik yavruları ile entegre edilmesini içerir.

Özet

Bu araştırma, ağrı duyarlılığı üzerindeki uzun vadeli etkilerini belirlemek için preterm yavrular üzerindeki tutarlı iğne batması stimülasyonunun sonuçlarını araştırmaktadır. Bu protokolün birincil amacı, preterm sıçan modeli kullanarak neonatal iğne batması uyaranlarının yaşamın sonraki aşamalarında ağrı eşiği üzerindeki etkisini araştırmaktı. Bu modeli kurarak, prematüre ile ilişkili erken postnatal ağrının anlaşılması ve yönetilmesi konusundaki araştırmaları ilerletmeyi amaçlıyoruz. Bu çalışmanın bulguları, mekanik uyaranlara temel eşiklerin etkilenmeden kalmasına rağmen, yetişkin sıçanlarda tam Freund'un adjuvan (CFA) enjeksiyonunu takiben mekanik aşırı duyarlılıkta kayda değer bir artış olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, erkek sıçanlarla karşılaştırıldığında, dişi sıçanlar yüksek inflamatuar aşırı duyarlılık gösterdi. Özellikle, anne davranışı, yavruların ağırlığı ve yavruların büyüme yörüngesi, stimülasyon ile değişmeden kalmıştır. Yenidoğan ağrılı uyaranlardan sonra yetişkinlikte değişen nosiseptif yanıtların tezahürü, duyusal işlemedeki değişikliklerin ve glukokortikoid reseptörlerinin işleyişinin göstergesi olabilir. Bununla birlikte, altta yatan mekanizmaları anlamak ve yetişkinlerde prematüre ve yenidoğan ağrısının sonuçlarına yönelik müdahaleler geliştirmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Giriş

Yenidoğan döneminde, nosiseptif yollar önemli yapısal ve fonksiyonel olgunlaşmaya uğrar ve doku hasarı ve buna bağlı ağrının varlığı, somatosensoriyel işlemenin gelişimi için derin etkilere sahiptir¹.

Hayvan modellerinin kullanılması, insan olmayan hayvanların kontrollü deneysel manipülasyonuna izin vererek, potansiyel kafa karıştırıcı değişkenleri azaltırken, yenidoğan ağrısının yaşamın ilerleyen dönemlerindeki davranış üzerindeki sonuçlarının daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar ^2,3. Yaygın olarak gözlenen bir sonuç, yenidoğan ağrısının yetişkinlikte artan ağrı duyarlılığı üzerindeki etkisidir ^2,4,5. Yenidoğan yoğun bakım ünitesinde (NICU), yenidoğan ağrısı oldukça yaygın bir stres kaynağıdır ve erken doğmuş bebeklere tipik olarak günde ortalama 10 invaziv prosedür uygulanır⁶. YYBÜ'deki prematüre yenidoğanlar, ağrı, sınırlı maternal temas, işitsel uyaranlar ve aşırı aydınlatmayı kapsayan bir dizi stres faktörüyle karşılaşırlar ^7,8,9.

Hayvan modellerinin kullanılması, bu süreçlerde yer alan temel mekanizmaları anlamamızı ilerletmek ve bu alandaki yeni ilerlemeleri kolaylaştırmak için çok önemlidir. Özellikle, çalışmalarda erken doğmuş hayvan modellerinin kullanılması, prematüre bebekler hakkındaki bilgi birikiminin genişletilmesine büyük ölçüde katkıda bulunabilir ve erken doğmuş yenidoğanlar için ağrı yönetimi müdahaleleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir¹⁰.

Şu anda, prematüriteyi spesifik olarak ele alan sınırlı sayıda kemirgen modeli vardır ve bu çalışmaların çoğu öncelikle prematüritenin beyin¹¹, akciğer gelişimi¹², nekrotizan enterokolit¹³ veya immün beslenme çalışmaları¹⁴ üzerindeki etkilerini araştırmaktadır. Bununla birlikte, bu modellerin hiçbiri, prematüre vakalarında özellikle savunmasız olan ağrı sisteminin olgunlaşmasını incelemez.

Prematüre doğum ve erken postnatal ağrı yönetimi için sonuçları önemli çalışma alanları olmaya devam etmektedir. Bu nedenle bu çalışmada preterm sıçan modeli oluşturularak literatüre katkı sağlanması amaçlanmıştır. Bu model, yenidoğan iğne batması uyaranlarının yaşamın sonraki aşamalarında ağrı eşikleri üzerindeki etkisine dair içgörüler sağlayarak, prematüre ile ilişkili ağrı anlayışımızı geliştirir.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Alfenas Federal Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edilen Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzunu (protokol 32/2016) takip etti.

1. Hayvanlar

1. Alfenas Federal Üniversitesi Merkez Hayvan Tesisi'nden yetişkin erkek ve nullipar Wistar dişi sıçanları (yaklaşık sekiz haftalık) alın.
2. Fareleri kontrollü sıcaklık ve nem koşulları altında 12:12 saat aydınlık: karanlık döngüde barındırın ve onları Fizyoterapi Fakültesi hayvan tesislerinde (Alfenas Federal Üniversitesi) yem ve su ad libitum ile besleyin.

2. Hamileliğin kontrol edilmesi

1. 1 ay boyunca her sabah 08:00-09:00 saatleri arasında her hayvan kafesini deney odasına taşıyın. Vajinal yıkama yapmak için, farenin vajinasına 10 μL% 0.9 NaCl çözeltisi içeren plastik bir pipeti dikkatlice yerleştirin. Derin penetrasyonu önlemek için sığ bir yerleştirme sağlayın ve ardından vajinal salgıları toplamak için yavaşça geri çekin.
2. Toplanan vajinal sıvıyı ayrı cam slaytlara yerleştirin ve her bir hayvan kafesine ayrı bir slayt atayın.
   1. Temiz bir pipet ucu kullanarak her sıçandan tek bir damla lekelenmemiş malzeme elde edin. Kondenser lensi kullanmadan 10x ve 40x objektif lensleri kullanarak malzemeyi ışık mikroskobu altında inceleyin.
   2. Özelliklerine göre üç farklı hücre tipini tanımlayın: yuvarlak ve çekirdekli epitel hücreleri, çekirdeği olmayan düzensiz kornifiye hücreler ve küçük ve yuvarlak lökositler¹⁵.
3. Östrus döngüsünün karakteristiği olan ve erkek alıcılığının arttığını gösteren yoğun keratinizasyon ve vajinal deskuamasyon ile dişi Wistar sıçanlarını çiftleşmeye maruz bırakın. Kafes başına 2 dişi ve 1 erkek yerleştirerek fareleri çiftleştirin. Vajinal smearlerde sperm ve östrus faz hücrelerinin varlığını kontrol ederek gebelik günü 0'ı belirleyin.

3. Gebe barajların ve yavrularının sınıflandırılması ve yönetimi

1. Gebelik evrelerine göre üç tür hamile barajı (her biri 2 baraj) atın: Preterm, Term ve Vekil barajlar. Hamile barajların gebeliğin 22. gününde doğal olarak doğum yapmasına izin verin ve yavrularını terim grubu için kullanın.
2. Gebeliğin 19. gününde, beklenen doğum tarihinden 3 gün önce erken doğmuş hamile barajlarında sezaryen yapın. Bu yavruları preterm grubu için kullanın. Bu prosedürün annenin hayatta kalmasına elverişli olmadığı göz önüne alındığında, erken doğmuş yavruları, erken doğmuş barajların sezaryen bölümünden 2 gün önce doğal olarak doğum yapmış olan taşıyıcı barajlara emanet edin.
3. Vekil barajın yavrularını birkaç saat yanında tutun ve kokularının Preterm yavrularıyla karışmasına izin verin. Bu süreden sonra, Preterm yavruları tanıtın ve vekilin orijinal yavrularını çıkarın, daha sonra onları yüksek dozlarda izofluran soluyarak feda edin.
   NOT: Bu adım, vekil barajların meme bezlerinde süt üretimini zaten uyardığından ve onları erken doğmuş yavruları etkili bir şekilde emzirecek şekilde konumlandırdığından emin olmak için gereklidir¹⁶.

4. Sezaryen ameliyatı

1. Preterm gebe barajları %2 izofluran ile kısmen uyuşturun ve beklenen doğum tarihinden 3 gün önce servikal çıkık kullanarak ötenazi yapın. Ötenaziyi takiben, histerektomi ile yavruları tek tek çıkarın.
2. Alt karnın orta hattında 3 cm'lik bir kesim yapın, ardından 2 cm uzunlamasına bir kesim yapın. Bu kesilerden her uterus tüpünün orta kısmındaki antimesenterik sınır boyunca bir kesi yapın.
3. Sıçan yavrularını ve plasentayı histerektomi^17,18 ile nazikçe çıkarın. Yavruları hemen tek tek çıkarın.

5. Ameliyat sonrası bakım ve yavruların evlat edinilmeye hazırlanması

1. Ameliyat edilen annenin, yavruların yetişkin davranışlarını etkileyebilecek cerrahi prosedür ve potansiyel ağrı nedeniyle uygunsuz davranışlar sergilemesini önlemek için evlat edinme prosedürünü kullanın.
2. Doğumdan sonra kağıt havlu kullanarak sıçan yavrularının hava yollarını temizleyin. Vekil barajlar tarafından yamyamlığı önlemek için sıçan yavrularını banyo yaparak temizleyin. Sıçan yavrularını 28 °C'de suda yıkayın ve kurulayın.
3. Kan izlerini temizleyin ve yavruları, solunumları düzenli hale gelene kadar yaklaşık 28 °C'lik bir sıcaklıkta koruyarak ısıtılmış kızılötesi aydınlatma altında Petri kaplarına yerleştirin.
4. Göbek kordonlarını plasentanın hemen altından kesin ve göbek kordonundan herhangi bir kanamayı durdurmak için H₂O_2'ye batırılmış pamuk kullanın. Son olarak, onları evlatlık olarak koruyucu annelere sunun.

6. Koruyucu anne etkileşimi ve erken doğmuş yavruların evlat edinilmesi

1. Her koruyucu anneyi çöpleriyle birlikte ayrı plastik kafeslerde barındırın. Aktarmadan önce, her bir terim yavrusu koruyucu elden işaretleyin. Bu işaretleme, sonraki anne davranışı analizleri için çok önemlidir. Evlat edinme süreci boyunca koruyucu annelerin kafeslerinin bütünlüğünü koruyun.
2. İlk olarak, Preterm yavrularını yuvanın dışına yerleştirin. Bu strateji, taşıyıcı annenin tarafsız bir bölgede yeni yavruların kokusunu tanımasını ve aşina olmasını sağlar. Ayrıca, koruyucu annenin kendi yavrularından bir veya ikisini seçin ve onları erken doğmuş yavruların yanına yuvanın dışına yerleştirin. Bu karışım, taşıyıcı anneyi hem kendi hem de erken doğmuş yavruları toplamaya teşvik eder, böylece yeni yavruların yuvasına kabulünü ve entegrasyonunu teşvik eder.
3. Evlat edinen yavruları başlangıçta biyolojik yavrularla karıştırın. Etkili benimsemeyi onaylayın. Koruyucu annenin yavrularını yuvadan çıkarın ve kurban edin¹⁹.
   NOT: Bu çalışmada, preterm sıçanların yaşayabilirliği %100 idi ve vekil baraj tarafından reddedilmedi.

7. Yavru standardizasyonu

1. 4 erkek ve 4 dişi olmak üzere, vekil olarak yetiştirilen tüm yavru gruplarında çöp başına 8 yavru boyutunu koruyun. Standardizasyondan sonra kalan yavru fareleri feda edin.

8. Deney tasarımı ve protokol uygulaması

NOT: Bu protokolün amacı, aşağıdaki deneysel prosedürlerin geliştirilmesi için canlı preterm yavrular elde etmektir.

1. Prosedürler için toplam 20 hamile barajı kullanın. Bunları her biri 10 barajdan oluşan iki deney grubuna ayırın.
   1. İlk grup olan PP grubundaki yavruları PND 2'den PND 15'e kadar iğne ucu uyaranlarıyla uyarın.
   2. İkinci grubu, kontrol görevi gören CC grubu olarak belirleyin ve bu gruptaki yavrular iğne batması uyarımı almıyor.
   3. Bu süre boyunca barajların anne davranışını ve yavruların ağırlığını özenle izleyin.

9. Sütten kesme sonrası değerlendirmeler ve davranışsal testler

1. Yavruları PND 22'de sütten kesin. Onları cinsiyetlerine göre sıralayın ve yaklaşık 8 haftalık olana kadar her biri maksimum 4 hayvan kapasiteli kafeslerde barındırın.
2. Daha sonra, bu hayvanları elektronik von Frey testini kullanarak ağrılı uyaranlara duyarlılık değerlendirmelerine tabi tutun. Özellikle CFA'dan kaynaklanan iltihaplanmaya bağlı ağrıya odaklanın.
3. Çöple ilgili olası etkileri azaltmak için, yetişkinlik döneminde davranış testinden geçmek üzere her deney grubu için her çöpten 1 erkek ve 1 dişi sıçan seçin.
4. Dişi yavru sıçanların nosiseptif tepkilerinde hormonal faktör girişimini önlemek için her hayvanı tek bir deneyde kullanın. Özellikle, kızgınlık döngülerinin diestrus aşaması sırasında dişiler üzerinde testlerin yapıldığından emin olun.

10. Tekrarlanan yenidoğan ağrısı indüksiyonu

1. Önceki bir çalışmada tarif edilene benzer bir iğne delme tekniği kullanarak tekrarlanan yenidoğan ağrısını indükleyin²⁰. Doğum sonrası 2. günden (PND 2) başlayarak sıçan yavruları için günlük iğne delme uyaranlarını başlatın ve bu uygulamaya PND 15'e kadar devam edin.
2. Sağ arka pençenin orta plantar bölgesine sığ bir derinliğe 22 G'lik bir iğneyi dikkatlice sokun.
   1. Penetrasyonun, gereksiz yaralanmaya neden olmadan uyarmak için yeterli olduğundan emin olun. Bu yaşta tamamen pençeden geçme riskini göz önünde bulundurarak, daha derin penetrasyonu önlemek için göstergeyi kalibre edin.
   2. Kanama meydana gelirse, pamuk uçlu bir bez kullanarak derhal durdurun; Tipik olarak, bu müdahale sadece birkaç saniye sürer. Uyaranları 4 kez uygulayın, her biri arasında 2 dakikalık bir boşluk bırakın ve günde toplam 8 iğne yapın.
3. Annenin ayrılması ve yenidoğan kullanımı ile ilgili olası kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirmek için, sıçan yavrularını barajlarından en fazla 5 dakika ayırın. Kontrol grubuna aynı ayırma süresini uygulayın. Her bir uyaran setinin ardından, sıçan yavrularını derhal ^5,21,22 numaralı barajlarına geri getirin.

11. Anne davranışlarının değerlendirilmesi

1. Anne davranışını değerlendirmek için, PND 2'den PND 15'e kadar her iki deney grubundaki (grup başına n = 10) barajların davranışını değerlendirin. Değerlendirmeyi iki oturumda gerçekleştirin: biri sabah, sıçan yavruları üzerindeki iğne delme uyaranlarından önce (08:00 ile 09:30 arasında) ve diğeri öğleden sonra, sıçan yavruları üzerindeki iğne delme uyaranlarından sonra (15:00 ile 16:30 arasında).
2. Bu seanslar sırasında, her annenin davranışını her 3 dakikada bir özenle gözlemleyin, kaydedin ve puanlayın, bu da günde adet başına 30 gözleme yol açar. Bu, anne başına günde toplam 60 gözlem anlamına gelir.

12. Anne ve anne dışı davranışların kaydedilmesi

1. Tımar etme veya yalama (vücutta veya anogenital bölgede), emzirme, yavruların üzerine yatarak "battaniye" benzeri bir duruşta kemerli bir sırtı koruma, emzirirken pasif olarak sırt üstü veya yan yatma, yuva inşa etme ve annenin kendi kendini tımar etme (kendi kendini temizleme yoluyla göğüslerin uyarılması dahil) gibi eylemleri kapsayan anne davranış parametrelerini kaydedin.
2. Besleme, kafes yuvasını keşfetme, keşfetmeme ve annenin kendi kendini tımar etmemesi gibi eylemler dahil olmak üzere anne olmayan davranış parametrelerini belgeleyin.
3. Verileri, toplam anne davranışının ve anne olmayan davranışın yüzdesi olarak sunun. Kaydedilen hedef davranış gözlemlerinin sayısını toplam gözlem sayısına bölün ve sonucu 100 ile çarpın^{: 5,23,24}.

13. Çöp ağırlığı değerlendirmesi

1. İğne batması stimülasyon fazı (PND 2-15) boyunca, her biri 8 litre içeren hem PP hem de CC gruplarındaki yavruların ağırlığını izleyin.
2. İğne batması stimülasyon aşaması (PND 2-15) sırasında, her biri 8 litreden oluşan hem PP hem de CC gruplarındaki yavruların ağırlığını sürekli olarak kontrol edin.

14. Mekanik eşik testi

1. Bu deneyde, PP ve CC gruplarından sıçanlara (8 haftalık) her biri 100 μL'lik bir hacimde salin veya CFA enjeksiyonları uygulayın. Daha sonra, mekanik hiperaljeziyi değerlendirmek için testten 15-30 dakika önce tel ızgara zeminli akrilik kafeslere (42 cm × 24 cm × 15 cm) ayrı ayrı yerleştirin.
2. Testte, 0,5 mm² polipropilen uç (Elektronik von Frey) ile donatılmış elde tutulan bir kuvvet dönüştürücü kullanarak bir arka pençe fleksiyon refleksi indükleyin.
   1. Ucu yavaş yavaş sağ arka pençenin beş distal ayak pedi arasına uygulayın ve bir yanıt gözlenene kadar basıncı artırın.
      NOT: Pençe geri çekilmesi meydana geldiğinde, uyaran otomatik olarak durur ve gücü belgelenir. Test, net bir irkilme tepkisi ve ardından pençenin geri çekilmesiyle sona erer. CFA'nın deri altı uygulaması, 24 saatte zirve yapan ve en az 7 gün²⁵ devam eden uzun süreli inflamasyona neden olur.
3. Salin veya CFA⁴ uygulamasından önce ve 4 saat, 7 saat, 10 saat ve 24 saat sonra hayvanlar üzerinde testler yapın. Sonuçları gram (g) cinsinden ölçülen geri çekilme eşiği cinsinden sunun ve üç ölçümün ortalamasını alarak hesaplayın.
4. Dişi yavrular arasında nosiseptif tepkilerde potansiyel hormonal faktörlerin girişimini önlemek için, testlerin yalnızca kızgınlık döngüsünün diestrus aşamasında yapıldığından emin olun.

15. Veri analizi

1. Verileri istatistiksel analiz yazılımı kullanarak işleyin ve ortalama ± Standart Ortalamanın Hatası (SEM) olarak sunun. Gruplar arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları belirlemek için, anne ve anne olmayan parametrelerin değerlendirilmesi ve altlık ağırlığı değerlendirmesi gibi faktörleri göz önünde bulundurarak, tekrarlanan ölçümlerle iki yönlü bir varyans analizi (ANOVA) uygulayın.
2. Spesifik olarak, maternal parametreler için PND ve iğne ucu uyaranlarını ve altlık ağırlığı değerlendirmesi için von Frey: CFA ve iğne ucu uyaranlarını analiz edin. Gerektiğinde Bonferroni testini kullanarak post hoc analiz yapın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, yavrularının yenidoğan döneminde iğne batması deneyi görüp görmediğine veya preterm veya term olup olmadığına bakılmaksızın, anneler arasında anne veya anne dışı davranışlarda fark yoktu (Şekil 1). Preterm yavruların evlat edinen annelerinin anne davranışları ile ilgili olarak, iki yönlü ANOVA, PND'nin (doğum sonrası gün) bir etkisi olduğunu, ancak iğne batması uyaranlarının veya iki faktör arasındaki h...

Tartışmalar

Bu çalışmada, annelerin anne ve anne dışı davranışlarının neonatal iğne batması deneyiminden etkilenmediğini gözlemledik. Bu eğilim anne dışı davranışlara da yayıldı. Ayrıca, pinprick uyaran periyodu sırasında preterm yavruların kilo alımı, kontrol ve pinprick grupları arasında önemli ölçüde farklı değildi. Pençe çekme eşiği analizleri, pinprick ve CFA gruplarından hem erkek hem de dişi yavrularda kontrol gruplarına kıyasla kayda değer bir aza...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl solution	Concare, Brazil
Acrylic cages (42 cm × 24 cm × 15 cm) with wire grid floors	Insight Equipamentos, Brazil
Complete Freund's Adjuvant (CFA)	Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,	Insight Equipamentos, Brazil
H2O2 (hydrogen peroxide)	ACS Cientifica, Brazil
Infrared lighting	Carci, Brazil
Isoflurane (2%)	Cristália, Brazil
Upright microscope	Nikon, Brazil	ECLIPSE Ei	Microscope with 10x and 40x objective lenses