Un modèle de rat prématuré pour les études sur la douleur

Résumé

Ici, nous présentons un protocole concis pour la création d’un modèle de rat prématuré, facilitant la recherche sur la gestion précoce de la douleur postnatale. La méthode consiste à réaliser une césarienne trois jours avant la naissance prévue, à extraire des petits rats prématurés par hystérectomie et à les intégrer à la progéniture biologique d’une mère porteuse.

Résumé

Cette recherche se penche sur les conséquences d’une stimulation constante par piqûre d’épingle sur la progéniture prématurée afin de déterminer ses implications à long terme pour la sensibilité à la douleur. L’objectif principal de ce protocole était d’étudier l’impact des stimuli néonatals sur le seuil de douleur dans les derniers stades de la vie à l’aide d’un modèle de rat prématuré. En établissant ce modèle, nous visons à faire progresser la recherche sur la compréhension et la prise en charge de la douleur postnatale précoce associée à la prématurité. Les résultats de cette étude indiquent que même si les seuils de base pour les stimuli mécaniques n’ont pas été affectés, il y a eu une augmentation notable de l’hypersensibilité mécanique après l’injection complète de l’adjuvant de Freund (CFA) chez les rats adultes. Fait intéressant, par rapport aux rats mâles, les rats femelles ont présenté une hypersensibilité inflammatoire accrue. Notamment, le comportement maternel, le poids des portées et la trajectoire de croissance de la progéniture sont restés inchangés par la stimulation. La manifestation de réponses nociceptives altérées à l’âge adulte après des stimuli douloureux néonatals pourrait être indicative de changements dans le traitement sensoriel et le fonctionnement des récepteurs des glucocorticoïdes. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués et pour développer des interventions sur les conséquences de la prématurité et de la douleur néonatale chez les adultes.

Introduction

Au cours de la période néonatale, les voies nociceptives subissent une maturation structurelle et fonctionnelle importante, et la présence de lésions tissulaires et de douleurs associées a de profondes implications pour le développement du traitement somatosensoriel¹.

L’utilisation de modèles animaux permet la manipulation expérimentale contrôlée d’animaux non humains, ce qui permet une compréhension plus profonde des conséquences de la douleur néonatale sur le comportement plus tard dans la vie tout en atténuant les variables confusionnelles potentielles ^2,3. Un résultat fréquemment observé est l’influence de la douleur néonatale sur une sensibilité accrue à la douleur à l’âge adulte ^2,4,5. Dans l’unité de soins intensifs néonatals (USIN), la douleur néonatale est une source de stress très répandue, les prématurés subissant généralement une médiane de 10 procédures invasives par jour⁶. Les nouveau-nés prématurés de l’unité de soins intensifs néonatals sont confrontés à une gamme de facteurs de stress, notamment la douleur, les contacts maternels limités, les stimuli auditifs et l’éclairage excessif ^7,8,9.

L’utilisation de modèles animaux est essentielle pour faire progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents impliqués dans ces processus et faciliter de nouvelles avancées dans ce domaine. En particulier, l’utilisation de modèles animaux prématurés dans les études peut grandement contribuer à élargir l’ensemble des connaissances sur les nourrissons prématurés et fournir des informations précieuses sur les interventions de gestion de la douleur chez les nouveau-nés prématurés¹⁰.

À l’heure actuelle, il existe un nombre limité de modèles de rongeurs qui traitent spécifiquement de la prématurité, la majorité de ces études portant principalement sur les effets de la prématurité sur le cerveau¹¹, le développement pulmonaire¹², l’entérocolite nécrosante¹³ ou les études nutritionnelles immunitaires¹⁴. Cependant, aucun de ces modèles n’examine la maturation du système douloureux, qui est particulièrement vulnérable en cas de prématurité.

La naissance prématurée et ses conséquences sur la prise en charge précoce de la douleur postnatale restent des domaines d’étude cruciaux. Par conséquent, le présent travail visait à contribuer à la littérature en établissant un modèle de rat prématuré. Ce modèle donne un aperçu de l’impact des stimuli néonatals sur les seuils de douleur au cours des stades ultérieurs de la vie, améliorant ainsi notre compréhension de la douleur liée à la prématurité.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont suivi le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire adopté par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université fédérale d’Alfenas (protocole 32/2016).

1. Animaux

1. Procurez-vous des rats femelles mâles adultes et des rats femelles Wistar nullipares (âgés d’environ huit semaines) à l’animalerie centrale de l’Université fédérale d’Alfenas.
2. Hébergez les rats dans des conditions de température et d’humidité contrôlées dans un cycle lumière-obscurité de 12:12 h et nourrissez-les avec de la nourriture et de l’eau à volonté dans les installations pour animaux de la Faculté de physiothérapie (Université fédérale d’Alfenas).

2. Vérifier la grossesse

1. Pendant 1 mois, tous les matins entre 8h00 et 9h00, transportez chaque cage d’animal jusqu’à la salle d’expérimentation. Pour effectuer un lavage vaginal, introduisez soigneusement une pipette en plastique contenant 10 μL de solution de NaCl à 0,9 % dans le vagin du rat. Assurez-vous d’une insertion peu profonde pour éviter une pénétration profonde, puis retirez-la doucement pour recueillir les sécrétions vaginales.
2. Placez le liquide vaginal recueilli sur des lames de verre individuelles, en attribuant une lame distincte à chaque cage d’animaux.
   1. Obtenez une seule goutte de matériau non taché de chaque rat à l’aide d’une pointe de pipette propre. Examinez le matériau au microscope optique à l’aide d’objectifs 10x et 40x, sans utiliser la lentille du condenseur.
   2. Identifiez trois types de cellules distinctes en fonction de leurs caractéristiques : les cellules épithéliales rondes et nucléées, les cellules cornifiées irrégulières sans noyau et les leucocytes petits et ronds¹⁵.
3. Exposer à l’accouplement des rats femelles Wistar présentant une kératinisation intense et une desquamation vaginale, caractéristiques du cycle œstral et indiquant une réceptivité masculine accrue. Accouplez les rats en plaçant 2 femelles et 1 mâle par cage. Déterminez le jour 0 de la gestation en vérifiant la présence de spermatozoïdes et de cellules de la phase œstrale dans les frottis vaginaux.

3. Classification et gestion des mères gestantes et de leur progéniture

1. Éliminez trois types de mères gestantes (2 mères chacune) en fonction de leur stade gestationnel : les mères prématurées, les mères à terme et les mères porteuses. Laissez les mères gestantes à terme accoucher naturellement au 22e jour de gestation et utilisez leurs portées pour le groupe à terme.
2. Au 19e jour de gestation, effectuez une césarienne sur les mères prématurées, soit 3 jours avant la date prévue de l’accouchement. Utilisez ces portées pour le groupe des prématurés. Étant donné que cette procédure n’est pas propice à la survie de la mère, confiez les petits prématurés à des mères porteuses, qui avaient mis bas naturellement 2 jours avant la césarienne des mères prématurées.
3. Gardez les petits de la mère porteuse avec elle pendant quelques heures, permettant à leurs odeurs de se mêler aux portées de prématurés. Après cette période, introduisez les portées prématurées et retirez les petits d’origine de la mère porteuse, en les sacrifiant ensuite avec l’inhalation à fortes doses d’isoflurane.
   REMARQUE : Cette étape est essentielle pour s’assurer que les mères porteuses ont déjà stimulé la production de lait dans leurs glandes mammaires, ce qui les positionne pour allaiter efficacement les petits prématurés¹⁶.

4. Césarienne

1. Anesthésier partiellement les mères enceintes prématurées avec de l’isoflurane à 2 % et les euthanasier 3 jours avant la date prévue de l’accouchement en utilisant une luxation cervicale. Après l’euthanasie, extrayez la progéniture une par une hystérectomie.
2. Faites une incision de 3 cm sur la ligne médiane du bas-ventre, suivie d’une incision longitudinale de 2 cm. Faites une incision le long de la bordure antitimerontérique dans la partie médiane de chaque trompe utérine à partir de ces coupes.
3. Extraire doucement les petits rats et le placenta par hystérectomie ^17,18. Extrayez immédiatement la progéniture une par une.

5. Soins postopératoires et préparation des chiots à l’adoption

1. Utilisez la procédure d’adoption pour éviter que la mère opérée ne présente un comportement inapproprié en raison de l’intervention chirurgicale et de la douleur potentielle, ce qui pourrait affecter le comportement adulte des chiots.
2. Nettoyez les voies respiratoires des petits rats à l’aide d’essuie-tout après la naissance. Nettoyez les ratons en leur donnant un bain pour éviter le cannibalisme par des mères porteuses. Lavez les petits rats dans de l’eau à 28 °C et séchez-les.
3. Retirez toute trace de sang et placez les petits dans des boîtes de Pétri sous un éclairage infrarouge chauffé, en maintenant une température d’environ 28 °C jusqu’à ce que leur respiration devienne régulière.
4. Coupez leurs cordons ombilicaux juste en dessous du placenta et utilisez du coton imbibé de H₂O₂ pour arrêter tout saignement du cordon ombilical. Enfin, proposez-les aux mères d’accueil pour adoption.

6. Interaction avec la mère nourricière et adoption de la progéniture prématurée

1. Hébergez chaque mère d’accueil avec sa portée dans des cages en plastique séparées. Avant de transférer, marquez chaque terme chiot de la main d’accueil. Ce marquage est crucial pour les analyses ultérieures du comportement maternel. Maintenir l’intégrité des cages des mères d’accueil tout au long du processus d’adoption.
2. Dans un premier temps, placez les bébés prématurés à l’extérieur du nid. Cette stratégie permet à la mère porteuse de reconnaître et de se familiariser avec l’odeur des nouveaux chiots dans un territoire neutre. De plus, sélectionnez un ou deux chiots de la mère d’accueil et placez-les à l’extérieur du nid à côté des chiots prématurés. Ce mélange incite la mère porteuse à recueillir à la fois ses propres petits et ceux des prématurés, favorisant ainsi l’acceptation et l’intégration des nouveaux petits dans son nid.
3. Mélangez initialement la progéniture adoptive avec la progéniture biologique. Confirmer l’adoption effective. Retirez les chiots de la mère adoptive du nid et sacrifiez-les¹⁹.
   REMARQUE : Dans cette étude, la viabilité des rats prématurés était de 100 % et ils n’ont pas été rejetés par la mère porteuse.

7. Standardisation des portées

1. Maintenir une portée de 8 petits par portée dans tous les groupes de chiots élevés par mère porteuse, avec 4 mâles et 4 femelles. Sacrifiez les rats chiots restants après la standardisation.

8. Conception expérimentale et mise en œuvre du protocole

REMARQUE : L’objectif de ce protocole était d’obtenir des petits prématurés viables pour la mise au point des procédures expérimentales suivantes.

1. Utilisez un total de 20 mères gestantes pour les procédures. Divisez-les en deux groupes expérimentaux, chacun composé de 10 barrages.
   1. Stimulez les petits du premier groupe, le groupe PP, avec des stimuli par piqûre d’épingle du JPN 2 au JPN 15.
   2. Désignez le deuxième groupe comme le groupe CC, qui sert de contrôle, les chiots de ce groupe ne recevant pas de stimulation par piqûre d’épingle.
   3. Surveiller assidûment le comportement maternel des mères et le poids des portées tout au long de cette période.

9. Évaluations post-sevrage et tests comportementaux

1. Sevrer la progéniture au JPN 22. Triez-les par sexe et hébergez-les dans des cages d’une capacité maximale de 4 animaux chacune jusqu’à ce qu’ils atteignent l’âge de 8 semaines environ.
2. Ensuite, soumettez ces animaux à des évaluations de sensibilité à des stimuli douloureux à l’aide du test électronique de von Frey. Concentrez-vous spécifiquement sur la douleur induite par l’inflammation due à la CFA.
3. Pour atténuer toute influence potentielle liée à la portée, sélectionnez 1 rat mâle et 1 rat femelle de chaque portée pour chaque groupe expérimental afin de subir des tests comportementaux à l’âge adulte.
4. Utilisez chaque animal dans une seule expérience pour éviter l’interférence des facteurs hormonaux dans les réponses nociceptives des rats femelles. Plus précisément, assurez-vous que des tests sont effectués sur les femelles pendant la phase diestrus de leur cycle œstral.

10. Induction répétée de la douleur néonatale

1. Induire des douleurs néonatales répétées à l’aide d’une technique de piqûre d’épingle similaire à celle décrite dans une étude précédente²⁰. Initier des stimuli quotidiens par piqûre d’épingle pour les petits rats à partir du 2e jour postnatal (JPN 2) et poursuivre cette pratique jusqu’au JPN 15.
2. Insérez soigneusement une aiguille de 22 G à une faible profondeur dans la zone médio-plantaire de la patte arrière droite.
   1. Assurez-vous que la pénétration est juste suffisante pour stimuler sans causer de blessures excessives. Calibrez la jauge pour éviter une pénétration plus profonde, en tenant compte du risque qu’elle passe entièrement par la patte à cet âge.
   2. En cas de saignement, arrêtez-le rapidement à l’aide d’un coton-tige ; En règle générale, cette intervention ne dure que quelques secondes. Administrez des stimuli 4 fois, en maintenant un intervalle de 2 minutes entre chacun, pour un total de 8 piqûres par jour.
3. Pour minimiser les facteurs de confusion potentiels liés à la séparation maternelle et à la manipulation néonatale, séparez les petits rats de leur mère pendant un maximum de 5 minutes. Appliquez la même durée de séparation au groupe témoin. Après chaque série de stimuli, renvoyez rapidement les petits rats à leurs mères ^5,21,22.

11. Évaluation des comportements maternels

1. Pour évaluer le comportement maternel, il faut évaluer le comportement des mères dans les deux groupes expérimentaux (n = 10 par groupe) du JPN 2 au JPN 15. Effectuez l’évaluation en deux séances : l’une le matin, avant les stimuli de piqûre d’épingle sur les petits rats (entre 08h00 et 09h30), et l’autre l’après-midi, après les stimuli de piqûre d’épingle sur les petits rats (entre 15h00 et 16h30).
2. Au cours de ces séances, observez, enregistrez et notez avec diligence le comportement de chaque mère toutes les 3 minutes pendant ces séances, ce qui permet d’obtenir 30 observations par période et par jour. Cela représente un total de 60 observations par mère et par jour.

12. Enregistrement des comportements maternels et non maternels

1. Enregistrez les paramètres du comportement maternel qui englobent des actions telles que le toilettage ou le léchage (sur le corps ou la région anogénitale), l’allaitement, le maintien d’un dos arqué dans une posture de « couverture » en s’allongeant sur les petits, en s’allongeant passivement sur le dos ou sur le côté pendant l’allaitement, en construisant des nids et en s’auto-toilettant (y compris la stimulation des seins par l’autonettoyage).
2. Documentez les paramètres du comportement non maternel, y compris les actions telles que l’alimentation, l’exploration du logement de la cage, la non-exploration et l’absence d’auto-toilettage maternel.
3. Présentez les données en pourcentage du comportement maternel total et du comportement non maternel. Divisez le nombre d’observations de comportement cible enregistrées par le nombre total d’observations et multipliez le résultat par 100 ^5,23,24.

13. Évaluation du poids de la portée

1. Tout au long de la phase de stimulation par piqûre d’épingle (JPN 2-15), surveiller le poids des portées dans les groupes PP et CC, comprenant chacun 8 portées.
2. Pendant la phase de stimulation par piqûre d’épingle (JPN 2-15), contrôlez en permanence le poids des portées dans les groupes PP et CC, chacun composé de 8 portées.

14. Essai de seuil mécanique

1. Dans cette expérience, administrez des injections de solution saline ou de CFA, chacune dans un volume de 100 μL, à des rats (âgés de 8 semaines) des groupes PP et CC. Ensuite, placez-les individuellement dans des cages en acrylique (42 cm × 24 cm × 15 cm) avec des sols grillagés 15 à 30 minutes avant le test pour évaluer l’hyperalgésie mécanique.
2. Dans le test, induire un réflexe de flexion de la patte arrière à l’aide d’un transducteur de force manuel équipé d’une pointe en polypropylène² de 0,5 mm (électronique von Frey).
   1. Appliquez progressivement la pointe entre les cinq coussinets distaux de la patte arrière droite, en augmentant la pression jusqu’à ce qu’une réponse soit observée.
      REMARQUE : Lorsque la rétraction de la patte se produit, le stimulus cesse automatiquement et sa force est documentée. Le test se termine par une réponse claire de tressaillement suivie d’un retrait de la patte. L’administration sous-cutanée de CFA induit une inflammation prolongée, culminant à 24 h et persistant pendant au moins 7 jours²⁵.
3. Effectuer des tests sur les animaux avant et à 4 h, 7 h, 10 h et 24 h après l’administration de solution saline ou de CFA⁴. Présentez les résultats en termes de seuil de retrait, mesuré en grammes (g), et calculez-le en faisant la moyenne de trois mesures.
4. Pour éviter l’interférence de facteurs hormonaux potentiels dans les réponses nociceptives chez la progéniture féminine, assurez-vous que les tests sont effectués exclusivement pendant la phase diestrus de leur cycle œstral.

15. Analyse des données

1. Traitez les données à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique et présentez-les sous forme de moyenne ± d’erreur type de la moyenne (SEM). Pour identifier les différences statistiquement significatives entre les groupes, appliquez une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) avec des mesures répétées, en tenant compte de facteurs tels que l’évaluation des paramètres maternels par rapport aux paramètres non maternels et l’évaluation du poids de la portée.
2. Plus précisément, analyser les stimuli PND et Pinprick pour les paramètres maternels et von Frey : CFA et les stimuli Pinprick pour l’évaluation du poids de la portée. Effectuer une analyse a posteriori à l’aide du test de Bonferroni si nécessaire.

Résultats

Dans cette étude, il n’y avait pas de différences dans le comportement maternel ou non maternel entre les mères, que leur progéniture ait subi une expérience de piqûre d’épingle pendant la période néonatale ou qu’elle soit prématurée ou à terme (Figure 1). En ce qui concerne le comportement maternel des mères adoptives de progéniture prématurée, l’ANOVA à deux facteurs a montré qu’il y avait un effet du JPN (jour postnatal) mais p...

Discussion

Dans cette enquête, nous avons observé que les comportements maternels et non maternels des mères n’étaient pas affectés par l’expérimentation néonatale de piqûres d’épingle. Cette tendance s’est également étendue au comportement non maternel. De plus, la prise de poids des portées prématurées pendant la période de stimulus par piqûre d’épingle n’était pas significativement différente entre les groupes témoin et les groupes par piqûre d’épingle. L’an...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl solution	Concare, Brazil
Acrylic cages (42 cm × 24 cm × 15 cm) with wire grid floors	Insight Equipamentos, Brazil
Complete Freund's Adjuvant (CFA)	Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,	Insight Equipamentos, Brazil
H2O2 (hydrogen peroxide)	ACS Cientifica, Brazil
Infrared lighting	Carci, Brazil
Isoflurane (2%)	Cristália, Brazil
Upright microscope	Nikon, Brazil	ECLIPSE Ei	Microscope with 10x and 40x objective lenses