Ein Frühgeborenen-Rattenmodell für Schmerzstudien

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein prägnantes Protokoll zur Erstellung eines Frühgeborenen-Rattenmodells vor, das die Forschung zur frühen postnatalen Schmerzbehandlung erleichtert. Bei der Methode wird drei Tage vor der erwarteten Geburt ein Kaiserschnitt durchgeführt, Frühgeborene von Ratten mittels Hysterektomie extrahiert und mit den biologischen Nachkommen einer Leihmutter integriert.

Zusammenfassung

Diese Studie befasst sich mit den Folgen einer konsequenten Nadelstichstimulation bei Frühnachkommen, um ihre langfristigen Auswirkungen auf die Schmerzempfindlichkeit zu ermitteln. Das primäre Ziel dieses Protokolls war es, den Einfluss von Nadelstichreizen bei Neugeborenen auf die Schmerzschwelle in späteren Lebensphasen anhand eines Frühgeborenenmodells zu untersuchen. Durch die Etablierung dieses Modells wollen wir die Forschung zum Verständnis und zur Behandlung von frühen postnatalen Schmerzen im Zusammenhang mit Frühgeburten vorantreiben. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Ausgangsschwellen für mechanische Reize zwar unbeeinflusst blieben, es jedoch einen bemerkenswerten Anstieg der mechanischen Überempfindlichkeit nach vollständiger Injektion des Freund-Adjuvans (CFA) bei erwachsenen Ratten gab. Interessanterweise zeigten weibliche Ratten im Vergleich zu männlichen Ratten eine erhöhte entzündliche Überempfindlichkeit. Insbesondere das Verhalten der Mutter, das Gewicht der Würfe und der Wachstumsverlauf der Nachkommen blieben durch die Stimulation unverändert. Die Manifestation veränderter nozizeptiver Reaktionen im Erwachsenenalter nach neonatalen schmerzhaften Reizen könnte auf Veränderungen in der sensorischen Verarbeitung und der Funktion von Glukokortikoidrezeptoren hinweisen. Es bedarf jedoch weiterer Forschung, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen und Interventionen für die Folgen von Frühgeburten und neonatalen Schmerzen bei Erwachsenen zu entwickeln.

Einleitung

Während der Neugeborenenperiode durchlaufen die nozizeptiven Bahnen eine signifikante strukturelle und funktionelle Reifung, und das Vorhandensein von Gewebeschäden und damit verbundenen Schmerzen hat tiefgreifende Auswirkungen auf die Entwicklung der somatosensorischen Verarbeitung¹.

Die Verwendung von Tiermodellen ermöglicht die kontrollierte experimentelle Manipulation nichtmenschlicher Tiere, was ein tieferes Verständnis der Auswirkungen von Schmerzen bei Neugeborenen auf das Verhalten im späteren Leben ermöglicht und gleichzeitig potenzielle Störvariablen abschwächt ^2,3. Ein häufig beobachtetes Ergebnis ist der Einfluss von Schmerzen bei Neugeborenen auf eine erhöhte Schmerzempfindlichkeit im Erwachsenenalter ^2,4,5. Auf der Neugeborenen-Intensivstation (NICU) sind Neugeborenenschmerzen eine weit verbreitete Stressquelle, wobei Frühgeborene in der Regel durchschnittlich 10 invasive Eingriffe pro Tag durchlaufen^{müssen 6}. Frühgeborene auf der neonatologischen Intensivstation sind einer Reihe von Stressfaktoren ausgesetzt, darunter Schmerzen, eingeschränkter mütterlicher Kontakt, auditive Reize und übermäßige Beleuchtung ^7,8,9.

Die Verwendung von Tiermodellen ist unerlässlich, um unser Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, zu verbessern und neue Fortschritte in diesem Bereich zu ermöglichen. Insbesondere der Einsatz von Frühgeborenen-Tiermodellen in Studien kann wesentlich dazu beitragen, das Wissen über Frühgeborene zu erweitern und wertvolle Erkenntnisse über Schmerztherapieinterventionen bei Frühgeborenen zu liefern¹⁰.

Derzeit gibt es eine begrenzte Anzahl von Nagetiermodellen, die sich speziell mit Frühgeburten befassen, wobei die meisten dieser Studien hauptsächlich die Auswirkungen von Frühgeburten auf das Gehirn^{untersuchen 11}, die Lungenentwicklung¹², die nekrotisierende Enterokolitis¹³ oder Immunernährungsstudien¹⁴. Keines dieser Modelle untersucht jedoch die Reifung des Schmerzsystems, das bei Frühgeburten besonders anfällig ist.

Die Frühgeburt und ihre Folgen für die frühe postnatale Schmerztherapie sind nach wie vor wichtige Forschungsgebiete. Daher zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, einen Beitrag zur Literatur zu leisten, indem ein Frühgeborenen-Rattenmodell etabliert wird. Dieses Modell bietet Einblicke in den Einfluss von Nadelstichreizen bei Neugeborenen auf die Schmerzschwellen in späteren Lebensphasen und verbessert unser Verständnis von Frühgeborenenschmerzen.

Protokoll

Alle Versuchsverfahren folgten dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, der von der Ethikkommission für Tierversuche der Bundesuniversität Alfenas verabschiedet wurde (Protokoll 32/2016).

1. Tiere

1. Besorgen Sie sich erwachsene männliche und nullipare weibliche Wistar-Ratten (ca. acht Wochen alt) von der Zentralen Tiereinrichtung der Federal University of Alfenas.
2. Halten Sie die Ratten unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen in einem 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus und füttern Sie sie ad libitum mit Futter und Wasser in den Tiereinrichtungen der Fakultät für Physiotherapie (Bundesuniversität Alfenas).

2. Überprüfung auf Schwangerschaft

1. Transportieren Sie 1 Monat lang jeden Morgen zwischen 8:00 und 9:00 Uhr jeden Tierkäfig in den Versuchsraum. Um eine Vaginalwäsche durchzuführen, führen Sie vorsichtig eine Kunststoffpipette mit 10 μl 0,9%iger NaCl-Lösung in die Vagina der Ratte ein. Achten Sie auf ein flaches Einführen, um ein tiefes Eindringen zu vermeiden, und ziehen Sie sich dann vorsichtig zurück, um Vaginalsekret zu sammeln.
2. Geben Sie die gesammelte Vaginalflüssigkeit auf einzelne Objektträger und weisen Sie jedem Tierkäfig einen separaten Objektträger zu.
   1. Holen Sie sich von jeder Ratte einen einzigen Tropfen ungefärbtes Material mit einer sauberen Pipettenspitze. Untersuchen Sie das Material unter einem Lichtmikroskop mit 10x- und 40x-Objektiven, ohne die Kondensorlinse zu verwenden.
   2. Anhand ihrer Eigenschaften lassen sich drei unterschiedliche Zelltypen unterscheiden: runde und kernhaltige Epithelzellen, unregelmäßige verhornte Zellen ohne Zellkern sowie kleine und runde Leukozyten¹⁵.
3. Weibliche Wistar-Ratten mit intensiver Verhornung und vaginaler Abschuppung, die für den Brunstzyklus charakteristisch sind und auf eine erhöhte Empfänglichkeit der Männchen hinweisen, sind der Paarung auszusetzen. Verpaaren Sie die Ratten, indem Sie 2 Weibchen und 1 Männchen pro Käfig platzieren. Bestimmen Sie den Schwangerschaftstag 0, indem Sie das Vorhandensein von Spermien und Östrusphasenzellen in Vaginalabstrichen überprüfen.

3. Klassifizierung und Management von trächtigen Hündinnen und ihren Nachkommen

1. Entsorgen Sie drei Arten von trächtigen Muttertieren (je 2 Muttertiere), je nach ihrem Gestationsstadium: Frühgeborene, Termingeborene und Ersatzmütter. Lassen Sie die terminträchtigen Hündinnen am 22. Tag der Trächtigkeit auf natürliche Weise entbinden und verwenden Sie ihre Würfe für die Termingruppe.
2. Führen Sie am 19. Tag der Trächtigkeit einen Kaiserschnitt bei den Frühgeborenen durch, der 3 Tage vor dem voraussichtlichen Entbindungstermin liegt. Verwenden Sie diese Würfe für die Frühgeborenengruppe. Da dieses Verfahren für das Überleben der Mutter nicht förderlich ist, vertrauen Sie die Frühgeborenen Ersatzmüttern an, die 2 Tage vor dem Kaiserschnitt der Frühgeborenen auf natürlichem Wege geboren haben.
3. Behalten Sie die Welpen der Leihmutter für ein paar Stunden bei sich, damit sich ihre Gerüche mit den Frühgeborenenwürfen vermischen können. Nach dieser Zeit führen Sie die Frühgeborenen ein und entfernen Sie die ursprünglichen Welpen der Leihmutter, indem Sie sie anschließend mit hochdosierten Isofluran-Inhalationen opfern.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Leihmutter die Milchproduktion in ihren Brustdrüsen bereits stimuliert hat und sie in die Lage versetzt hat, die Frühgeborenen effektiv zu säugen¹⁶.

4. Kaiserschnitt-Operation

1. Betäuben Sie die Frühgeborenen teilweise mit 2% Isofluran und euthanasieren Sie sie 3 Tage vor dem erwarteten Entbindungstermin mittels Zervixluxation. Nach der Euthanasie extrahieren Sie die Nachkommen nacheinander durch Hysterektomie.
2. Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt in der Mittellinie des Unterbauchs, gefolgt von einem 2 cm langen Schnitt. Machen Sie aus diesen Schnitten einen Schnitt entlang des antimesenterialen Randes im mittleren Teil jedes Uteruskanüls.
3. Sanfte Extraktion von Rattenwelpen und Plazenta mittels Hysterektomie^17,18. Entnehmen Sie die Nachkommen sofort nacheinander.

5. Postoperative Betreuung und Vorbereitung der Welpen auf die Adoption

1. Verwenden Sie das Adoptionsverfahren, um zu verhindern, dass die operierte Mutter aufgrund des chirurgischen Eingriffs unangemessenes Verhalten und mögliche Schmerzen zeigt, die das Verhalten der Welpen bei Erwachsenen beeinträchtigen könnten.
2. Befreien Sie die Atemwege der Rattenbabys nach der Geburt mit Papiertüchern. Reinigen Sie die Rattenwelpen, indem Sie sie baden, um Kannibalismus durch Ersatzmütter zu verhindern. Waschen Sie die Rattenbabys in Wasser bei 28 °C und trocknen Sie sie.
3. Entfernen Sie alle Blutspuren und legen Sie die Jungtiere in Petrischalen unter erhitztes Infrarotlicht bei einer Temperatur von ca. 28 °C, bis ihre Atmung normal wird.
4. Schneiden Sie die Nabelschnur direkt unterhalb der Plazenta ab und verwenden Sie mit H₂O₂ getränkte Baumwolle, um Blutungen aus der Nabelschnur zu stoppen. Bieten Sie sie schließlich den Pflegemüttern zur Adoption an.

6. Interaktion mit Pflegemüttern und Adoption von Frühnachkommen

1. Halten Sie jede Pflegemutter mit ihrem Wurf in separaten Plastikkäfigen unter. Markieren Sie vor dem Transfer jeden Welpen aus der Pflegehand. Diese Markierung ist entscheidend für nachfolgende Analysen des mütterlichen Verhaltens. Bewahren Sie die Integrität der Käfige der Pflegemütter während des gesamten Adoptionsprozesses.
2. Setze die Frühgeborenen zunächst außerhalb des Nestes ab. Diese Strategie ermöglicht es der Leihmutter, den Geruch der neuen Welpen in einem neutralen Gebiet zu erkennen und sich mit ihm vertraut zu machen. Wählen Sie außerdem ein oder zwei eigene Welpen der Pflegemutter aus und setzen Sie sie neben die Frühgeborenen außerhalb des Nestes. Diese Mischung veranlasst die Leihmutter, sowohl ihre eigenen als auch die Frühgeborenen zu sammeln und so die Akzeptanz und Integration der neuen Welpen in ihr Nest zu fördern.
3. Mischen Sie zunächst den adoptiven Nachwuchs mit dem biologischen Nachwuchs. Bestätigen Sie die effektive Einführung. Nimm die Welpen der Pflegemutter aus dem Nest und opfere sie¹⁹.
   HINWEIS: In dieser Studie betrug die Lebensfähigkeit von Frühgeborenen 100% und sie wurden von der Leihmutter nicht abgestoßen.

7. Standardisierung von Würfen

1. Behalten Sie eine Wurfgröße von 8 Welpen pro Wurf in allen Gruppen von Leihmutterschaften bei, mit 4 Rüden und 4 Hündinnen. Opfere die verbleibenden Jungratten nach der Standardisierung.

8. Experimentelles Design und Protokollimplementierung

ANMERKUNG: Das Ziel dieses Protokolls war es, lebensfähige Frühgeborene für die Entwicklung der folgenden experimentellen Verfahren zu erhalten.

1. Verwenden Sie insgesamt 20 trächtige Muttermütter für die Eingriffe. Teilen Sie diese in zwei Versuchsgruppen auf, die jeweils aus 10 Muttertieren bestehen.
   1. Stimulieren Sie die Jungtiere der ersten Gruppe, der PP-Gruppe, mit Nadelstichreizen von PND 2 bis PND 15.
   2. Bezeichnen Sie die zweite Gruppe als CC-Gruppe, die als Kontrolle dient, wobei die Jungtiere in dieser Gruppe keine Nadelstichstimulation erhalten.
   3. Überwachen Sie das mütterliche Verhalten der Muttertiere und das Gewicht der Würfe während dieser Zeit sorgfältig.

9. Bewertungen nach dem Abstillen und Verhaltenstests

1. Entwöhnen Sie den Nachwuchs an PND 22. Sortieren Sie sie nach Geschlecht und halten Sie sie in Käfigen mit einer maximalen Kapazität von jeweils 4 Tieren, bis sie etwa 8 Wochen alt sind.
2. Anschließend werden diese Tiere mit dem elektronischen von-Frey-Test auf ihre Empfindlichkeit gegenüber schmerzhaften Reizen untersucht. Konzentrieren Sie sich speziell auf entzündungsinduzierte Schmerzen durch CFA.
3. Um mögliche wurfbedingte Einflüsse zu mildern, wählen Sie für jede Versuchsgruppe 1 männliche und 1 weibliche Ratte aus jedem Wurf aus, um sich im Erwachsenenalter einem Verhaltenstest zu unterziehen.
4. Verwenden Sie jedes Tier in einem einzigen Versuch, um eine Interferenz des hormonellen Faktors mit den nozizeptiven Reaktionen weiblicher Nachkommen von Ratten zu vermeiden. Stellen Sie insbesondere sicher, dass Tests an Frauen während der Distrusionsphase ihres Östruszyklus durchgeführt werden.

10. Wiederholte Schmerzinduktion bei Neugeborenen

1. Induzieren Sie wiederholte Schmerzen bei Neugeborenen mit einer Nadelstichtechnik, die der in einer früheren Studie beschriebenen ähnelt²⁰. Beginnen Sie mit täglichen Nadelstich-Reizen für die Rattenwelpen ab dem 2. postnatalen Tag (PND 2) und setzen Sie diese Praxis bis PND 15 fort.
2. Führen Sie eine 22 G Nadel vorsichtig in geringer Tiefe in den mittleren Plantarbereich der rechten Hinterpfote ein.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Penetration gerade ausreicht, um zu stimulieren, ohne übermäßige Verletzungen zu verursachen. Kalibrieren Sie das Messgerät, um ein tieferes Eindringen zu verhindern, da die Gefahr besteht, dass es in diesem Alter vollständig durch die Pfote geht.
   2. Wenn Blutungen auftreten, stoppen Sie sie sofort mit einem Wattestäbchen; In der Regel dauert dieser Eingriff nur wenige Sekunden. Verabreichen Sie 4 Mal Stimuli und halten Sie einen Abstand von 2 Minuten zwischen jedem ein, insgesamt 8 Stiche pro Tag.
3. Um mögliche Störfaktoren im Zusammenhang mit der Trennung der Mutter und dem Umgang mit Neugeborenen zu minimieren, trennen Sie die Rattenwelpen für maximal 5 Minuten von ihren Muttertieren. Wenden Sie die gleiche Trenndauer auf die Kontrollgruppe an. Bringen Sie die Rattenwelpen nach jedem Satz von Reizen sofort zu ihren Müttern zurück ^5,21,22.

11. Bewertung des mütterlichen Verhaltens

1. Um das Verhalten der Mutter zu bewerten, beurteilen Sie das Verhalten der Muttertiere in beiden Versuchsgruppen (n = 10 pro Gruppe) von PND 2 bis PND 15. Führen Sie das Assessment in zwei Sitzungen durch: eine am Morgen, vor den Nadelstichreizen an den Rattenbabys (zwischen 08:00 und 09:30 Uhr), und eine am Nachmittag, nach den Nadelstichreizen an den Rattenbabys (zwischen 15:00 und 16:30 Uhr).
2. Beobachten, aufzeichnen und bewerten Sie während dieser Sitzungen alle 3 Minuten das Verhalten jeder Mutter, was zu 30 Beobachtungen pro Periode und Tag führt. Das summiert sich auf insgesamt 60 Beobachtungen pro Mutter und Tag.

12. Erfassung von mütterlichem und nicht-mütterlichem Verhalten

1. Erfassen Sie mütterliche Verhaltensparameter, die Handlungen wie Putzen oder Lecken (am Körper oder im anogenitalen Bereich), Stillen, Aufrechterhalten eines gebeugten Rückens in einer "deckenähnlichen" Haltung umfassen, indem Sie sich über die Welpen legen, passives Liegen auf dem Rücken oder auf der Seite während des Stillens, Betreiben von Nestern und mütterliche Selbstpflege (einschließlich Stimulation der Brüste durch Selbstreinigung).
2. Dokumentieren Sie nicht-mütterliche Verhaltensparameter, einschließlich Handlungen wie Füttern, Erkunden des Käfigs, Nicht-Erkunden und das Fehlen von mütterlicher Selbstpflege.
3. Stellen Sie die Daten als Prozentsatz des gesamten mütterlichen Verhaltens und des nicht-mütterlichen Verhaltens dar. Teilen Sie die Anzahl der aufgezeichneten Beobachtungen des Zielverhaltens durch die Gesamtzahl der Beobachtungen und multiplizieren Sie das Ergebnis mit 100 ^5,23,24.

13. Bewertung des Wurfgewichts

1. Überwachen Sie während der gesamten Nadelstichstimulationsphase (PND 2-15) das Gewicht der Würfe sowohl in der PP- als auch in der CC-Gruppe, die jeweils 8 Würfe umfasst.
2. Während der Nadelstichstimulationsphase (PND 2-15) ist das Gewicht der Würfe sowohl in der PP- als auch in der CC-Gruppe, die jeweils aus 8 Würfen besteht, kontinuierlich zu kontrollieren.

14. Prüfung des mechanischen Schwellenwerts

1. In diesem Experiment werden Ratten (im Alter von 8 Wochen) aus der PP- und CC-Gruppe Injektionen von Kochsalzlösung oder CFA in einem Volumen von jeweils 100 μl verabreicht. Platzieren Sie sie anschließend einzeln 15-30 Minuten vor dem Test in Acrylkäfige (42 cm × 24 cm × 15 cm) mit Drahtgitterböden, um die mechanische Hyperalgesie zu beurteilen.
2. Im Test wird mit einem Handkraftaufnehmer, der mit einer 0,5 mm² Polypropylenspitze ausgestattet ist, ein Hinterpfotenbeugereflex induziert (Electronic von Frey).
   1. Schieben Sie die Spitze allmählich zwischen die fünf distalen Fußballen der rechten Hinterpfote und erhöhen Sie den Druck, bis eine Reaktion beobachtet wird.
      HINWEIS: Wenn die Pfote zurückgezogen wird, hört der Reiz automatisch auf und seine Stärke wird dokumentiert. Der Test endet mit einer deutlichen Zuckenreaktion, gefolgt von einem Pfotenrückzug. Die subkutane Verabreichung von CFA induziert eine anhaltende Entzündung, die nach 24 Stunden ihren Höhepunkt erreicht und mindestens 7 Tage anhält²⁵.
3. Vor und nach 4 Stunden, 7 Stunden, 10 Stunden und 24 Stunden nach der Verabreichung von Kochsalzlösung oder CFA⁴ sind Versuche an den Tieren durchzuführen. Präsentieren Sie die Ergebnisse in Bezug auf die Entzugsschwelle, gemessen in Gramm (g), und berechnen Sie sie durch den Durchschnitt von drei Messungen.
4. Um die Interferenz potenzieller hormoneller Faktoren mit nozizeptiven Reaktionen bei weiblichen Nachkommen zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Tests ausschließlich während der diesstrusen Phase ihres Östruszyklus durchgeführt werden.

15. Datenanalyse

1. Verarbeiten Sie die Daten mit Hilfe einer statistischen Analysesoftware und stellen Sie sie als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Um statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu identifizieren, wenden Sie eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit wiederholten Messungen an, wobei Faktoren wie die Bewertung von mütterlichen und nicht-mütterlichen Parametern und die Bewertung des Wurfgewichts berücksichtigt werden.
2. Analysieren Sie insbesondere PND- und Pinprick-Stimuli für mütterliche Parameter und von Frey: CFA und Pinprick-Stimuli für die Wurfgewichtsbewertung. Führen Sie bei Bedarf eine Post-hoc-Analyse mit dem Bonferroni-Test durch.

Ergebnisse

In dieser Studie gab es keine Unterschiede im mütterlichen oder nicht-mütterlichen Verhalten zwischen den Müttern, unabhängig davon, ob ihre Nachkommen während der Neugeborenenperiode Nadelstichexperimente durchführten oder ob sie zu früh oder terminiert waren (Abbildung 1). Hinsichtlich des mütterlichen Verhaltens von Adoptivmüttern von Frühgeborenen zeigte die bidirektionale ANOVA, dass es einen Effekt von PND (postnataler Tag) gab, aber keinen E...

Diskussion

In dieser Untersuchung beobachteten wir, dass das mütterliche und nicht-mütterliche Verhalten von Müttern von neonatalen Nadelstichexperimenten unberührt blieb. Dieser Trend erstreckte sich auch auf nicht-mütterliches Verhalten. Darüber hinaus unterschied sich die Gewichtszunahme von Frühgeborenen während der Nadelstich-Stimulusphase nicht signifikant zwischen der Kontroll- und der Nadelstichgruppe. Die Analyse der Pfotenentnahmeschwelle ergab eine bemerkenswerte Verringerung sow...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl solution	Concare, Brazil
Acrylic cages (42 cm × 24 cm × 15 cm) with wire grid floors	Insight Equipamentos, Brazil
Complete Freund's Adjuvant (CFA)	Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,	Insight Equipamentos, Brazil
H2O2 (hydrogen peroxide)	ACS Cientifica, Brazil
Infrared lighting	Carci, Brazil
Isoflurane (2%)	Cristália, Brazil
Upright microscope	Nikon, Brazil	ECLIPSE Ei	Microscope with 10x and 40x objective lenses