Un modello di ratto pretermine per gli studi sul dolore

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo conciso per la creazione di un modello di ratto pretermine, facilitando la ricerca sulla gestione precoce del dolore postnatale. Il metodo prevede l'esecuzione di un taglio cesareo tre giorni prima del parto previsto, l'estrazione di cuccioli di ratto pretermine tramite isterectomia e la loro integrazione con la prole biologica di una madre surrogata.

Abstract

Questa ricerca approfondisce le conseguenze della stimolazione costante con puntura di spillo sulla prole pretermine per accertare le sue implicazioni a lungo termine per la sensibilità al dolore. L'obiettivo primario di questo protocollo era quello di studiare l'impatto degli stimoli neonatali sulla soglia del dolore nelle fasi successive della vita utilizzando un modello di ratto pretermine. Stabilendo questo modello, miriamo a far progredire la ricerca sulla comprensione e la gestione del dolore postnatale precoce associato alla prematurità. I risultati di questo studio indicano che, mentre le soglie di base per gli stimoli meccanici sono rimaste inalterate, c'è stato un notevole aumento dell'ipersensibilità meccanica dopo l'iniezione completa di adiuvante di Freund (CFA) nei ratti adulti. È interessante notare che, rispetto ai ratti maschi, le femmine di ratto hanno dimostrato un'elevata ipersensibilità infiammatoria. In particolare, il comportamento materno, il peso delle cucciolate e la traiettoria di crescita della prole sono rimasti invariati dalla stimolazione. La manifestazione di risposte nocicettive alterate in età adulta dopo stimoli dolorosi neonatali potrebbe essere indicativa di cambiamenti nell'elaborazione sensoriale e nel funzionamento dei recettori dei glucocorticoidi. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere i meccanismi sottostanti coinvolti e per sviluppare interventi per le conseguenze della prematurità e del dolore neonatale negli adulti.

Introduzione

Durante il periodo neonatale, le vie nocicettive subiscono una significativa maturazione strutturale e funzionale e la presenza di danno tissutale e dolore associato ha profonde implicazioni per lo sviluppo dell'elaborazione somatosensoriale¹.

L'utilizzo di modelli animali consente la manipolazione sperimentale controllata di animali non umani, consentendo una comprensione più profonda delle conseguenze del dolore neonatale sul comportamento più avanti nella vita, mitigando al contempo le potenziali variabili confondenti ^2,3. Un risultato comunemente osservato è l'influenza del dolore neonatale sull'aumento della sensibilità al dolore in età adulta ^2,4,5. Nell'unità di terapia intensiva neonatale (NICU), il dolore neonatale è una fonte di stress molto diffusa, con i neonati prematuri che in genere vengono sottoposti a una mediana di 10 procedure invasive al giorno⁶. I neonati prematuri in terapia intensiva neonatale incontrano una serie di fattori di stress, tra cui dolore, contatto materno limitato, stimoli uditivi e illuminazione eccessiva ^7,8,9.

L'utilizzo di modelli animali è essenziale per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi sottostanti coinvolti in questi processi e facilitare nuovi progressi in questo settore. In particolare, l'impiego di modelli animali pretermine negli studi può contribuire notevolmente ad ampliare il corpus di conoscenze sui neonati prematuri e fornire preziose informazioni sugli interventi di gestione del dolore per i neonati prematuri¹⁰.

Attualmente, esiste un numero limitato di modelli di roditori che affrontano specificamente la prematurità, con la maggior parte di questi studi che indagano principalmente gli effetti della prematurità sul cervello¹¹, sullo sviluppo polmonare¹², sull'enterocolite necrotizzante¹³ o sugli studi di nutrizione immunitaria¹⁴. Tuttavia, nessuno di questi modelli esamina la maturazione del sistema del dolore, che è particolarmente vulnerabile nei casi di prematurità.

La nascita prematura e le sue conseguenze per la gestione precoce del dolore postnatale rimangono aree di studio cruciali. Pertanto, il presente lavoro mirava a contribuire alla letteratura stabilendo un modello di ratto pretermine. Questo modello fornisce informazioni sull'impatto degli stimoli neonatali sulla soglia del dolore durante le fasi successive della vita, migliorando la nostra comprensione del dolore correlato alla prematurità.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali hanno seguito la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio adottata dal Comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università federale di Alfenas (protocollo 32/2016).

1. Animali

1. Procurati ratti maschi adulti e femmine di Wistar nullipare (circa otto settimane di età) presso la Central Animal Facility dell'Università Federale di Alfenas.
2. Alloggiare i ratti in condizioni di temperatura e umidità controllate in un ciclo luce: buio delle ore 12:12 e nutrirli con cibo e acqua ad libitum nella Facoltà di Fisioterapia delle strutture per animali (Università Federale di Alfenas).

2. Controllo della gravidanza

1. Per 1 mese, ogni mattina tra le 8:00 e le 9:00, trasporta ogni gabbia per animali nella sala sperimentale. Per eseguire un lavaggio vaginale, introdurre con cautela nella vagina del ratto una pipetta di plastica contenente 10 μL di soluzione di NaCl allo 0,9%. Assicurarsi che l'inserimento sia poco profondo per evitare una penetrazione profonda, quindi ritirarsi delicatamente per raccogliere le secrezioni vaginali.
2. Posizionare il liquido vaginale raccolto su singoli vetrini, assegnando un vetrino separato a ciascuna gabbia di animali.
   1. Ottenere una singola goccia di materiale non colorato da ciascun ratto utilizzando un puntale di pipetta pulito. Esaminare il materiale al microscopio ottico utilizzando obiettivi 10x e 40x, senza utilizzare la lente del condensatore.
   2. Identificare tre tipi di cellule distinte in base alle loro caratteristiche: cellule epiteliali rotonde e nucleate, cellule cornificate irregolari senza nucleo e leucociti piccoli e rotondi¹⁵.
3. Esporre all'accoppiamento le femmine di ratto Wistar con intensa cheratinizzazione e desquamazione vaginale, caratteristiche del ciclo estrale e indicanti una maggiore ricettività maschile. Accoppia i ratti posizionando 2 femmine e 1 maschio per gabbia. Determinare il giorno gestazionale 0 controllando la presenza di spermatozoi e cellule della fase estrale negli strisci vaginali.

3. Classificazione e gestione delle madri gravide e della loro prole

1. Smaltire tre tipi di madri gravide (2 madri ciascuna) in base al loro stadio gestazionale: madri pretermine, a termine e surrogate. Consentire alle madri gravide a termine di partorire naturalmente il 22° giorno di gestazione e utilizzare le loro cucciolate per il gruppo a termine.
2. Il 19° giorno di gestazione, eseguire un taglio cesareo sulle madri gravide pretermine, ovvero 3 giorni prima della data prevista per il parto. Utilizza queste cucciolate per il gruppo pretermine. Dato che questa procedura non favorisce la sopravvivenza della madre, affidare i cuccioli prematuri a madri surrogate, che hanno partorito naturalmente 2 giorni prima del taglio cesareo delle madri pretermine.
3. Tieni i cuccioli della madre surrogata con lei per alcune ore, permettendo ai loro odori di mescolarsi con le cucciolate pretermine. Trascorso questo periodo, introdurre le cucciolate pretermine e rimuovere i cuccioli originali della surrogata, sacrificandoli successivamente con alte dosi di inalazione di isoflurano.
   NOTA: Questo passaggio è essenziale per garantire che le madri surrogate abbiano già stimolato la produzione di latte nelle loro ghiandole mammarie, posizionandole per allattare efficacemente i cuccioli prematuri¹⁶.

4. Chirurgia cesarea

1. Anestetizzare parzialmente le madri gravide pretermine con isoflurano al 2% e sopprimerle 3 giorni prima della data prevista per il parto utilizzando la lussazione cervicale. Dopo l'eutanasia, estrarre la prole uno per uno attraverso l'isterectomia.
2. Fai un taglio di 3 cm nella linea mediana del basso ventre, seguito da un taglio longitudinale di 2 cm. Praticare un'incisione lungo il bordo antimesenterico nella parte centrale di ciascuna tuba uterina da questi tagli.
3. Estrarre delicatamente i cuccioli di ratto e la placenta tramite isterectomia^17,18. Estrai immediatamente la prole una per una.

5. Cura post-operatoria e preparazione dei cuccioli per l'adozione

1. Utilizzare la procedura di adozione per evitare che la madre operata mostri un comportamento inappropriato a causa della procedura chirurgica e del potenziale dolore, che potrebbe influenzare il comportamento adulto dei cuccioli.
2. Libera le vie respiratorie dei cuccioli di ratto usando salviette di carta dopo la nascita. Pulisci i cuccioli di ratto facendo loro un bagno per prevenire il cannibalismo da parte di madri surrogate. Lavate i cuccioli di ratto in acqua a 28 °C e asciugateli.
3. Rimuovere ogni traccia di sangue e porre i cuccioli in piastre di Petri sotto l'illuminazione a infrarossi riscaldata, mantenendo una temperatura di circa 28 °C fino a quando la loro respirazione diventa regolare.
4. Tagliare il cordone ombelicale appena sotto la placenta e utilizzare del cotone imbevuto di H₂O₂ per fermare qualsiasi sanguinamento dal cordone ombelicale. Infine, offriteli alle madri affidatarie per l'adozione.

6. Interazione con la madre adottiva e adozione di prole pretermine

1. Ospita ogni madre adottiva con la propria cucciolata in gabbie di plastica separate. Prima del trasferimento, segna ogni termine cucciolo dalla mano adottiva. Questa marcatura è fondamentale per le successive analisi del comportamento materno. Mantenere l'integrità delle gabbie delle madri affidatarie durante tutto il processo di adozione.
2. Inizialmente, posiziona i cuccioli prematuri fuori dal nido. Questa strategia consente alla madre surrogata di riconoscere e familiarizzare con l'odore dei nuovi cuccioli in un territorio neutro. Inoltre, seleziona uno o due dei cuccioli della madre adottiva e posizionali fuori dal nido insieme ai cuccioli prematuri. Questo mix spinge la madre surrogata a raccogliere sia i propri cuccioli che quelli prematuri, promuovendo così l'accettazione e l'integrazione dei nuovi cuccioli nel suo nido.
3. Mescola inizialmente la prole adottiva con la prole biologica. Confermare l'adozione effettiva. Rimuovi i cuccioli della madre adottiva dal nido e sacrificali¹⁹.
   NOTA: In questo studio, la vitalità dei ratti pretermine era del 100% e non sono stati respinti dalla madre surrogata.

7. Standardizzazione delle lettiere

1. Mantenere una cucciolata di 8 cuccioli per cucciolata in tutti i gruppi di cuccioli allevati in madre surrogata, con 4 maschi e 4 femmine. Sacrifica i cuccioli di ratto rimanenti dopo la standardizzazione.

8. Disegno sperimentale e implementazione del protocollo

NOTA: Lo scopo di questo protocollo era quello di ottenere cuccioli prematuri vitali per lo sviluppo delle seguenti procedure sperimentali.

1. Utilizzare un totale di 20 madri gravide per le procedure. Dividili in due gruppi sperimentali, ciascuno composto da 10 dighe.
   1. Stimolare i cuccioli del primo gruppo, il gruppo PP, con stimoli da puntura di spillo da PND 2 a PND 15.
   2. Designare il secondo gruppo come gruppo CC, che funge da controllo, con i cuccioli di questo gruppo che non ricevono la stimolazione con puntura di spillo.
   3. Monitorare diligentemente il comportamento materno delle madri e il peso delle cucciolate durante questo periodo.

9. Valutazioni post-svezzamento e test comportamentali

1. Svezzare la prole su PND 22. Ordinali per sesso e ospitali in gabbie con una capacità massima di 4 animali ciascuna fino a quando non raggiungono circa 8 settimane di età.
2. Successivamente, sottoponi questi animali a valutazioni della sensibilità agli stimoli dolorosi utilizzando il test elettronico di von Frey. Concentrati in particolare sul dolore indotto dall'infiammazione da CFA.
3. Per mitigare eventuali influenze legate alla cucciolata, selezionare 1 ratto maschio e 1 femmina da ogni cucciolata per ogni gruppo sperimentale da sottoporre a test comportamentali durante l'età adulta.
4. Usa ogni animale in un singolo esperimento per evitare l'interferenza del fattore ormonale nelle risposte nocicettive delle femmine di ratto. In particolare, assicurarsi che i test vengano condotti sulle femmine durante la fase di diestro del loro ciclo estrale.

10. Induzione ripetuta del dolore neonatale

1. Indurre dolore neonatale ripetuto utilizzando una tecnica di puntura di spillo simile a quella descritta in uno studio precedente²⁰. Iniziare gli stimoli quotidiani per i cuccioli di ratto a partire dal giorno 2 postnatale (PND 2) e continuare questa pratica fino al PND 15.
2. Inserire con cautela un ago da 22 G a una profondità ridotta nell'area medio-plantare della zampa posteriore destra.
   1. Assicurarsi che la penetrazione sia appena sufficiente per stimolare senza causare lesioni eccessive. Calibrare il calibro per evitare una penetrazione più profonda, considerando il rischio che passi interamente attraverso la zampa a questa età.
   2. Se si verifica un'emorragia, fermarla prontamente utilizzando un tampone di cotone; In genere, questo intervento dura solo pochi secondi. Somministrare gli stimoli 4 volte, mantenendo un intervallo di 2 minuti tra ciascuno, per un totale di 8 punture al giorno.
3. Per ridurre al minimo i potenziali fattori confondenti legati alla separazione materna e alla manipolazione neonatale, separare i cuccioli di ratto dalle loro madri per un massimo di 5 minuti. Applicare la stessa durata di separazione al gruppo di controllo. Dopo ogni serie di stimoli, riporta prontamente i cuccioli di ratto alle loro madri ^5,21,22.

11. Valutazione dei comportamenti materni

1. Per valutare il comportamento materno, valutare il comportamento delle madri in entrambi i gruppi sperimentali (n = 10 per gruppo) da PND 2 a PND 15. Condurre la valutazione in due sessioni: una al mattino, prima degli stimoli della puntura di spillo sui cuccioli di ratto (tra le 08:00 e le 09:30), e una al pomeriggio, dopo gli stimoli della puntura di spillo sui cuccioli di ratto (tra le 15:00 e le 16:30).
2. Durante queste sessioni, osserva, registra e valuta diligentemente il comportamento di ogni madre ogni 3 minuti durante queste sessioni, portando a 30 osservazioni per periodo al giorno. Questo si accumula per un totale di 60 osservazioni per madre al giorno.

12. Registrazione dei comportamenti materni e non materni

1. Registrare i parametri del comportamento materno che comprendono azioni come la toelettatura o il leccamento (sul corpo o sulla regione anogenitale), l'allattamento, il mantenimento di una schiena arcuata in una postura simile a una "coperta" sdraiandosi sopra i cuccioli, sdraiandosi passivamente sulla schiena o su un fianco durante l'allattamento, l'impegno nella costruzione di nidi e l'auto-toelettatura materna (compresa la stimolazione del seno attraverso l'autopulizia).
2. Documentare i parametri comportamentali non materni, comprese azioni come l'alimentazione, l'esplorazione della gabbia, la mancata esplorazione e l'assenza di auto-toelettatura materna.
3. Presentare i dati come percentuale del comportamento materno totale e del comportamento non materno. Dividi il numero di osservazioni registrate sul comportamento target per il numero totale di osservazioni e moltiplica il risultato per 100 ^5,23,24.

13. Valutazione del peso della cucciolata

1. Durante la fase di stimolazione con puntura di spillo (PND 2-15), monitorare il peso delle cucciolate in entrambi i gruppi PP e CC, ciascuno composto da 8 cucciolate.
2. Durante la fase di stimolazione con puntura di spillo (PND 2-15), tenere sotto controllo continuo il peso delle figliate sia nel gruppo PP che in quello CC, ciascuna composta da 8 figliate.

14. Prova meccanica di soglia

1. In questo esperimento, somministrare iniezioni di soluzione salina o CFA, ciascuna in un volume di 100 μL, a ratti (di 8 settimane di età) dei gruppi PP e CC. Successivamente, posizionarli individualmente in gabbie acriliche (42 cm × 24 cm × 15 cm) con pavimenti a griglia metallica 15-30 minuti prima del test per valutare l'iperalgesia meccanica.
2. Nel test, indurre un riflesso di flessione della zampa posteriore utilizzando un trasduttore di forza portatile dotato di una punta in polipropilene da 0,5 mm² (Electronic von Frey).
   1. Applicare gradualmente la punta tra i cinque cuscinetti distali della zampa posteriore destra, aumentando la pressione fino a quando non si osserva una risposta.
      NOTA: Quando si verifica la retrazione della zampa, lo stimolo cessa automaticamente e la sua forza viene documentata. Il test si conclude con una chiara risposta di sussulto seguita dal ritiro della zampa. La somministrazione sottocutanea di CFA induce un'infiammazione prolungata, con un picco a 24 ore e persistenza per almeno 7 giorni²⁵.
3. Condurre test sugli animali prima e alle 4 ore, 7 ore, 10 ore e 24 ore dopo la somministrazione di soluzione salina o CFA⁴. Presentare i risultati in termini di soglia di prelievo, misurata in grammi (g), e calcolarli facendo la media di tre misurazioni.
4. Per prevenire l'interferenza di potenziali fattori ormonali nelle risposte nocicettive tra la prole femminile, assicurarsi che i test vengano eseguiti esclusivamente durante la fase di diestro del ciclo estrale.

15. Analisi dei dati

1. Elaborare i dati utilizzando un software di analisi statistica e presentarli come media ± errore standard della media (SEM). Per identificare differenze statisticamente significative tra i gruppi, applicare un'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) con misure ripetute, considerando fattori come la valutazione dei parametri materni rispetto a quelli non materni e la valutazione del peso della figliata.
2. In particolare, analizzare PND e stimoli a puntura di spillo per i parametri materni e von Frey: CFA e stimoli a puntura di spillo per la valutazione del peso della figliata. Condurre analisi post hoc utilizzando il test di Bonferroni quando necessario.

Risultati

In questo studio, non ci sono state differenze nel comportamento materno o non materno tra le madri, indipendentemente dal fatto che la loro prole sia stata sottoposta a esperimenti con puntura di spillo durante il periodo neonatale o fosse pretermine o a termine (Figura 1). Per quanto riguarda il comportamento materno delle madri adottive di prole pretermine, l'ANOVA a due vie ha mostrato che c'era un effetto della PND (giorno postnatale) ma nessun effetto ...

Discussione

In questa indagine, abbiamo osservato che i comportamenti materni e non materni delle madri sono rimasti inalterati dalla sperimentazione neonatale con puntura di spillo. Questa tendenza si estendeva anche al comportamento non materno. Inoltre, l'aumento di peso delle cucciolate pretermine durante il periodo di stimolo della puntura di spillo non era significativamente diverso tra i gruppi di controllo e puntura di spillo. Le analisi della soglia di ritiro delle zampe hanno rivelato una ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl solution	Concare, Brazil
Acrylic cages (42 cm × 24 cm × 15 cm) with wire grid floors	Insight Equipamentos, Brazil
Complete Freund's Adjuvant (CFA)	Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,	Insight Equipamentos, Brazil
H2O2 (hydrogen peroxide)	ACS Cientifica, Brazil
Infrared lighting	Carci, Brazil
Isoflurane (2%)	Cristália, Brazil
Upright microscope	Nikon, Brazil	ECLIPSE Ei	Microscope with 10x and 40x objective lenses