La reparación de la arteria intracarótida en un modelo de ratón después de la inyección devuelve el flujo sanguíneo a la arteria sin afectar negativamente la distribución del material inyectado. La reparación en el lugar de la inyección facilita las inyecciones posteriores a través de la misma arteria y previene la isquemia cerebral en cepas de ratón que carecen de un Círculo de Willis completo.
Dados los avances recientes en la administración de nuevas terapias antitumorales utilizando métodos de administración intraarterial selectivos endovasculares en neurooncología, existe una necesidad urgente de desarrollar métodos para las inyecciones intracarotídeas en modelos de ratón, incluidos métodos para reparar la arteria carótida en ratones después de la inyección para permitir inyecciones posteriores. Desarrollamos un método de inyección intracarotídea en un modelo de ratón para administrar terapias en la arteria carótida interna (ACI) con dos procedimientos alternativos.
Durante la inyección, la aguja se inserta en la arteria carótida común (ACC) después de atar una sutura alrededor de la arteria carótida externa (ECA) y los tratamientos inyectados se administran en la ACI. Después de la inyección, se puede ligar la arteria carótida común (CCA), lo que limita el número de inyecciones intracarotídeas a una. El procedimiento alternativo descrito en este artículo incluye una modificación en la que la inyección intracarótida es seguida por la reparación del CCA en el lugar de la inyección, lo que restaura el flujo sanguíneo dentro del CCA y evita la complicación de la isquemia cerebral observada en algunos modelos de ratón.
También comparamos la administración de células madre mesenquimales humanas derivadas de la médula ósea (BM-hMSC) con tumores intracraneales cuando se administraron mediante inyección intracarotídea con y sin reparación del sitio de inyección después de la inyección. La administración de BM-hMSC no difiere significativamente entre los métodos. Nuestros resultados demuestran que la reparación del CCA en el lugar de inyección permite inyecciones repetidas a través de la misma arteria y no perjudica la entrega y distribución del material inyectado, proporcionando así un modelo con mayor flexibilidad que emula más de cerca la inyección intracarotídea en humanos.
La administración de terapias a los tumores cerebrales es un desafío debido a la impermeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB) y la barrera hematotumoral (BTB). La inyección intratumoral directa de terapias para eludir la BHE puede lograrse mediante el uso de un catéter de reservorio Ommaya, una microinfusión de bajo flujo para una administración mejorada por convección o una inyección local en la cavidad de resección o en el tejido adyacente1. Sin embargo, el volumen total de tejido tumoral que se alcanza con estos métodos es limitado 2,3,4. Las inyecciones intraarteriales se han utilizado anteriormente para administrar agentes terapéuticos a los tumores cerebrales con el objetivo de llegar a una mayor cantidad del tumor 5,6,7,8 y, en los últimos tiempos, los avances tanto en las técnicas de administración intraarterial como en los nuevos agentes terapéuticos han demostrado el beneficio de utilizar este enfoque en el tratamiento de los tumores cerebrales7, 9. Estos avances incluyen el desarrollo de microcatéteres, la administración intraarterial selectiva endovascular (ESIA) con imágenes avanzadas, el uso de agentes osmóticos para interrumpir la BHE y la BTB, y el desarrollo de terapias biológicas dirigidas. Por lo tanto, para realizar ensayos preclínicos de nuevos agentes terapéuticos que se administran a través de inyecciones intraarteriales, son necesarios modelos de investigación traslacional apropiados 9,10.
En modelos de ratón de tumores cerebrales, los fármacos terapéuticos administrados por vía intraperitoneal o intravenosa (a través de la vena de la cola) pasan a través del hígado o del corazón y los pulmones, respectivamente, antes de distribuirse a todo el cuerpo, incluido el cerebro. Estos efectos de primer paso pueden atrapar y eliminar el agente, o diluir el agente antes de llegar al cerebro, y pueden presentar toxicidades limitantes de la dosis antes de alcanzar una dosis terapéutica en el cerebro. Por el contrario, la inyección intracarótida en la arteria permite una administración enfocada al cerebro antes de la circulación al evitar el metabolismo de primer paso y limitar la administración fuera del objetivo. Si bien la inyección intracarotídea en ratones es más laboriosa, la especificidad y la reproducibilidad de la técnica resultan en una reducción del número de animales para completar las investigaciones11,12.
En general, en los métodos previamente descritos de inyección intracarótida en ratones, la arteria carótida común se liga después de la inyección y la circulación al cerebro es proporcionada por la arteria carótida contralateral y la circulación cerebral posterior a través del círculo de Willis11,12. Este método tiene la limitación inherente de permitir solo un máximo de una inyección en la arteria carótida interna o externa. También es fundamental que las cepas de ratón utilizadas en experimentos en los que se liga la arteria carótida tengan un círculo de Willis completo para prevenir la isquemia cerebral debida a la arteria ligada13. También se ha demostrado que la oclusión de la arteria carótida reduce el flujo sanguíneo cerebral y limita la distribución de las partículas inyectadas14. Además, la oclusión de la arteria carótida en ratones después de la inyección no emula la inyección intracarótida en pacientes humanos.
Nuestro grupo ha utilizado previamente inyecciones intracarótidas en la arteria para administrar con éxito células madre mesenquimales al cerebro 10,15,16,17,18,19. En este artículo, describimos en detalle este método de inyección de la arteria intracarótida e incluimos una modificación del método que desarrollamos, en el que se repara el sitio de la inyección sin ocluir la arteria, evitando las limitaciones que plantea la ligadura de la arteria carótida posterior a la inyección. En este método, la arteria carótida común (CCA) se prepara para la inyección colocando dos suturas, una en cada extremo del sitio de inyección previsto, y se aprieta la sutura inferior (debajo del sitio de inyección). La arteria carótida externa (ECA) se sella con otra sutura. La aguja se inserta en el CCA y los tratamientos se administran en la arteria carótida interna (ACI). Después de esto, la sutura superior del CCA se aprieta para evitar el reflujo del ICA. En este paso, el CCA inyectado se puede ligar o reparar. Si se va a ligar el CCA, las suturas se aprietan y se dejan en su lugar. Si se repara el sitio de la inyección, se retiran las suturas después de la reparación y se restablece el flujo sanguíneo. A continuación se proporcionan los detalles de estos procedimientos alternativos.
Todos los pasos que se describen a continuación cumplen con nuestro protocolo, que sigue las pautas establecidas y fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas.
1. Preparación de la mesa quirúrgica y el ratón para el procedimiento quirúrgico
2. Procedimiento quirúrgico (Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 y Figura 7)
Informes anteriores han demostrado que las células madre mesenquimales humanas derivadas de la médula ósea (BM-hMSC) administradas por inyección intracarotídea se dirigieron con éxito a los gliomas intracraneales en ratones19. Empleamos este modelo para comparar los efectos de la ligadura de CCA frente a la reparación de CCA con la circulación restaurada después de la inyección intracarotídea de BM-hMSC en ratones portadores de glioma. A los ratones desnudos atímicos se les implantaron células de glioma U87, seguidas de una inyección de BM-hMSC marcadas con GFP con ligadura posterior de CCA o reparación de CCA con circulación restaurada. Después de 3 días, se sacrificaron ratones y se recolectaron los cerebros, se fijaron y se realizó inmunohistoquímica para detectar GFP y se contaron las células GFP positivas (Figura 8A-D).
La localización general de las GFP-BM-hMSC en los gliomas intracraneales se evaluó mediante el número total de células positivas para GFP dentro del límite tumoral en dos portaobjetos diferentes (secciones separadas por >75 μm) de la misma muestra. La comparación de las medias mediante la prueba t no apareada sugirió que no hubo diferencias significativas entre la media de homing observada entre los dos procedimientos (P = 0,6858) (Figura 8E). La dispersión de GFP-BM-hMSC por todo el tumor se evaluó mediante el recuento de células GFP positivas en 10 campos de alta potencia dentro del tumor. El aumento del número de células dentro de los campos de alta potencia puede indicar cambios en la dispersión de las células en todo el tumor como resultado de la variación en el procedimiento. La comparación de los valores medianos mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon indicó que no hubo diferencias significativas entre los recuentos medianos de células GFP positivas en campos de alta potencia entre los grupos de ligadura de CCA y reparación de CCA (Figura 8F).
Figura 1: Preparación de la mesa quirúrgica y del ratón para la cirugía. (A,B) Cama quirúrgica (etiquetas A. Cinta vinílica que forma la cama, B. Cinta quirúrgica de sujeción de las extremidades delanteras, C. Almohada, D. Peso, E. Cono nasal de anestesia, F. Retractor de gancho romo, G. Suturas de 1 cm en etanol al 70%, H. Pinzas finas, I. Pinzas de punta inclinada, J. Tijeras estrechas, K. Bolas de algodón estériles). (C,D) Colocación del ratón. (E,F) Sitio quirúrgico y desinfección del sitio quirúrgico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Incisión y exposición de estructuras en el lugar de la inyección. (A) Incisión en la línea media. (B,C) Retracción de la glándula salival derecha. (D) También es visible el triángulo muscular formado por el músculo tráquea/esternohioideo, el músculo esternocleidomastoideo y el músculo digástrico, el músculo omohioideo. (E) Arteria carótida común, indicada por la flecha. (F) Nervio vago y arteria carótida común, indicados por las flechas. Abreviaturas: sh = tráquea/músculo esternohioideo; SM = músculo esternocleidomastoideo; DG = músculo digástrico; oh = músculo omohioideo; CCA = arteria carótida común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación del ACC para la inyección. (A) Pinzas de punta en ángulo pasadas por debajo del CCA. (B) La sutura se tiró hasta la mitad por debajo del CCA usando pinzas de punta en ángulo. (C) La segunda sutura se tiró hasta la mitad debajo del CCA. (D) Suturado atado en mantas sueltas alrededor del CCA. Abreviatura: CCA = Arteria carótida común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aislamiento y preparación de la arteria carótida externa. (A) CCA, arteria carótida externa y arteria carótida interna. (B) Sutura tirada hasta la mitad por debajo del ECA. Abreviaturas: CCA Arteria carótida común; ECA = arteria carótida externa; ICA = arteria carótida interna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Preparación de la aguja y la jeringa. (A) Inyección con una aguja recta con una jeringa apoyada contra el cuerpo del ratón. (B) Inyección con una aguja doblada, con una mano apoyada en la mesa quirúrgica. (C,D) Preparación de una aguja doblada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Inyección intracarotídea. (A) La sutura superior está floja, la sutura inferior se aprieta en el CCA, la aguja se coloca sobre la sutura inferior. (B) La aguja se inserta justo después del bisel, la arteria se sella alrededor de la aguja. (C) La sutura superior se levanta para doblar la arteria hacia arriba y evitar el reflujo. (D) Se aprieta la sutura superior del CCA. Abreviatura: CCA = Arteria carótida común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Reparación del lugar de inyección y restablecimiento de la circulación. (A) El sitio de inyección indicado con una flecha. (B) El sitio de inyección se cerró con un nudo de cirujano, un mínimo de cuatro lanzamientos. (C,D) Aflojamiento de las suturas superior e inferior en el CCA después de la reparación del lugar de la inyección; No se observa sangrado después del aflojamiento de la sutura. (E) Las suturas se retiran después de que se determina que el sitio de inyección está suficientemente reparado. Abreviatura: CCA = Arteria carótida común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Inyección intracarotídea de GFP-BM-hMSC y comparación de los tumores de glioma intracraneal después de la ligadura de CCA o la reparación de CCA con circulación restaurada. Las secciones de tejido cerebral de ratones portadores de tumores se tiñeron con anticuerpos primarios anti-GFP y Alexa Fluor 488 secundarios para marcar GFP-BM-hMSC (verde). Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul). Campos representativos de baja potencia de secciones marcadas que muestran la localización general del tumor y campos de alta potencia que muestran la distribución de células GFP positivas después de la reparación de (A,C) CCA o la ligadura de CCA (B,D). (E) La localización general de GFP-BM-hMSC en los tumores se evaluó mediante el número total de células GFP positivas dentro del límite tumoral en dos portaobjetos diferentes y las medias se compararon mediante una prueba t. No se observaron diferencias significativas en el homing global entre los procedimientos alternativos (P = 0,6858). (F) La dispersión de GFP-BM-hMSC a través del tumor se evaluó mediante el recuento de células GFP positivas en 10 campos de alta potencia dentro del tumor. La comparación de los valores medianos mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon no indica diferencias significativas entre individuos, independientemente del procedimiento (P = 0,1914, 0,5000, 0,1641, 0,9512, 0,8828, 0,2207). Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; GFP-BM-hMSCs = células madre mesenquimales humanas derivadas de la médula ósea marcadas con GFP; CCA = arteria carótida común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las inyecciones intracarótidas en las arterias se han utilizado cada vez más en los últimos años para administrar terapias a los tumores cerebrales. En consecuencia, es importante establecer modelos de ratón que reflejen las inyecciones de arterias intracarótidas en humanos con fines de investigación. Anteriormente, las inyecciones intracarótidas en ratones se realizaban con posterior ligadura de la arteria, lo que limita el número de inyecciones en la arteria11,12. Además, la oclusión de la arteria carótida en ratones puede provocar isquemia cerebral en ciertas cepas de ratones que no tienen un Círculo de Willis13 completo. Hemos desarrollado un método para reparar la arteria carótida inyectada para superar las limitaciones de los métodos anteriores. La reparación del lugar de la inyección da como resultado el restablecimiento del flujo sanguíneo a la arteria inyectada, lo que reduce la posibilidad de isquemia cerebral y facilita las inyecciones posteriores en la misma arteria carótida interna.
Varios pasos, que son críticos para el éxito, requieren un manejo cuidadoso de los instrumentos quirúrgicos o el tejido, que incluyen: inserción de la aguja correctamente en la luz de la arteria para evitar el sangrado durante la inyección intracarotídea; disección cuidadosa del tejido conectivo del lugar de la inyección antes de la inserción de la aguja; eliminación de todos los grumos y burbujas de aire en la jeringa y la aguja antes de la inyección; y el cierre correcto del lugar de inyección para evitar el cierre de la luz de la arteria durante la reparación. Para evitar el sangrado después de insertar la aguja, asegúrese de que la aguja se inserte en la arteria más allá del bisel para formar un sello alrededor del eje de la aguja. Para evitar un desgarro en la pared posterior de la arteria, inserte la aguja en un ángulo poco profundo y balancee sutilmente la jeringa y la aguja hacia atrás para mantener la punta de la aguja alejada de la pared posterior arterial. Si la solución inyectada se filtra durante la inyección, esto sugiere que la aguja solo se insertó en el tejido conectivo que rodea la arteria; La disección cuidadosa del exceso de tejido conectivo del sitio de la inyección antes de la inyección evitará este problema.
En cuanto a la elección de la técnica de sutura y cierre, si en la inyección inicial se utilizó una aguja de 33 G y se realizó una inserción limpia en la arteria, una sutura simple con sutura 9-0 es suficiente para reparar la arteria. Si se utiliza una aguja más grande para la inyección (30 G, etc.) o se produce algún desgarro al insertar la aguja (por ejemplo, cuando la aguja está descentrada o la arteria se mueve porque el ratón está respirando), esto da como resultado un orificio ligeramente más grande que debe repararse. Dos suturas simples o una figura de ocho suelen ser suficientes para reparar este tipo de agujero más grande. La elección entre estas dos técnicas se basa en la preferencia del cirujano en esta situación. Es importante tener en cuenta que la técnica de reparación no se ha evaluado en situaciones en las que el orificio del lugar de inyección es significativamente más grande que en la situación mencionada anteriormente. Si el desgarro en el lugar de la inyección se extiende lateralmente (formando un orificio más ancho, mayor que un tercio de la circunferencia de la arteria), la reparación con este método puede causar la contracción de la arteria y un mayor riesgo de trombosis.
Si hay sangrado en el sitio de inyección reparado a medida que se retiran las suturas, puede deberse al estiramiento del sitio reparado a medida que se reanuda la circulación normal; Esto puede rectificarse cubriendo suavemente el lugar de inyección reparado con algodón estéril y aplicando una ligera presión durante 30 s. Alternativamente, si hay sangrado en el sitio de inyección reparado sin flujo sanguíneo visible y una arteria proximal distendida, indica que la aguja de sutura pasó a través de la pared posterior de la arteria durante la reparación. En este caso, abra suavemente los bordes del lugar de inyección durante la reparación, pase la aguja de sutura a través de la arteria en un ángulo poco profundo y confirme visualmente que la sutura no ha pasado a través de la pared posterior antes de atar el nudo de sutura.
Con estas medidas, el método de reparación del lugar de inyección es preciso y repetible en cohortes de animales, independientemente de su origen genético o edad. En nuestra experiencia, la tasa de éxito ha sido del 100% con tres cirujanos diferentes realizando el procedimiento. Con la experiencia adecuada y siguiendo cuidadosamente el protocolo proporcionado, no prevemos ninguna dificultad para que otros cirujanos realicen este procedimiento. Con práctica, un cirujano experto puede completar el procedimiento en 15-20 minutos. Si el experimento lo permite, también se puede reducir el tiempo por animal dejando intactas las suturas superior e inferior del CCA, renunciando a la reparación del lugar de la inyección. Sin embargo, como se señaló anteriormente, se han documentado diferencias específicas de la cepa en la anatomía vascular cerebral y es importante verificar que la cepa del ratón utilizada en el procedimiento pueda tolerar esto antes de comenzar el experimento.
Al tratarse de un procedimiento quirúrgico, hay que tener en cuenta la recuperación de los ratones. La tolerancia al estrés y la recuperación de la herida son consideraciones importantes que variarán con las diferentes cepas de ratones. Además, la inflamación en el sitio quirúrgico y la formación de tejido cicatricial pueden aumentar el tiempo de recuperación después de cirugías repetidas. Hemos realizado con éxito múltiples inyecciones con 7 días de diferencia, pero si son necesarias inyecciones más frecuentes, deben evaluarse cuidadosamente en las cepas específicas de ratón que se van a utilizar. El manejo enérgico y la tensión en el CCA (durante el aislamiento, el atado y la extracción de suturas y la inyección) pueden dañar y debilitar las paredes arteriales, lo que provoca desgarros durante las inyecciones repetidas. Es importante minimizar la disección del tejido conectivo de soporte alrededor de la CCA y la bifurcación y abstenerse de aplicar una tensión excesiva a la arteria.
Nuestros resultados sugieren que, en este modelo en particular, la ligadura o reparación de CCA con circulación restaurada después de la inyección no difiere en la frecuencia general de localización o distribución de BM-hMSC inyectadas a través de los tumores intracraneales. Si bien esto puede variar en diferentes cepas de ratones, el uso de la reparación en el lugar de la inyección ofrece la ventaja de devolver el flujo sanguíneo a la arteria inyectada, lo que permite inyecciones posteriores en la misma arteria y, lo que es más importante, se asemeja a las inyecciones intracarótidas en pacientes humanos. La elección de ligar frente a reparar la arteria inyectada se basa en el tipo de experimento y en el modelo de ratón que se utilice. Si se necesita una segunda inyección, o si el modelo de ratón no tiene un Círculo de Willis completo, se debe utilizar la reparación del sitio de inyección. La capacidad de reinyectar el CCA en modelos de ratón puede facilitar la manipulación experimental adicional. Por ejemplo, para probar múltiples dosis de un posible tratamiento administrado a lo largo del tiempo, la reparación de la arteria inyectada es esencial para realizar inyecciones posteriores. Este método también sería útil en experimentos que impliquen la inyección de combinaciones de agentes terapéuticos que deben inyectarse en diferentes momentos. El aumento de la flexibilidad en las inyecciones intracarotídeas que ofrece la reparación de la arteria inyectada mejora la utilidad traslacional de los modelos de tumores cerebrales de ratón.
Los autores no tienen divulgaciones ni conflictos de intereses relevantes.
Este estudio fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer (R01CA115729, R01CA214749 y 1P50 CA127001) y por las generosas contribuciones filantrópicas al Programa™ Moon Shots del Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas, la Fundación Broach para la Investigación del Cáncer Cerebral, el Fondo de la Familia Elias para la Investigación de Tumores Cerebrales, el Fondo de Investigación del Cáncer Priscilla Hiley, el Fondo de Investigación del Cáncer Cerebral Curefest de la Familia Bauman, Chuanwei Lu Fund, The Sweet Family Brain Cancer Research Fund, The Ira Schneider Memorial Cancer Research Foundation, The Jim & Pam Harris Fund, The Gene Pennebaker Fund for Brain Cancer Research, Sorenson Fund for Brain Tumor Research, Brian McCulloch Memorial Fund, TLC Foundation from the Heart y Mary Harris Pappas Endowed Fund for Glioblastoma Research, todos a F.F.L.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL syringes (low dead space) | Air-tite Products Co. | A1 | |
26 G; 1/2" needle | Air-tite Products Co. | N2612 | |
33 G; 1/2" needle | JBP, Air-tite Products Co. | JBP3313B | |
3 cm Petri dish | Falcon, Fisher Scientific | 08-772A | |
3M durapore surgical tape | Fisher Scientific | 19-071-152 | |
6-0 suture thread | Fine Science Tools | 18020-60 | |
70% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
9-0 microsurgical suture with needle | Fine Science Tools | 12052-09 | |
Analgesic for major surgery | |||
Artificial tears/ophthalmic ointment | Covetrus | 8897 | |
Bead Sterilizer | Fisher Scientific | 14-955-341 | |
Betadine/Chlorhexidine | McKesson, Fisher Scientific | NC1696484 | |
Blunt hook retractor | Fine Science Tools | 17022-13 | |
Dissecting microscope | Zeiss Microscopy, LLC | 491903-0010-000 | |
Electric heating pad | Insource, Fisher Scientific | NC0667724 | |
Extra narrow scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Fine forceps - Dumont #5 forceps with micro-blunted tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
Fine forceps - Dumont #5/45 angled tip forceps with micro-blunted tips | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Isoflurane vaporizer (or Ketamine/Xylazine cocktail) | Kent Scientific | VetFlo-1231 | |
Light source | Laxco, Fisher Scientific | AMPSILED21 | |
Mouse anesthesia nose cone | Braintree Scientific, Inc | XENO- M | |
Needle driver | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Sterile cotton swabs | Texwipe, Fisher Scientific | 18-366-472 | |
Sterile gauze pads | Covidien, Fisher Scientific | 22-037-907 | |
Sterile saline (0.9%) | KD Medical, Fisher Scientific | 50-103-1363 | |
Sterile surgical drapes | Fisher Scientific | 50-129-6666 | |
Sterile surgical/downdraft table | |||
Sterile suture pack (any suitable diameter for mouse wound closure) | Ethicon, Fisher Scientific | 50-209-2811 | |
Surgical tools | |||
Vinyl lab tape | Fisher Scientific | 15-901 |
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos
Solicitar permisoThis article has been published
Video Coming Soon
ACERCA DE JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados