El efecto de la decocción antifatiga sobre los comportamientos e indicadores serológicos en un modelo de rata de fatiga central

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar los efectos de la decocción antifatiga (AFD) sobre la fatiga central en ratas modelado por el método modificado de múltiples plataformas (MMPM) mediante el monitoreo de sus respuestas conductuales y marcadores serológicos.

Resumen

Este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos de la decocción antifatiga (AFD) contra la fatiga central mediante la observación de los comportamientos e indicadores serológicos de ratas modelados por el método modificado de plataformas múltiples (MMPM) después de la intervención farmacológica. Se utilizaron mediciones de la fuerza de agarre para evaluar la fuerza muscular de las ratas. La prueba de campo abierto se utilizó para evaluar el comportamiento similar a la ansiedad, mientras que la prueba del laberinto acuático de Morris se realizó para evaluar la función de memoria de las ratas. Después de las evaluaciones conductuales, se recolectaron muestras de suero de rata para medir las concentraciones de corticosterona (CORT) y ácido láctico (LAC). La concentración de LAC se determinó mediante el método colorimétrico, mientras que la concentración de CORT se midió mediante el método de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA). En comparación con el grupo de control en blanco, siguiendo el modelo MMPM, las ratas mostraron reducciones significativas en la fuerza de agarre y una capacidad de memoria deteriorada. El análisis de suero reveló un aumento de los niveles de LAC y CORT en las ratas del grupo modelo. La AFD puede revertir notablemente estos cambios adversos hasta cierto punto. Estos hallazgos ponen de manifiesto los efectos positivos de AFD y coenzima Q10 sobre las capacidades físicas y cognitivas y las alteraciones en los niveles séricos de biomarcadores de ratas con fatiga central.

Introducción

La fatiga es un fenómeno multifacético e inespecífico que suele caracterizarse por sentimientos de cansancio y disminución de la capacidad para funcionar¹. Se puede clasificar como fatiga periférica, que ocurre a nivel muscular, o fatiga central, originada en el sistema nervioso central ^3,4. La fatiga central prolongada puede contribuir significativamente a los problemas psicológicos, como ansiedad, depresión, angustia psicológica y problemas de memoria ^5,6. A pesar de causar una angustia significativa, existe una escasez de medicamentos específicos dirigidos a la fatiga central⁷. Si bien el metilfenidato, un estimulante del sistema nervioso central, puede proporcionar un alivio temporal, sus efectos secundarios, como el insomnio y las palpitaciones, pueden empeorar^{la afección.}

En aplicaciones clínicas anteriores, la medicina tradicional china ha mostrado resultados prometedores en el tratamiento de la fatiga central, incorporando enfoques como las decocciones orales, la acupuntura y el Tai Chi 10,11,12. La decocción antifatiga (AFD) es una fórmula eficaz desarrollada por el profesor Li Feng basada en una amplia experiencia clínica y ha demostrado efectos terapéuticos positivos. Está formado por Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) y Dendrobium officinale (Shihu), en una proporción de 15: 15: 10: 5: 7: 8. La decocción de AFD se concentró a 110 mL después de hervir con diez veces el volumen de agua desionizada durante 1 h tres veces. En un estudio previo, establecimos un modelo animal de fatiga central utilizando el Método Modificado de Múltiples Plataformas (MMPM) y confirmamos la manifestación de fatiga central a través de evaluaciones conductuales y de neurotransmisores del sistema nervioso central¹³. En este estudio, utilizamos la intervención de AFD en el modelo animal de fatiga central para evaluar sus efectos farmacológicos a través de evaluaciones conductuales.

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Protocolo

Este trabajo de investigación se adhiere a las pautas éticas para el bienestar animal. Se mantuvieron las condiciones adecuadas de cuidado y alojamiento para garantizar la salud y el bienestar de los animales, y todos los procedimientos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Medicina China de Beijing (BUCM-4-2019041504-2094).

1. Cría y agrupación de animales

NOTA: A lo largo del estudio, el bienestar animal se mantuvo siguiendo los principios de las 3R (Reducción, Refinamiento y Reemplazo).

1. Para este estudio, seleccionó 54 ratas Wistar libres de patógenos específicos (SPF) de seis semanas de edad con un peso corporal de 210 g ± 10 g.
2. Alojar las ratas en el animalario en condiciones controladas: temperatura de 23 ± 2 °C, humedad relativa del 50% y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. Permita que los animales se aclimaten durante 3 días antes del experimento.
3. Divida aleatoriamente las ratas en un grupo de control en blanco (etiquetado como "a" en las figuras), un grupo modelo (etiquetado como "b" en las figuras), un grupo de dosis baja de AFD (AFD-L; marcado como "c" en las figuras), un grupo de dosis media de AFD (AFD-M; marcado como "d" en las figuras), un grupo de dosis alta de AFD (AFD-H; marcado como "e" en las figuras), un grupo de coenzima Q10 (CoQ10; marcado como "f" en las figuras), con 9 ratas en cada grupo, utilizando un método de tabla de números aleatorios.

2. Modelado e intervención

NOTA: El establecimiento de este modelo se basó en la literatura previa¹³.

1. Utilice la caja de modelado hecha por él mismo (proporcionada por el Laboratorio de Neuroinmunología de la Universidad de Medicina China de Beijing).
   NOTA: La caja de modelismo tiene una longitud de 110 cm, un ancho de 60 cm y una altura de 40 cm. La parte inferior se fija con 15 plataformas circulares (diámetro 6,5 cm, altura 8 cm). El espaciado horizontal entre las dos plataformas es de 13 cm y el espaciado vertical es de 10 cm. La caja de campo abierto tiene una longitud, anchura y altura de 100 cm, 100 cm y 35 cm, respectivamente. La parte inferior es negra y la pared es azul oscuro. La parte inferior de la caja de campo abierto está dividida en 25 secciones cuadradas con dimensiones de 25 cm, con los 9 cuadrados centrales designados como zona central y los 16 cuadrados exteriores como zona periférica.
2. Asegúrese de que el nivel del agua de la piscina esté aproximadamente 1 cm por encima de la plataforma y que la temperatura del agua se mantenga entre 23 ± 2 °C.
3. Una vez que comience el experimento, coloque la rata en la caja cubierta con una malla de alambre en la superficie y presiónela con pesas para evitar que los animales escapen. Suspenda suficiente comida debajo de la malla de alambre y proporcione agua potable limpia.
4. Coloque la rata en el grupo de modelos en la caja a las 18:00 todos los días y sáquela a las 8:00 del día siguiente. Después de cada sesión de modelado, seca la rata y colócala de nuevo en una jaula limpia. Realizar el modelado de forma continuada durante 21 días.
5. Durante el experimento, limpie la caja, cambie el agua diariamente y proporcione suficiente comida.
6. En el^15º día de modelado, administre los agentes a través de un lavado gástrico a las 10:00 a.m. todos los días durante un período continuo de 7 días.
   1. Administrar el grupo AFD-L a una dosis de 3,24 g/kg/d, el grupo AFD-M a 6,48 g/kg/d y el grupo AFD-H a 12,96 g/kg/d. Administrar coenzima Q10 a una dosis de 10 mg/kg/d.
   2. Al administrar los agentes a través de lavado gástrico, prepare una suspensión mezclando la dosis requerida en agua destilada. El volumen de administración para cada grupo es de 10 mL/kg. Dé a los grupos de piezas en blanco y modelos la misma cantidad de agua destilada.
      NOTA: Las dosis administradas a las ratas se calcularon utilizando el método del área de superficie corporal (ASC) y se convirtieron de acuerdo con las dosis terapéuticas normales para humanos¹⁴.

3. Evaluaciones conductuales

1. Fuerza de agarre de las ratas
   1. Agarra la cola de la rata y colócala suavemente en el medidor de fuerza de agarre.
   2. Tire de la rata hacia atrás con una fuerza uniforme mientras se asegura de que el sistema informático registre correctamente los datos.
      NOTA: Antes de los experimentos, los técnicos estaban capacitados para manejar las ratas y aplicar la fuerza de manera consistente.
   3. Repita este proceso tres veces y calcule el promedio de las tres mediciones como el valor final de la fuerza de agarre.
      NOTA: Para minimizar los errores causados por factores humanos, permita que una persona realice todo el experimento.
2. Ensayo de campo abierto en ratas
   1. Realice los experimentos de comportamiento en un ambiente tranquilo y con poca luz. Antes del inicio de cada experimento, coloque a las ratas en la sala de comportamiento durante 1 h de adaptación.
   2. Asegúrese de que tres experimentadores estén involucrados en la operación y use ropa negra cuando coloque o guíe a las ratas. A lo largo del experimento, asegúrese de que los experimentadores no crucen los límites de la caja con el cuerpo o los brazos.
   3. Abra el software de análisis.
      1. Haga clic en Archivo en el menú superior y seleccione Nuevo experimento para crear un nuevo proyecto. En la configuración de la arena, elige la forma correspondiente a la arena donde se moverá la rata.
      2. Con el ratón, dibuja la arena en la pantalla. Calibra la cámara y guarda la configuración de la arena.
   4. Permita que un segundo experimentador, vestido con ropa negra, sostenga a la rata por la espalda, colóquela secuencialmente en el centro del área designada y retire rápidamente su mano.
   5. Inicie una nueva grabación. Establezca la duración de la grabación en 5 min.
   6. Después del período de observación de 5 minutos, retire rápidamente la rata de la caja de campo abierto y limpie sus heces. Use alcohol al 75% para limpiar la caja de campo abierto.
   7. Repite el proceso para todas las ratas.
   8. Observe y registre (1) la distancia total recorrida, (2) el número de cruces de la zona central: número de veces que las extremidades de la rata cruzan en los cuadrados de la cuadrícula central, y (3) el tiempo que pasa en la zona central, es decir, el tiempo que la rata pasa en los 9 cuadrados de la cuadrícula central.
3. Laberinto acuático de Morris en ratas
   1. Realice los experimentos de comportamiento en un ambiente tranquilo y con poca luz. Antes de comenzar cada experimento, coloque a las ratas en la sala de comportamiento durante 1 h de adaptación.
      NOTA: Las ratas se sometieron a 4 días de entrenamiento; Al^5º día, comenzó el experimento formal.
   2. Asegúrese de que el nivel del agua de la piscina esté aproximadamente 1 cm por encima de la plataforma y que la temperatura del agua se mantenga entre 23 ± 2 °C.
   3. Asegúrese de que tres experimentadores estén involucrados en la operación y use ropa negra cuando coloque o guíe a las ratas.
   4. Divide la piscina de agua en cuatro cuadrantes. Fije una plataforma en el medio del segundo cuadrante. Pega pedazos de papel de diferentes colores y formas en el centro de las paredes de cada cuadrante.
   5. Abra el software de análisis.
      1. Haga clic en Archivo en el menú superior y seleccione Nuevo experimento para crear un nuevo proyecto. En la configuración de la arena, elige la forma correspondiente a la arena donde se moverá la rata.
      2. Con el ratón, dibuja la arena en la pantalla. Calibra la cámara y guarda la configuración de la arena.
   6. Durante el período de aprendizaje, deje que otro experimentador coloque secuencialmente la rata frente a la pared de la piscina en cada cuadrante. El orden de colocación es diferente cada día de la siguiente manera:
      1. El primer día, coloque la rata en el siguiente orden: primer cuadrante, segundo cuadrante, tercer cuadrante, cuarto cuadrante.
      2. El segundo día, coloque la rata en el siguiente orden: segundo cuadrante, primer cuadrante, cuarto cuadrante, tercer cuadrante.
      3. Al tercer día, coloque la rata en el siguiente orden: cuarto cuadrante, tercer cuadrante, segundo cuadrante, primer cuadrante;
      4. Al cuarto día, coloque la rata en el siguiente orden: tercer cuadrante, primer cuadrante, cuarto cuadrante, segundo cuadrante.
   7. Si la rata no logra encontrar la plataforma dentro de los 120 s, guíala a la plataforma y permítele que permanezca en ella durante 10 s.
   8. Después de completar el experimento diario, deje que el tercer experimentador limpie el agua del cuerpo de la rata con una toalla y la seque con un secador de pelo. Realice esto en otra habitación para evitar interferencias de ruido.
   9. En el experimento formal, retira la plataforma y coloca a la rata en el tercer cuadrante. Registre la trayectoria del movimiento de la rata dentro de los 120 s.
   10. Observe y registre (1) el tiempo que pasó en el cuadrante donde se ubicó la plataforma, y (2) la latencia de escape, que es el tiempo que tarda la rata en llegar a la plataforma desde que ingresa a la piscina de agua por primera vez.

4. Análisis bioquímico del suero

1. Procesamiento de muestras
   NOTA: Se permitió un ayuno de comida, pero no de agua, el día antes de la degustación.
   1. Anestesiar a las ratas con una solución de pentobarbital sódico al 2% (p/v) mediante inyección intraperitoneal a 0,5 mL/100 g de peso corporal.
   2. Después de completar la anestesia, extraiga la sangre de la aorta abdominal utilizando un vaso de muestreo de sangre.
   3. Coloque la sangre entera a temperatura ambiente (RT) durante 2 h, luego centrifugue a 4 °C, 1522,38 x g durante 20 min para obtener suero. Alicuota y almacene el suero a -80 °C para su uso posterior.
2. Ensayo de ácido láctico (LAC)
   NOTA: La concentración de LAC se determinó mediante el método colorimétrico.
   1. Mezcle la solución de reserva enzimática y la solución de dilución enzimática en una proporción de volumen de 1:100 para preparar una solución de trabajo enzimática.
   2. Prepare el revelador de color de acuerdo con las instrucciones del kit.
   3. En un tubo en blanco, agregue 20 μL de agua destilada.
   4. En un tubo estándar, agregue 3 mmol/L de solución estándar.
   5. En un tubo de medición, añadir 20 μL de la muestra.
   6. Agregue 1 mL de solución de trabajo enzimática y 0.2 mL de revelador de color a cada tubo. Incubar a 37 °C durante 10 min y luego añadir 2 mL de la solución de parada.
   7. Transfiera 200 μL de la solución de reacción a una placa ELISA de 96 pocillos. Mida el valor de OD a 530 nm. Calcule la concentración de LAC en función de los valores de OD.
      NOTA: Concentración de LAC = (valor OD del pocillo de muestra - valor OD del pocillo en blanco)/( valor OD del pocillo estándar - valor OD del pocillo en blanco) x concentración de solución estándar x factor de relación de dilución.
3. Ensayo de corticosterona
   NOTA: Los kits de ELISA comprados comercialmente se utilizan para medir la concentración de cortisona en el suero de rata.
   1. Antes del experimento, diluya los anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) y solución de lavado para crear una solución de trabajo. Agregue muestras estándar con concentraciones de 0 nmol/L, 5 nmol/L, 15 nmol/L, 30 nmol/L, 60 nmol/L, 120 nmol/L y 240 nmol/L a la placa recubierta en volúmenes de 20 μL.
   2. Agregue las muestras de suero (20 μL) a los pocillos respectivos, seguido de la adición de 200 μL de conjugado enzimático. Agite bien el plato e incube durante 60 min.
   3. Deseche la solución de reacción y lave la placa tres veces con la solución de lavado (400 μL cada vez). Después de secar la placa en papel absorbente, agregue 100 μL del reactivo de color del sustrato a cada pocillo.
   4. Incubar la placa a RT durante 15 min, luego agregar 50 μL de la solución de parada a cada pocillo.
   5. Mida los valores de diámetro exterior de cada pozo a 450 nm. Utilice los valores de OD de los pocillos estándar para generar una curva estándar y, a continuación, utilícela para calcular las concentraciones de los pocillos de muestra.

5. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos utilizando una aplicación de software adecuada. Representar los datos de medición como media ± desviación estándar.
2. Si los datos siguieron una distribución normal y mostraron homogeneidad de varianzas, realice una prueba t independiente.
3. Si los datos seguían una distribución normal pero no tenían igualdad de varianzas, realice una prueba t aproximada.
4. Si los datos no siguieron una distribución normal, utilice pruebas no paramétricas para la comparación.
5. Utilice la prueba de chi-cuadrado de Pearson para el análisis de datos de enumeración/recuento.
   NOTA: Se eligió un nivel de significación de α = 0,05, donde P < 0,05 se denomina estadísticamente significativo.
6. Genere las cifras utilizando una aplicación de software adecuada.

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Resultados

En comparación con el grupo de control, las ratas del grupo modelo mostraron disminuciones significativas en la fuerza de agarre. Sin embargo, la administración de AFD a dosis bajas, medias y altas fue capaz de revertir este efecto de manera dependiente de la dosis, como se muestra en la Figura 1. Del mismo modo, el fármaco de control positivo también demostró la capacidad de revertir los cambios en la fuerza de agarre (Figura 1

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Discusión

La AFD está compuesta por Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) y Dendrobium officinale (Shihu), que se cree que tiene la función de vigorizar el bazo y dispersar la energía hepática estancada en la medicina tradicional china. Además, se considera que todas estas hierbas poseen un perfil de seguridad favorable y, por l...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone test kit	German DRG company	EIA4164	Step 4.3
Curve Expert 1.4 software	CurveExpert Professional	Version 1.4	For calculation in corticosterone assay
Ethovision software	Noldus Information Technology , Netherlands	Version 15	analysis software and video tracking system
Grip strength test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-ZL	Step 3.1
Lactic acid test kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute	A019-2-1	Step 4.2
Modified multiple platform method	Neuroimmunology Laboratory of Beijing University of Chinese Medicine	None	Step 2.1
Morris water maze test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-Morris	Step 3.3
Open field test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-KC	Step 3.2
Prism	GraphPad	Verson 8	For generating figures
SPSS 26.0	IBM	Verson 26.0	Statistical analysis
Wistar rats	SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd		license number: SCXK (Jing) 2019-0010