O efeito da decocção anti-fadiga sobre os comportamentos e indicadores sorológicos em um modelo de rato de fadiga central

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos da decocção anti-fadiga (AFD) na fadiga central em ratos modelados pelo método de plataforma múltipla modificado (MMPM), monitorando suas respostas comportamentais e marcadores sorológicos.

Resumo

Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da Decocção Anti-fadiga (AFD) contra a fadiga central, observando os comportamentos e indicadores sorológicos de ratos modelados pelo método de plataforma múltipla modificado (MMPM) após intervenção medicamentosa. Medidas de força de preensão foram utilizadas para avaliar a força muscular de ratos. O teste de campo aberto foi utilizado para avaliar o comportamento semelhante à ansiedade, enquanto o teste do labirinto aquático de Morris foi realizado para avaliar a função de memória dos ratos. Após as avaliações comportamentais, amostras de soro de ratos foram coletadas para medir as concentrações de corticosterona (CORT) e ácido lático (LAC). A concentração de LAC foi determinada pelo método colorimétrico, enquanto a concentração de CORT foi medida pelo método de ensaio imunoenzimático (ELISA). Em comparação com o grupo de controle em branco, seguindo a modelagem MMPM, os ratos exibiram reduções significativas na força de preensão e capacidade de memória prejudicada. A análise sérica revelou níveis aumentados de LAC e CORT nos ratos do grupo modelo. O AFD pode reverter visivelmente essas mudanças adversas até certo ponto. Esses achados destacam os efeitos positivos da AFD e da coenzima Q10 nas habilidades físicas e cognitivas e alterações nos níveis séricos de biomarcadores de ratos com fadiga central.

Introdução

A fadiga é um fenômeno multifacetado e inespecífico, tipicamente caracterizado por sentimentos de cansaço e redução da capacidade funcional¹. Pode ser classificada como fadiga periférica, que ocorre no nível muscular, ou fadiga central, originada no sistema nervoso central ^3,4. A fadiga central prolongada pode contribuir significativamente para problemas psicológicos, incluindo ansiedade, depressão, sofrimento psicológico e problemas de memória ^5,6. Apesar de causar sofrimento significativo, há escassez de medicamentos específicos direcionados à fadiga central⁷. Embora o metilfenidato, um estimulante do sistema nervoso central, possa proporcionar alívio temporário, seus efeitos colaterais, como insônia e palpitações, podem piorar o quadro ^8,9.

Em aplicações clínicas anteriores, a medicina tradicional chinesa mostrou resultados promissores no tratamento da fadiga central, incorporando abordagens como decocções orais, acupuntura e Tai Chi 10,11,12. A decocção anti-fadiga (AFD) é uma fórmula eficaz desenvolvida pelo Professor Li Feng com base em uma extensa experiência clínica e demonstrou efeitos terapêuticos positivos. É composto por Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) e Dendrobium officinale (Shihu), na proporção de 15: 15: 10: 5: 7: 8. A decocção AFD foi concentrada a 110 mL após fervura com dez vezes o volume de água deionizada por 1 h três vezes. Em um estudo anterior, estabelecemos um modelo animal de fadiga central usando o Método de Plataforma Múltipla Modificada (MMPM) e confirmamos a manifestação de fadiga central por meio de avaliações comportamentais e de neurotransmissores do sistema nervoso central¹³. Neste estudo, utilizamos a intervenção AFD no modelo animal de fadiga central para avaliar seus efeitos farmacológicos por meio de avaliações comportamentais.

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Protocolo

Este trabalho de pesquisa segue as diretrizes éticas para o bem-estar animal. As condições adequadas de cuidado e alojamento foram mantidas para garantir a saúde e o bem-estar dos animais, e todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM-4-2019041504-2094).

1. Criação e agrupamento de animais

NOTA: Ao longo do estudo, o bem-estar animal foi mantido seguindo os princípios dos 3Rs (Redução, Refinamento e Substituição).

1. Para este estudo, selecione 54 ratos Wistar livres de patógenos específicos (FPS) de seis semanas de idade com peso corporal de 210 g ± 10 g.
2. Alojar os ratos no biotério em condições controladas: temperatura de 23 ± 2 °C, humidade relativa de 50% e um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h. Deixe os animais se aclimatarem por 3 dias antes do experimento.
3. Divida aleatoriamente os ratos em um grupo de controle em branco (rotulado como "a" nas figuras), um grupo modelo (rotulado como "b" nas figuras), um grupo de baixa dose de AFD (AFD-L; rotulado como "c" nas figuras), um grupo de dose média de AFD (AFD-M; rotulado como "d" nas figuras), um grupo de alta dose de AFD (AFD-H; rotulado como "e" nas figuras), um grupo de coenzima Q10 (CoQ10; rotulado como "f" nas figuras), com 9 ratos em cada grupo, usando um método de tabela de números aleatórios.

2. Modelação e intervenção

NOTA: O estabelecimento desse modelo foi baseado na literatura anterior¹³.

1. Use a caixa de modelagem feita por você mesmo (fornecida pelo Laboratório de Neuroimunologia da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim).
   NOTA: A caixa de modelagem tem um comprimento de 110 cm, uma largura de 60 cm e uma altura de 40 cm. O fundo é fixado com 15 plataformas circulares (diâmetro 6,5 cm, altura 8 cm). O espaçamento horizontal entre as duas plataformas é de 13 cm e o espaçamento vertical é de 10 cm. A caixa de campo aberto tem comprimento, largura e altura de 100 cm, 100 cm e 35 cm, respectivamente. O fundo é preto e a parede é azul escura. A parte inferior da caixa de campo aberto é dividida em 25 seções quadradas com dimensões de 25 cm, com os 9 quadrados centrais designados como zona central e os 16 quadrados externos como zona periférica.
2. Certifique-se de que o nível da água na piscina esteja aproximadamente 1 cm acima da plataforma e que a temperatura da água seja mantida em 23 ± 2 °C.
3. Após o início do experimento, coloque o rato na caixa coberta com tela de arame na superfície e pressione-o com pesos para evitar que os animais escapem. Suspenda alimentos suficientes sob a tela de arame e forneça água potável.
4. Coloque o rato no grupo de modelos na caixa às 18:00 todos os dias e retire-o às 8:00 do dia seguinte. Após cada sessão de modelagem, seque o rato e coloque-o de volta em uma gaiola limpa. Execute a modelagem continuamente por 21 dias.
5. Durante o experimento, limpe a caixa, troque a água diariamente e forneça comida suficiente.
6. No^15º dia de modelagem, administrar os agentes via lavagem gástrica às 10:00 todos os dias por um período contínuo de 7 dias.
   1. Administre o grupo AFD-L na dosagem de 3,24 g / kg / d, o grupo AFD-M a 6,48 g / kg / d e o grupo AFD-H a 12,96 g / kg / d. Administre a coenzima Q10 na dosagem de 10 mg / kg / d.
   2. Ao administrar os agentes através da lavagem gástrica, prepare uma suspensão misturando a dose necessária em água destilada. O volume de administração para cada grupo é de 10 mL/kg. Dê aos grupos de branco e modelo a mesma quantidade de água destilada.
      NOTA: As doses administradas aos ratos foram calculadas pelo método da área de superfície corporal (BSA) e convertidas de acordo com as doses terapêuticas normais para humanos¹⁴.

3. Avaliações comportamentais

1. Força de preensão de ratos
   1. Segure a cauda do rato e coloque-a suavemente no medidor de força de preensão.
   2. Puxe o rato para trás com uma força uniforme, garantindo que o sistema de computador registre corretamente os dados.
      NOTA: Antes dos experimentos, os técnicos foram treinados para lidar com os ratos para aplicar força de forma consistente.
   3. Repita esse processo três vezes e calcule a média das três medições como o valor final da força de preensão.
      NOTA: Para minimizar erros causados por fatores humanos, deixe uma pessoa conduzir todo o experimento.
2. Teste de campo aberto em ratos
   1. Conduza os experimentos de comportamento em um ambiente mal iluminado e silencioso. Antes do início de cada experimento, coloque os ratos na sala de comportamento por 1 h de adaptação.
   2. Certifique-se de que três experimentadores estejam envolvidos na operação e use roupas pretas ao colocar ou guiar os ratos. Ao longo do experimento, certifique-se de que os experimentadores não cruzem os limites da caixa com seus corpos ou braços.
   3. Abra o software de análise.
      1. Clique em Arquivo no menu superior e selecione Novo experimento para criar um novo projeto. Nas configurações da arena, escolha a forma correspondente à arena para onde o rato se moverá.
      2. Usando o mouse, desenhe a arena na tela. Calibre a câmera e salve as configurações da arena.
   4. Permita que um segundo experimentador, vestido com roupas pretas, segure o rato pelas costas, coloque-o sequencialmente no centro da área designada e retire rapidamente a mão.
   5. Inicie uma nova gravação. Defina a duração da gravação para 5 min.
   6. Após o período de observação de 5 minutos, remova rapidamente o rato da caixa de campo aberto e limpe suas fezes. Use álcool 75% para limpar a caixa de campo aberto.
   7. Repita o processo para todos os ratos.
   8. Observe e registre (1) a distância total percorrida, (2) o número de cruzamentos da zona central: número de vezes que os membros do rato se cruzam nos quadrados da grade central e (3) o tempo gasto na zona central, ou seja, o tempo gasto pelo rato nos 9 quadrados da grade central.
3. Labirinto aquático de Morris em ratos
   1. Conduza os experimentos de comportamento em um ambiente mal iluminado e silencioso. Antes de iniciar cada experimento, coloque os ratos na sala de comportamento por 1 h de adaptação.
      NOTA: Os ratos foram submetidos a 4 dias de treinamento; No^5º dia, o experimento formal começou.
   2. Certifique-se de que o nível da água na piscina esteja aproximadamente 1 cm acima da plataforma e que a temperatura da água seja mantida em 23 ± 2 °C.
   3. Certifique-se de que três experimentadores estejam envolvidos na operação e use roupas pretas ao colocar ou guiar os ratos.
   4. Divida a piscina de água em quatro quadrantes. Fixe uma plataforma no meio do segundo quadrante. Prenda pedaços de papel de cores e formatos diferentes no centro das paredes de cada quadrante.
   5. Abra o software de análise.
      1. Clique em Arquivo no menu superior e selecione Novo experimento para criar um novo projeto. Nas configurações da arena, escolha a forma correspondente à arena para onde o rato se moverá.
      2. Usando o mouse, desenhe a arena na tela. Calibre a câmera e salve as configurações da arena.
   6. Durante o período de aprendizado, deixe outro experimentador colocar sequencialmente o rato de frente para a parede da piscina em cada quadrante. A ordem de colocação é diferente a cada dia da seguinte forma:
      1. No primeiro dia, coloque o rato na seguinte ordem: primeiro quadrante, segundo quadrante, terceiro quadrante, quarto quadrante.
      2. No segundo dia, coloque o rato na seguinte ordem: segundo quadrante, primeiro quadrante, quarto quadrante, terceiro quadrante.
      3. No terceiro dia, coloque o rato na seguinte ordem: quarto quadrante, terceiro quadrante, segundo quadrante, primeiro quadrante;
      4. No quarto dia, coloque o rato na seguinte ordem: terceiro quadrante, primeiro quadrante, quarto quadrante, segundo quadrante.
   7. Se o rato não conseguir encontrar a plataforma dentro de 120 s, guie-o até a plataforma e deixe-o permanecer nela por 10 s.
   8. Depois de completar o experimento diário, deixe o terceiro experimentador limpar a água do corpo do rato usando uma toalha e seque-a com um secador de cabelo. Execute isso em outra sala para evitar interferência de ruído.
   9. No experimento formal, remova a plataforma e coloque o rato no terceiro quadrante. Registre a trajetória de movimento do rato em 120 s.
   10. Observe e registre (1) o tempo gasto no quadrante onde a plataforma estava localizada e (2) a latência de escape, que é o tempo que leva para o rato chegar à plataforma para entrar na piscina de água pela primeira vez.

4. Análise bioquímica sérica

1. Processamento de amostras
   NOTA: Um jejum de comida, mas não água, foi permitido no dia anterior à amostragem.
   1. Anestesiar os ratos usando uma solução de pentobarbital sódico a 2% (p / v) por injeção intraperitoneal a 0,5 mL / 100 g de peso corporal.
   2. Após a anestesia completa, colete o sangue da aorta abdominal usando um vaso de coleta de sangue.
   3. Colocar todo o sangue à temperatura ambiente (RT) durante 2 h, depois centrifugar a 4 °C, 1522,38 x g durante 20 min para obter o soro. Aliquote e armazenar o soro a -80 °C para utilização posterior.
2. Ensaio de ácido láctico (LAC)
   NOTA: A concentração de LAC foi determinada pelo método colorimétrico.
   1. Misturar a solução de reserva enzimática e a solução de diluição enzimática numa proporção de 1:100 em volume para preparar uma solução de trabalho enzimática.
   2. Prepare o revelador de cores de acordo com as instruções do kit.
   3. Em um tubo em branco, adicione 20 μL de água destilada.
   4. Em um tubo padrão, adicione 3 mmol / L solução padrão.
   5. Em um tubo de medição, adicione 20 μL da amostra.
   6. Adicione 1 mL de solução de trabalho enzimática e 0,2 mL de revelador de cor a cada tubo. Incubar a 37 °C durante 10 min e, em seguida, adicionar 2 ml da solução de paragem.
   7. Transfira 200 μL da solução de reação para uma placa ELISA de 96 poços. Meça o valor OD a 530 nm. Calcule a concentração de LAC com base nos valores de OD.
      NOTA: Concentração LAC = (valor OD do poço de amostra - valor OD do poço em branco)/(valor OD do poço padrão - valor OD do poço em branco) x concentração da solução padrão x fator de razão de diluição.
3. Ensaio de corticosterona
   NOTA: Os kits ELISA adquiridos comercialmente são usados para medir a concentração de cortisona no soro de ratos.
   1. Antes do experimento, diluir os anticorpos conjugados com peroxidase de rábano (HRP) e solução de lavagem para criar uma solução de trabalho. Adicione amostras padrão com concentrações de 0 nmol/L, 5 nmol/L, 15 nmol/L, 30 nmol/L, 60 nmol/L, 120 nmol/L e 240 nmol/L à placa revestida em volumes de 20 μL.
   2. Adicionar as amostras de soro (20 μL) aos respectivos poços, seguido da adição de 200 μL de conjugado enzimático. Agite bem o prato e incube-o por 60 min.
   3. Descarte a solução de reação e lave a placa três vezes com a solução de lavagem (400 μL de cada vez). Depois de secar a placa em papel absorvente, adicione 100 μL do reagente de cor do substrato a cada poço.
   4. Incubar a placa em RT durante 15 min e, em seguida, adicionar 50 μL da solução de paragem a cada alvéolo.
   5. Meça os valores de OD de cada poço a 450 nm. Use os valores de OD dos poços padrão para gerar uma curva padrão e, em seguida, use-a para calcular as concentrações dos poços de amostra.

5. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas usando um aplicativo de software apropriado. Represente os dados de medição como média ± desvio padrão.
2. Se os dados seguiram uma distribuição normal e mostraram homogeneidade de variâncias, realizar um teste t independente.
3. Se os dados seguiram uma distribuição normal, mas não tiveram igualdade de variâncias, execute um teste t aproximado.
4. Se os dados não seguirem uma distribuição normal, use testes não paramétricos para comparação.
5. Use o teste qui-quadrado de Pearson para análise de dados de enumeração/contagem.
   NOTA: Optou-se por um nível de significância de α = 0,05, onde P < 0,05 é referido como estatisticamente significativo.
6. Gere as figuras usando um aplicativo de software apropriado.

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Resultados

Em comparação com o grupo controle, os ratos do grupo modelo exibiram reduções significativas na força de preensão. No entanto, a administração de AFD em doses baixas, médias e altas foi capaz de reverter esse efeito de maneira dose-dependente, conforme mostrado na Figura 1. Da mesma forma, o medicamento controle positivo também demonstrou a capacidade de reverter as alterações da força de preensão (Figura 1).

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Discussão

A AFD é composta por Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) e Dendrobium officinale (Shihu), que se acredita ter a função de revigorar o baço e dispersar a energia estagnada do fígado na medicina tradicional chinesa. Além disso, todas essas ervas são consideradas como possuidoras de um perfil de segurança favorável ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone test kit	German DRG company	EIA4164	Step 4.3
Curve Expert 1.4 software	CurveExpert Professional	Version 1.4	For calculation in corticosterone assay
Ethovision software	Noldus Information Technology , Netherlands	Version 15	analysis software and video tracking system
Grip strength test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-ZL	Step 3.1
Lactic acid test kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute	A019-2-1	Step 4.2
Modified multiple platform method	Neuroimmunology Laboratory of Beijing University of Chinese Medicine	None	Step 2.1
Morris water maze test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-Morris	Step 3.3
Open field test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-KC	Step 3.2
Prism	GraphPad	Verson 8	For generating figures
SPSS 26.0	IBM	Verson 26.0	Statistical analysis
Wistar rats	SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd		license number: SCXK (Jing) 2019-0010