Merkezi Yorgunluk Sıçan Modelinde Anti-Yorgunluk Kaynatmasının Davranışlar ve Serolojik Göstergeler Üzerine Etkisi

Özet

Burada, hem davranışsal tepkilerini hem de serolojik belirteçlerini izleyerek modifiye çoklu platform yöntemi (MMPM) ile modellenen sıçanlarda yorgunluk önleyici kaynatma (AFD) in merkezi yorgunluk üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Bu çalışmada, modifiye çoklu platform yöntemi (MMPM) ile modellenen sıçanların ilaç müdahalesi sonrası davranışlarını ve serolojik göstergelerini gözlemleyerek Anti-yorgunluk Kaynatma (AFD) uygulamasının santral yorgunluğa karşı etkilerini değerlendirmek amaçlanmıştır. Sıçanların kas gücünü değerlendirmek için kavrama gücü ölçümleri kullanıldı. Anksiyete benzeri davranışları değerlendirmek için açık alan testi kullanılırken, sıçanların hafıza fonksiyonunu değerlendirmek için Morris su labirenti testi yapıldı. Davranışsal değerlendirmelerin ardından, kortikosteron (CORT) ve laktik asit (LAC) konsantrasyonlarını ölçmek için sıçan serum örnekleri toplandı. LAK konsantrasyonu kolorimetrik yöntem kullanılarak belirlenirken, CORT konsantrasyonu enzime bağlı immünosorbent assay (ELISA) yöntemi kullanılarak ölçüldü. Boş kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, MMPM modellemesini takiben, sıçanlar kavrama kuvvetinde önemli azalmalar ve hafıza yeteneğinde bozulma sergiledi. Serum analizi, model grubu sıçanlarda artmış LAC ve CORT seviyelerini ortaya çıkardı. AFD, bu olumsuz değişiklikleri bir dereceye kadar gözle görülür şekilde tersine çevirebilir. Bu bulgular, AFD ve koenzimQ10'un merkezi yorgunluk sıçanlarının fiziksel ve bilişsel yetenekleri ve serum biyobelirteç seviyelerindeki değişiklikler üzerindeki olumlu etkilerini vurgulamaktadır.

Giriş

Yorgunluk, tipik olarak yorgunluk hissi ve işlev görme yeteneğinin azalması ile karakterize edilen çok yönlü ve spesifik olmayan bir olgudur¹. Kas seviyesinde meydana gelen periferik yorgunluk veya merkezi sinir sisteminden kaynaklanan merkezi yorgunluk olarak sınıflandırılabilir ^3,4. Uzun süreli merkezi yorgunluk, anksiyete, depresyon, psikolojik sıkıntı ve hafıza sorunları dahil olmak üzere psikolojik sorunlara önemli bir katkıda bulunabilir ^5,6. Önemli bir sıkıntıya neden olmasına rağmen, merkezi yorgunluğu hedefleyen spesifik ilaçların kıtlığı vardır⁷. Merkezi sinir sistemi uyarıcısı olan metilfenidat geçici bir rahatlama sağlayabilirken, uykusuzluk ve çarpıntı gibi yan etkileri durumu kötüleştirebilir ^8,9.

Önceki klinik uygulamalarda, geleneksel Çin tıbbı, oral kaynatma, akupunktur ve Tai Chi^10,11,12 gibi yaklaşımları içeren merkezi yorgunluğun tedavisinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Yorgunluk önleyici kaynatma (AFD), Profesör Li Feng tarafından kapsamlı klinik deneyime dayanarak geliştirilen etkili bir formüldür ve olumlu terapötik etkiler göstermiştir. Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) ve Dendrobium officinale'den (Shihu) oluşur, 15: 15: 10: 5: 7: 8 oranında. AFD kaynatma, 1 saat üç kez deiyonize su hacminin on katı ile kaynatıldıktan sonra 110 mL'ye konsantre edildi. Önceki bir çalışmada, Modifiye Çoklu Platform Yöntemini (MMPM) kullanarak merkezi yorgunluğun bir hayvan modelini oluşturduk ve davranışsal ve merkezi sinir sistemi nörotransmitter değerlendirmeleri yoluyla merkezi yorgunluğun tezahürünü doğruladık¹³. Bu çalışmada, davranışsal değerlendirmeler yoluyla farmakolojik etkilerini değerlendirmek için merkezi yorgunluğun hayvan modelinde AFD müdahalesini kullandık.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu araştırma çalışması, hayvan refahı için etik kurallara bağlıdır. Hayvanların sağlığını ve refahını sağlamak için uygun bakım ve barınma koşulları sağlandı ve tüm prosedürler Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylandı (BUCM-4-2019041504-2094).

1. Hayvan yetiştirme ve gruplandırma

NOT: Çalışma boyunca, 3R (Azaltma, İyileştirme ve Değiştirme) ilkelerine göre hayvan refahı sağlandı.

1. Bu çalışma için, vücut ağırlığı 210 g ± 10 g olan 54 altı haftalık spesifik patojen içermeyen (SPF) Wistar sıçanını seçin.
2. Fareleri hayvan barınağında kontrollü koşullar altında barındırın: 23 ± 2 °C sıcaklık, %50 bağıl nem ve 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü. Deneyden önce hayvanların 3 gün iklimlendirmesine izin verin.
3. Sıçanları rastgele olarak boş bir kontrol grubuna (şekillerde "a" olarak etiketlenmiştir), bir model grubuna (şekillerde "b" olarak etiketlenmiştir), bir AFD-düşük doz (AFD-L; şekillerde "c" olarak etiketlenmiştir) grubuna, bir AFD-orta doz (AFD-M; şekillerde "d" olarak etiketlenmiştir) grubuna, bir AFD-yüksek doz (AFD-H; şekillerde "e" olarak etiketlenmiştir) grubuna bölün, bir Koenzim Q10 (CoQ10; şekillerde "f" olarak etiketlenmiştir) grubu, her grupta 9 sıçan ile, rastgele sayı tablosu yöntemi kullanılarak.

2. Modelleme ve müdahale

NOT: Bu modelin kurulması önceki literatüre^{dayanmaktadır 13}.

1. Kendi kendine yapılan modelleme kutusunu kullanın (Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi Nöroimmünoloji Laboratuvarı tarafından sağlanır).
   NOT: Modelleme kutusu 110 cm uzunluğa, 60 cm genişliğe ve 40 cm yüksekliğe sahiptir. Alt kısım 15 dairesel platformla (çap 6,5 cm, yükseklik 8 cm) sabitlenmiştir. İki platform arasındaki yatay aralık 13 cm, dikey aralık ise 10 cm'dir. Açık alan kutusunun uzunluğu 100 cm, genişliği ve yüksekliği sırasıyla 100 cm, 100 cm ve 35 cm'dir. Alt kısım siyah ve duvar koyu mavidir. Açık alan kutusunun alt kısmı, 25 cm boyutlarında 25 kare bölüme ayrılmıştır, ortadaki 9 kare merkezi bölge ve dıştaki 16 kare çevresel bölge olarak belirlenmiştir.
2. Havuzdaki su seviyesinin platformun yaklaşık 1 cm üzerinde olduğundan ve su sıcaklığının 23 ± 2 °C'de tutulduğundan emin olun.
3. Deney başladıktan sonra, fareyi yüzeyi tel örgü ile kaplı kutuya yerleştirin ve hayvanların kaçmasını önlemek için ağırlıklarla bastırın. Tel örgünün altına yeterli miktarda yiyecek asın ve temiz içme suyu sağlayın.
4. Her gün saat 18:00'de kutudaki model grubuna fareyi yerleştirin ve ertesi gün saat 8:00'de çıkarın. Her modelleme seansından sonra, fareyi kurutun ve temiz bir kafese geri koyun. Modellemeyi 21 gün boyunca sürekli olarak gerçekleştirin.
5. Deney sırasında kutuyu temizleyin, suyu günlük olarak değiştirin ve yeterli yiyecek sağlayın.
6. Modellemenin 15^. gününde, ajanları 7 gün boyunca sürekli olarak her gün saat 10:00'da mide lavajı yoluyla uygulayın.
   1. AFD-L grubunu 3.24 g / kg / gün, AFD-M grubunu 6.48 g / kg / gün ve AFD-H grubunu 12.96 g / kg / gün dozunda uygulayın. Koenzim Q10'u 10 mg / kg / gün'lük bir dozda uygulayın.
   2. Ajanları gastrik lavaj yoluyla uygularken, gerekli dozu damıtılmış suda karıştırarak bir süspansiyon hazırlayın. Her grup için uygulama hacmi 10 mL / kg'dır. Boşluğa ve model gruplarına aynı miktarda damıtılmış su verin.
      NOT: Sıçanlara uygulanan dozajlar, vücut yüzey alanı (BSA) yöntemi kullanılarak hesaplandı ve insanlar için normal terapötik dozajlara göre dönüştürüldü¹⁴.

3. Davranışsal değerlendirmeler

1. Sıçanların kavrama gücü
   1. Farenin kuyruğunu kavrayın ve yavaşça kavrama gücü ölçere yerleştirin.
   2. Bilgisayar sisteminin verileri doğru bir şekilde kaydettiğinden emin olurken fareyi düzgün bir kuvvetle geriye doğru çekin.
      NOT: Deneylerden önce, teknisyenler fareleri tutarlı bir şekilde kuvvet uygulamak için idare etmek üzere eğitildi.
   3. Bu işlemi üç kez tekrarlayın ve üç ölçümün ortalamasını nihai kavrama gücü değeri olarak hesaplayın.
      NOT: İnsan faktörlerinden kaynaklanan hataları en aza indirmek için, tüm deneyi bir kişinin yapmasına izin verin.
2. Sıçanlarda açık alan testi
   1. Davranış deneylerini loş ışıklı ve sessiz bir ortamda gerçekleştirin. Her deneyin başlamasından önce, fareleri 1 saatlik adaptasyon için davranış odasına yerleştirin.
   2. Operasyonda üç deneycinin yer aldığından emin olun ve fareleri yerleştirirken veya yönlendirirken siyah giysiler giyin. Deney boyunca, deneycilerin bedenleri veya kollarıyla kutunun sınırlarını geçmediklerinden emin olun.
   3. Analiz yazılımını açın.
      1. Üst menüde Dosya'ya tıklayın ve yeni bir proje oluşturmak için Yeni Deneme'yi seçin. Arena Ayarları'nda, farenin hareket edeceği arenaya karşılık gelen şekli seçin.
      2. Fareyi kullanarak arenayı ekrana çizin. Kamerayı kalibre edin ve arena ayarlarını kaydedin .
   4. Siyah giysiler giymiş ikinci bir deneycinin fareyi sırtından tutmasına izin verin, sırayla belirlenen alanın ortasına yerleştirin ve elini hızla geri çekin.
   5. Yeni bir kayıt başlatın. Kayıt süresini 5 dk olarak ayarlayın.
   6. 5 dakikalık gözlem süresinden sonra, fareyi açık alan kutusundan hızla çıkarın ve dışkısını temizleyin. Açık alan kutusunu temizlemek için %75 alkol kullanın.
   7. İşlemi tüm fareler için tekrarlayın.
   8. (1) taşınan toplam mesafeyi, (2) merkezi bölge geçişlerinin sayısını: sıçanın uzuvlarının merkezi ızgara karelerine geçme sayısını ve (3) merkezi bölgede geçirilen zamanı, yani sıçanın 9 merkezi ızgara karesinde geçirdiği zamanı gözlemleyin ve kaydedin.
3. Sıçanlarda Morris su labirenti
   1. Davranış deneylerini loş ışıklı ve sessiz bir ortamda gerçekleştirin. Her deneye başlamadan önce, fareleri 1 saatlik adaptasyon için davranış odasına yerleştirin.
      NOT: Sıçanlara 4 eğitim günü uygulandı; 5^{. günde} , resmi deney başladı.
   2. Havuzdaki su seviyesinin platformun yaklaşık 1 cm üzerinde olduğundan ve su sıcaklığının 23 ± 2 °C'de tutulduğundan emin olun.
   3. Operasyonda üç deneycinin yer aldığından emin olun ve fareleri yerleştirirken veya yönlendirirken siyah giysiler giyin.
   4. Su havuzunu dört çeyreğe bölün. İkinci çeyreğin ortasına bir platform sabitleyin. Her kadranın duvarlarının ortasına farklı renkli ve şekilli kağıt parçaları yapıştırın.
   5. Analiz yazılımını açın.
      1. Üst menüde Dosya'ya tıklayın ve yeni bir proje oluşturmak için Yeni Deneme'yi seçin. Arena Ayarları'nda, farenin hareket edeceği arenaya karşılık gelen şekli seçin.
      2. Fareyi kullanarak arenayı ekrana çizin. Kamerayı kalibre edin ve arena ayarlarını kaydedin .
   6. Öğrenme süresi boyunca, başka bir deneycinin fareyi her kadranda havuz duvarına bakacak şekilde sırayla yerleştirmesine izin verin. Yerleştirme sırası her gün aşağıdaki gibi farklıdır:
      1. İlk gün, fareyi şu sırayla yerleştirin: birinci kadran, ikinci kadran, üçüncü kadran, dördüncü kadran.
      2. İkinci gün, fareyi şu sırayla yerleştirin: ikinci kadran, birinci kadran, dördüncü kadran, üçüncü kadran.
      3. Üçüncü gün, fareyi aşağıdaki sıraya göre yerleştirin: dördüncü kadran, üçüncü kadran, ikinci kadran, birinci kadran;
      4. Dördüncü günde, fareyi aşağıdaki sıraya göre yerleştirin: üçüncü kadran, birinci kadran, dördüncü kadran, ikinci kadran.
   7. Sıçan platformu 120 saniye içinde bulamazsa, onu platforma yönlendirin ve 10 saniye boyunca üzerinde kalmasına izin verin.
   8. Günlük deneyi tamamladıktan sonra, üçüncü deneycinin farenin vücudundaki suyu bir havlu kullanarak silmesine ve saç kurutma makinesi ile kurulamasına izin verin. Gürültü girişimini önlemek için bunu başka bir odada gerçekleştirin.
   9. Resmi deneyde, platformu çıkarın ve fareyi üçüncü çeyreğe yerleştirin. Farenin hareket yörüngesini 120 saniye içinde kaydedin.
   10. (1) Platformun bulunduğu kadranda geçirilen süreyi ve (2) sıçanın su havuzuna ilk kez girdikten sonra platforma ulaşması için geçen süre olan kaçış gecikmesini gözlemleyin ve kaydedin.

4. Serum biyokimyasal analizi

1. Numune işleme
   NOT: Örneklemeden bir gün önce yemek orucuna izin verildi, ancak su tutulmadı.
   1. Sıçanları, 0.5 mL / 100 g vücut ağırlığında intraperitoneal enjeksiyon yoluyla% 2 (a / h) sodyum pentobarbital çözelti kullanarak anestezi altına alın.
   2. Tam anesteziden sonra, bir kan örnekleme kabı kullanarak kanlarını abdominal aorttan toplayın.
   3. Tam kanı 2 saat oda sıcaklığında (RT) bekletin, ardından serum elde etmek için 4 ° C, 1522.38 x g'da 20 dakika santrifüjleyin. Aliquote yapın ve daha sonra kullanmak üzere serumu -80 °C'de saklayın.
2. Laktik asit (LAC) testi
   NOT: LAC konsantrasyonu kolorimetrik yöntem kullanılarak belirlendi.
   1. Bir enzim çalışma çözeltisi hazırlamak için enzim rezerv çözeltisini ve enzim seyreltme çözeltisini 1:100 hacim oranında karıştırın.
   2. Renk geliştiriciyi kitteki talimatlara göre hazırlayın.
   3. Boş bir tüpe 20 μL damıtılmış su ekleyin.
   4. Standart bir tüpe 3 mmol / L standart çözelti ekleyin.
   5. Bir ölçüm tüpüne 20 μL numune ekleyin.
   6. Her tüpe 1 mL enzim çalışma solüsyonu ve 0.2 mL renk geliştirici ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve ardından 2 mL durdurma çözeltisi ekleyin.
   7. Reaksiyon çözeltisinin 200 μL'sini 96 oyuklu bir ELISA plakasına aktarın. OD değerini 530 nm'de ölçün. OD değerlerine göre LAC konsantrasyonunu hesaplayın.
      NOT: LAC konsantrasyonu = (numune kuyusu OD değeri - boş kuyu OD değeri)/( standart kuyu OD değeri - boş kuyu OD değeri) x standart çözelti konsantrasyonu x seyreltme oranı faktörü.
3. Kortikosteron testi
   NOT: Ticari olarak satın alınan ELISA kitleri, sıçan serumundaki kortizon konsantrasyonunu ölçmek için kullanılır.
   1. Deneyden önce, çalışan bir çözelti oluşturmak için yaban turpu peroksidaz (HRP) ve yıkama çözeltisi ile konjuge edilmiş antikorları seyreltin. 0 μL, 5 nmol/L, 15 nmol/L, 30 nmol/L, 60 nmol/L, 120 nmol/L ve 240 nmol/L konsantrasyonlarına sahip standart numuneleri 20 μL hacimlerde kaplanmış plakaya ekleyin.
   2. Serum örneklerini (20 μL) ilgili kuyucuklara ekleyin, ardından 200 μL enzim konjugatı ekleyin. Plakayı iyice çalkalayın ve 60 dakika inkübe edin.
   3. Reaksiyon solüsyonunu atın ve plakayı yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın (her seferinde 400 μL). Plakayı emici kağıt üzerinde kuruttuktan sonra, her bir oyuğa 100 μL alt tabaka renk reaktifi ekleyin.
   4. Plakayı RT'de 15 dakika inkübe edin, ardından her bir oyuğa 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin.
   5. Her kuyucuğun OD değerlerini 450 nm'de ölçün. Standart bir eğri oluşturmak için standart kuyucukların OD değerlerini kullanın ve ardından bunu numune kuyucuklarının konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanın.

5. İstatistiksel analiz

1. Uygun bir yazılım uygulaması kullanarak istatistiksel analiz yapın. Ölçüm verilerini ortalama ± standart sapma olarak temsil edin.
2. Veriler normal bir dağılım izlediyse ve varyansların homojenliğini gösteriyorsa, bağımsız bir t-testi yapın.
3. Veriler normal bir dağılım izlediyse ancak varyans eşitliğine sahip değilse, yaklaşık bir t-testi yapın.
4. Veriler normal bir dağılım izlemediyse, karşılaştırma için parametrik olmayan testler kullanın.
5. Numaralandırma/sayım veri analizi için Pearson'ın ki-kare testini kullanın.
   NOT: α = 0.05 anlamlılık düzeyi seçilmiştir, burada P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak adlandırılmıştır.
6. Uygun bir yazılım uygulaması kullanarak rakamları oluşturun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubundaki sıçanlar kavrama gücünde önemli düşüşler sergiledi. Bununla birlikte, AFD'nin düşük, orta ve yüksek dozlarda uygulanması, Şekil 1'de gösterildiği gibi, bu etkiyi doza bağlı bir şekilde tersine çevirebildi. Benzer şekilde, pozitif kontrol ilacı da kavrama gücü değişikliklerini tersine çevirme yeteneğini göstermiştir (Şekil 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

AFD, Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) ve geleneksel Çin tıbbında dalağı canlandırma ve durgun karaciğer enerjisini dağıtma işlevine sahip olduğuna inanılan Dendrobium officinale'den (Shihu) oluşur. Ayrıca, tüm bu bitkilerin uygun bir güvenlik profiline sahip olduğu düşünülmektedir ve bu nedenle Çi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone test kit	German DRG company	EIA4164	Step 4.3
Curve Expert 1.4 software	CurveExpert Professional	Version 1.4	For calculation in corticosterone assay
Ethovision software	Noldus Information Technology , Netherlands	Version 15	analysis software and video tracking system
Grip strength test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-ZL	Step 3.1
Lactic acid test kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute	A019-2-1	Step 4.2
Modified multiple platform method	Neuroimmunology Laboratory of Beijing University of Chinese Medicine	None	Step 2.1
Morris water maze test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-Morris	Step 3.3
Open field test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-KC	Step 3.2
Prism	GraphPad	Verson 8	For generating figures
SPSS 26.0	IBM	Verson 26.0	Statistical analysis
Wistar rats	SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd		license number: SCXK (Jing) 2019-0010