JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы представляем протокол для оценки влияния отвара против усталости (AFD) на центральную усталость у крыс, смоделированных модифицированным многоплатформенным методом (MMPM), путем мониторинга как их поведенческих реакций, так и серологических маркеров.

Аннотация

Это исследование было направлено на оценку эффектов отвара против усталости (AFD) против центральной усталости путем наблюдения за поведением и серологическими показателями крыс, смоделированных модифицированным многоплатформенным методом (MMPM) после лекарственного вмешательства. Измерения силы хвата использовались для оценки мышечной силы крыс. Тест в открытом поле был использован для оценки тревожного поведения, в то время как тест Морриса в водном лабиринте был проведен для оценки функции памяти крыс. После поведенческой оценки были собраны образцы сыворотки крови крыс для измерения концентраций кортикостерона (CORT) и молочной кислоты (LAC). Концентрацию LAC определяли колориметрическим методом, а концентрацию CORT — методом иммуноферментного анализа (ИФА). По сравнению с контрольной группой холостых патронов, после моделирования MMPM, у крыс наблюдалось значительное снижение силы хвата и нарушение способности к памяти. Анализ сыворотки крови выявил повышенные уровни LAC и CORT у крыс модельной группы. AFD может заметно обратить вспять эти неблагоприятные изменения в определенной степени. Эти результаты подчеркивают положительное влияние AFD и коэнзима Q10 на физические и когнитивные способности, а также изменения в уровнях биомаркеров сыворотки крови крыс с центральной усталостью.

Введение

Усталость является многогранным и неспецифическим явлением, которое обычно характеризуется чувством усталости и снижением способности функционировать1. Его можно классифицировать как периферическое утомление, возникающее на мышечном уровне, либо центральное утомление, возникающее в центральной нервной системе 3,4. Длительная центральная усталость может быть значительным фактором возникновения психологических проблем, включая тревогу, депрессию, психологический дистресс и проблемы с памятью 5,6. Несмотря на значительный дистресс, существует нехватка специфических препаратов, направленных на центральную усталость7. В то время как метилфенидат, стимулятор центральной нервной системы, может обеспечить временное облегчение, его побочные эффекты, такие как бессонница и учащенное сердцебиение, могут ухудшить состояние 8,9.

В предыдущих клинических применениях традиционная китайская медицина показала многообещающие результаты в лечении центральной усталости, включая такие подходы, как пероральные отвары, иглоукалывание и тайцзицюань 10,11,12. Отвар против усталости (АФД) – эффективная формула, разработанная профессором Ли Фенгом на основе большого клинического опыта и продемонстрировавшая положительные терапевтические эффекты. Состоит из Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) и Dendrobium officinale (Shihu), в соотношении 15:15:10:5:7:8. Отвар AFD концентрировали до 110 мл после кипячения с десятикратным объемом деионизированной воды в течение 1 ч трижды. В предыдущем исследовании мы создали животную модель центральной усталости с помощью модифицированного многоплатформенного метода (MMPM) и подтвердили проявление центральной усталости с помощью поведенческих оценок и нейротрансмиттеров центральной нервнойсистемы. В этом исследовании мы использовали вмешательство AFD на животной модели центральной усталости для оценки ее фармакологических эффектов с помощью поведенческих оценок.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эта исследовательская работа соответствует этическим принципам благополучия животных. Надлежащий уход и условия содержания поддерживались для обеспечения здоровья и благополучия животных, а все процедуры были одобрены комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Пекинского университета китайской медицины (BUCM-4-2019041504-2094).

1. Выращивание и группировка животных

ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего исследования благополучие животных поддерживалось в соответствии с принципами 3R (сокращение, уточнение и замена).

  1. Для этого исследования были отобраны 54 шестинедельные крысы линии Wistar с массой тела 210 г ± 10 г.
  2. Содержание крыс в животноводческом помещении в контролируемых условиях: температура 23 ± 2 °C, относительная влажность 50% и цикл свет/темнота 12 ч/12 часов. Дайте животным акклиматизироваться за 3 дня до эксперимента.
  3. Случайным образом разделите крыс на пустую контрольную группу (обозначена как «a» на рисунках), модельную группу (обозначена как «b» на рисунках), группу AFD-low dose (AFD-L; обозначена как «c» на рисунках), группу AFD-средняя доза (AFD-M; обозначена как «d» на рисунках), группу AFD-high dose (AFD-H; обозначена как «e» на рисунках), группа коэнзима Q10 (коэнзим Q10; обозначен как «f» на рисунках), по 9 крыс в каждой группе, с использованием метода таблицы случайных чисел.

2. Моделирование и вмешательство

ПРИМЕЧАНИЕ: Создание этой модели было основано на предыдущей литературе13.

  1. Используйте самодельный коробку для моделирования (предоставлена лабораторией нейроиммунологии Пекинского университета китайской медицины).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коробка для моделирования имеет длину 110 см, ширину 60 см и высоту 40 см. Дно закреплено 15 круглыми платформами (диаметр 6,5 см, высота 8 см). Расстояние по горизонтали между двумя платформами составляет 13 см, а по вертикали — 10 см. Ящик для открытого поля имеет длину, ширину и высоту 100 см, 100 см и 35 см соответственно. Дно черное, а стенка темно-синяя. Дно ящика для открытого поля разделено на 25 квадратных секций размером 25 см, из которых центральные 9 квадратов обозначены как центральная зона, а внешние 16 квадратов - как периферийная зона.
  2. Следите за тем, чтобы уровень воды в бассейне находился примерно на 1 см выше платформы и чтобы температура воды поддерживалась на уровне 23 ± 2 °C.
  3. После начала эксперимента поместите крысу в коробку, покрытую проволочной сеткой, на поверхность и придавите ее грузиками, чтобы животные не смогли сбежать. Подвешивайте достаточное количество пищи под проволочной сеткой и обеспечьте чистой питьевой водой.
  4. Помещайте крысу в модельную группу в коробку каждый день в 18:00 и вынимайте ее в 8:00 на следующий день. После каждого сеанса моделирования высушите крысу и поместите ее обратно в чистую клетку. Выполняйте моделирование непрерывно в течение 21 дня.
  5. Во время эксперимента очистите коробку, ежедневно меняйте воду и обеспечьте достаточное количество пищи.
  6. На15-й день моделирования вводите препараты через промывание желудка в 10:00 утра каждый день в течение непрерывного периода в течение 7 дней.
    1. Группу AFD-L применяют в дозировке 3,24 г/кг/сут, группу AFD-M в дозе 6,48 г/кг/сут и группу AFD-H в дозе 12,96 г/кг/сут. Вводят коэнзим Q10 в дозировке 10 мг/кг/сут.
    2. При введении средств через промывание желудка готовят суспензию, смешивая необходимую дозу с дистиллированной водой. Объем введения для каждой группы составляет 10 мл/кг. Дайте заготовке и модельной группам одинаковое количество дистиллированной воды.
      Примечание: Дозы, вводимые крысам, были рассчитаны с использованием метода площади поверхности тела (BSA) и пересчитаны в соответствии с нормальными терапевтическими дозами для человека14.

3. Поведенческие оценки

  1. Сила захвата крыс
    1. Возьмитесь за хвост крысы и аккуратно положите его на измеритель силы хвата.
    2. Потяните крысу назад с равномерным усилием, убедившись, что компьютерная система правильно записывает данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментами техники были обучены обращаться с крысами, чтобы постоянно применять силу.
    3. Повторите этот процесс три раза и рассчитайте среднее из трех измерений в качестве окончательного значения прочности хвата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму ошибки, вызванные человеческим фактором, пусть весь эксперимент проведет один человек.
  2. Испытание в открытом поле на крысах
    1. Проводите поведенческие эксперименты в тускло освещенной и тихой обстановке. Перед началом каждого эксперимента помещайте крыс в комнату поведения на 1 час адаптации.
    2. Убедитесь, что в операции участвуют три экспериментатора, и надевайте черную одежду при размещении или руководстве крысами. На протяжении всего эксперимента следите за тем, чтобы экспериментаторы не пересекали границы коробки своим телом или руками.
    3. Откройте программное обеспечение для анализа.
      1. Нажмите « Файл » в верхнем меню и выберите «Новый эксперимент », чтобы создать новый проект. В настройках арены выберите форму, соответствующую арене, по которой будет двигаться крыса.
      2. С помощью мышки нарисуйте арену на экране. Откалибруйте камеру и сохраните настройки арены.
    4. Позвольте второму экспериментатору, одетому в черную одежду, подержать крысу за спину, последовательно расположить ее в центре обозначенной зоны и быстро убрать его руку.
    5. Начните новую запись. Установите продолжительность записи на 5 минут.
    6. По истечении 5-минутного периода наблюдения быстро извлеките крысу из ящика в открытом поле и очистите ее от фекалий. Используйте 75% спирт для очистки ящика в открытом поле.
    7. Повторите процесс для всех крыс.
    8. Наблюдайте и записывайте (1) общее пройденное расстояние, (2) количество пересечений центральной зоны: количество пересечений конечностей крысы в квадраты центральной сетки, и (3) время, проведенное в центральной зоне, т.е. время, проведенное крысой в 9 квадратах центральной сетки.
  3. Водный лабиринт Морриса у крыс
    1. Проводите поведенческие эксперименты в тускло освещенной и тихой обстановке. Перед началом каждого эксперимента помещайте крыс в комнату поведения на 1 час адаптации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы прошли обучение в течение 4 дней; На5-й день начался формальный эксперимент.
    2. Следите за тем, чтобы уровень воды в бассейне находился примерно на 1 см выше платформы и чтобы температура воды поддерживалась на уровне 23 ± 2 °C.
    3. Убедитесь, что в операции участвуют три экспериментатора, и надевайте черную одежду при размещении или руководстве крысами.
    4. Разделите бассейн на четыре квадранта. Закрепите платформу в середине второго квадранта. Прикрепите листы бумаги разного цвета и формы к центру стенок каждого квадранта.
    5. Откройте программное обеспечение для анализа.
      1. Нажмите « Файл » в верхнем меню и выберите «Новый эксперимент », чтобы создать новый проект. В настройках арены выберите форму, соответствующую арене, по которой будет двигаться крыса.
      2. С помощью мышки нарисуйте арену на экране. Откалибруйте камеру и сохраните настройки арены.
    6. В течение периода обучения позвольте другому экспериментатору последовательно поместить крысу лицом к стене бассейна в каждом квадранте. Порядок размещения меняется каждый день следующим образом:
      1. В первый день разместите крысу в следующем порядке: первый квадрант, второй квадрант, третий квадрант, четвертый квадрант.
      2. На второй день расположите крысу в следующем порядке: второй квадрант, первый квадрант, четвертый квадрант, третий квадрант.
      3. На третий день расположите крысу в следующем порядке: четвертый квадрант, третий квадрант, второй квадрант, первый квадрант;
      4. На четвертый день расположите крысу в следующем порядке: третий квадрант, первый квадрант, четвертый квадрант, второй квадрант.
    7. Если крыса не сможет найти платформу в течение 120 с, направьте ее к платформе и дайте ей оставаться на ней в течение 10 с.
    8. После завершения ежедневного эксперимента дайте третьему экспериментатору вытереть воду с тела крысы с помощью полотенца и вытереть его феном. Выполняйте это в другой комнате, чтобы избежать шумовых помех.
    9. В формальном эксперименте уберите платформу и поместите крысу в третий квадрант. Запишите траекторию движения крысы в течение 120 секунд.
    10. Наблюдайте и записывайте (1) время, проведенное в квадранте, где была расположена платформа, и (2) латентность побега, то есть время, необходимое крысе для того, чтобы добраться до платформы от первого входа в бассейн с водой.

4. Биохимический анализ сыворотки крови

  1. Обработка образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Голодание на пище, но не на воде, было разрешено за день до взятия пробы.
    1. Обезболивание крыс с использованием 2% (w/v) раствора пентобарбитала натрия путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 0,5 мл/100 г массы тела.
    2. После полного обезболивания соберите у них кровь из брюшной аорты с помощью сосуда для забора крови.
    3. Поместите цельную кровь при комнатной температуре (RT) на 2 часа, затем центрифугируйте ее при 4 °C, 1522,38 x g в течение 20 минут для получения сыворотки. Алицитируйте и храните сыворотку при температуре -80 °C для дальнейшего использования.
  2. Анализ молочной кислоты (LAC)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию LAC определяли колориметрическим методом.
    1. Смешайте раствор резерва фермента и раствор разведения фермента в соотношении 1:100 по объему для получения рабочего раствора фермента.
    2. Подготовьте проявитель цвета в соответствии с инструкцией в наборе.
    3. В чистую пробирку добавьте 20 μл дистиллированной воды.
    4. В стандартную пробирку добавьте 3 ммоль/л стандартного раствора.
    5. В измерительную трубку добавьте 20 μл образца.
    6. Добавьте в каждую пробирку по 1 мл рабочего раствора фермента и 0,2 мл цветного проявителя. Инкубировать при 37 °C в течение 10 минут, а затем добавить 2 мл раствора для остановки.
    7. Перенесите 200 мкл реакционного раствора на 96-луночный планшет ELISA. Измерьте значение наружного диаметра на длине волны 530 нм. Рассчитайте концентрацию LAC на основе значений OD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация LAC = (значение наружного диаметра пробы - значение наружного диаметра пустой лунки)/(значение наружного диаметра стандартной лунки - значение наружного диаметра пустой лунки) x концентрация стандартного раствора x коэффициент разбавления.
  3. Анализ на кортикостерон
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески приобретаемые наборы ИФА используются для измерения концентрации кортизона в сыворотке крови крыс.
    1. Перед началом эксперимента разведите антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) и промывочным раствором для создания рабочего раствора. Добавьте в покрытую пластину стандартные образцы с концентрациями 0 нмоль/л, 5 нмоль/л, 15 нмоль/л, 30 нмоль/л, 60 нмоль/л, 120 нмоль/л и 240 нмоль/л в объеме 20 μл.
    2. Добавьте образцы сыворотки (20 мкл) в соответствующие лунки, после чего добавьте 200 мкл ферментного конъюгата. Тщательно встряхните тарелку и выдержите ее в течение 60 минут.
    3. Слейте реакционный раствор и трижды промойте пластину раствором для промывки (каждый раз по 400 μл). После высыхания пластины на абсорбирующей бумаге добавьте в каждую лунку по 100 мкл цветного реактива для подложки.
    4. Инкубируйте планшет при RT в течение 15 минут, затем добавьте по 50 мкл раствора в каждую лунку.
    5. Измерьте значения наружного диаметра каждой лунки на длине волны 450 нм. Используйте значения наружного диаметра стандартных лунок для построения стандартной кривой, а затем используйте их для расчета концентраций пробных скважин.

5. Статистический анализ

  1. Выполните статистический анализ с помощью соответствующего программного приложения. Представьте данные измерений в виде среднего ± стандартного отклонения.
  2. Если данные следовали нормальному распределению и показали однородность дисперсий, проведите независимый t-критерий.
  3. Если данные следовали нормальному распределению, но не имели равенства дисперсий, выполните приближенный t-критерий.
  4. Если данные не соответствуют нормальному распределению, используйте непараметрические тесты для сравнения.
  5. Используйте критерий хи-квадрат Пирсона для анализа данных перечисления/подсчета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Был выбран уровень значимости α = 0,05, где P < 0,05 относится к статистически значимым.
  6. Сгенерируйте рисунки с помощью соответствующего программного приложения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

По сравнению с контрольной группой, крысы в модельной группе продемонстрировали значительное снижение силы хвата. Тем не менее, введение AFD в низких, средних и высоких дозах было способно обратить этот эффект в зависимости от дозы, как показано на рисунке 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

AFD состоит из Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) и Dendrobium officinale (Shihu), который, как полагают, выполняет функцию оживления селезенки и рассеивания застойной печеночной энергии в традиционной кит?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи. У нас нет финансовых или личных отношений с организациями или частными лицами, которые могли бы ненадлежащим образом повлиять на наши исследования.

Благодарности

Все авторы выражают благодарность за поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (No 81874428) и Исследовательского проекта Пекинского университета традиционной китайской медицины (No 2023-JYB-JBZD-001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Corticosterone test kitGerman DRG companyEIA4164Step 4.3
Curve Expert 1.4 softwareCurveExpert ProfessionalVersion 1.4For calculation in corticosterone assay
Ethovision software Noldus Information Technology , NetherlandsVersion 15analysis software and video tracking system
Grip strength test deviceBeijing Zhongshi Di Chuang limited companyZS-ZLStep 3.1
Lactic acid test kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research InstituteA019-2-1Step 4.2
Modified multiple platform methodNeuroimmunology Laboratory of Beijing University of Chinese MedicineNoneStep 2.1
Morris water maze test deviceBeijing Zhongshi Di Chuang limited companyZS-MorrisStep 3.3
Open field test deviceBeijing Zhongshi Di Chuang limited companyZS-KCStep 3.2
PrismGraphPad Verson 8For generating figures
SPSS 26.0IBMVerson 26.0Statistical analysis 
Wistar rats SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltdlicense number: SCXK (Jing) 2019-0010

Ссылки

  1. Dukes, J. C., Chakan, M., Mills, A., Marcaurd, M. Approach to fatigue: Best practice. Med Clin North Am. 105 (1), 137-148 (2021).
  2. Zargari Marandi, R., Madeleine, P., Omland, Ø, Vuillerme, N., Samani, A. Eye movement characteristics reflected fatigue development in both young and elderly individuals. Sci Rep. 8 (1), 13148(2018).
  3. Tornero-Aguilera, J. F., Jimenez-Morcillo, J., Rubio-Zarapuz, A., Clemente-Suárez, V. J. Central and peripheral fatigue in physical exercise explained: A narrative review. Int J Environ Res Public Health. 19 (7), 3909(2022).
  4. Dotan, R., Woods, S., Contessa, P. On the reliability and validity of central fatigue determination. Eur J Appl Physiol. 121 (9), 2393-2411 (2021).
  5. AlSaeed, S., et al. Fatigue, depression, and anxiety among ambulating multiple sclerosis patients. Front Immunol. 13, 844461(2022).
  6. Lee, C. H., Giuliani, F. The role of inflammation in depression and fatigue. Front Immunol. 10, 1696(2019).
  7. Meeusen, R., Watson, P., Hasegawa, H., Roelands, B., Piacentini, M. F. Central fatigue: the serotonin hypothesis and beyond. Sports Med. 36 (10), 881-909 (2006).
  8. Nourbakhsh, B., et al. Safety and efficacy of amantadine, modafinil, and methylphenidate for fatigue in multiple sclerosis: a randomised, placebo-controlled, crossover, double-blind trial. Lancet Neurol. 20 (1), 38-48 (2021).
  9. Rojí, R., Centeno, C. The use of methylphenidate to relieve fatigue. Curr Opin Support Palliat Care. 11 (4), 299-305 (2017).
  10. Luo, C., et al. Natural medicines for the treatment of fatigue: Bioactive components, pharmacology, and mechanisms. Pharmacol Res. 148, 104409(2019).
  11. Wang, T., Xu, C., Pan, K., Xiong, H. Acupuncture and moxibustion for chronic fatigue syndrome in traditional Chinese medicine: a systematic review and meta-analysis. BMC Complement Altern Med. 17 (1), 163(2017).
  12. Xiang, Y., Lu, L., Chen, X., Wen, Z. Does Tai Chi relieve fatigue? A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. PLoS One. 12 (4), e0174872(2017).
  13. Zhang, W., et al. A rat model of central fatigue using a modified multiple platform method. J Vis Exp. (138), e57362(2018).
  14. Drug Ther Bull. Body surface area for adjustment of drug dose. Drug Ther Bull. 48 (3), 33-36 (2010).
  15. Harrison, E. L., Baune, B. T. Modulation of early stress-induced neurobiological changes: a review of behavioural and pharmacological interventions in animal models. Transl Psychiatry. 4 (5), e390(2014).
  16. Sanoobar, M., Dehghan, P., Khalili, M., Azimi, A., Seifar, F. Coenzyme Q10 as a treatment for fatigue and depression in multiple sclerosis patients: A double blind randomized clinical trial. Nutr Neurosci. 19 (3), 138-143 (2016).
  17. Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
  18. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  19. Jin, Q., et al. Network and experimental pharmacology to decode the action of wendan decoction against generalized anxiety disorder. Drug Des Devel Ther. 16, 3297-3314 (2022).
  20. Othman, M. Z., Hassan, Z., Che Has, A. T. Morris water maze: a versatile and pertinent tool for assessing spatial learning and memory. Exp Anim. 71 (3), 264-280 (2022).
  21. Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J Vis Exp. (53), e2920(2011).
  22. Richardson, A. E., VanderKaay Tomasulo, M. M. Stress-induced HPA activation in virtual navigation and spatial attention performance. BMC Neurosci. 23 (1), 40(2022).
  23. Mikulska, J., Juszczyk, G., Gawrońska-Grzywacz, M., Herbet, M. HPA axis in the pathomechanism of depression and schizophrenia: New therapeutic strategies based on its participation. Brain Sci. 11 (10), 1298(2021).
  24. Passos, G. S. Insomnia severity is associated with morning cortisol and psychological health. Sleep Sci. 16 (1), 92-96 (2023).
  25. Herane-Vives, A., et al. Cortisol levels in chronic fatigue syndrome and atypical depression measured using hair and saliva specimens. J Affect Disord. 267, 307-314 (2020).
  26. Kang, J. Y., et al. Korean red ginseng ameliorates fatigue via modulation of 5-HT and corticosterone in a sleep-deprived mouse model. Nutrients. 13 (9), 3121(2021).
  27. Rabinowitz, J. D., Enerbäck, S. Lactate: the ugly duckling of energy metabolism. Nat Metab. 2 (7), 566-571 (2020).
  28. Proia, P., Di Liegro, C. M., Schiera, G., Fricano, A., Di Liegro, I. Lactate as a metabolite and a regulator in the central nervous system. Int J Mol Sci. 17 (9), 1450(2016).
  29. Zu, Y., Lu, X., Yu, Q., Yu, L., Li, H., Wang, S. Higher postdialysis lactic acid is associated with postdialysis fatigue in maintenance of hemodialysis patients. Blood Purif. 49 (5), 535-541 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

AFD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены