The Effect of Anti-Fatigue Decoction on the Behaviors and Serological Indicators in a Central Fatigue Rat Model

요약

여기에서는 MMPM(Modified Multiple Platform Method)으로 모델링된 쥐의 행동 반응과 혈청학적 마커를 모두 모니터링하여 쥐의 중추 피로에 대한 AFD(Anti-Fatigue Decoction)의 효과를 평가하는 프로토콜을 소개합니다.

초록

본 연구는 약물 중재 후 MMPM(Modified Multiple Platform Method)으로 모델링한 쥐의 행동과 혈청학적 지표를 관찰하여 중추 피로에 대한 항피로 달인(Anti-fatigue Decoction, AFD)의 효과를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 쥐의 근력을 평가하기 위해 악력 측정이 사용되었습니다. 오픈 필드 테스트는 불안과 같은 행동을 평가하는 데 활용되었으며, Morris 물 미로 테스트는 쥐의 기억 기능을 평가하기 위해 수행되었습니다. 행동 평가 후, 쥐 혈청 샘플을 수집하여 코르티코스테론(CORT)과 젖산(LAC)의 농도를 측정했습니다. LAC의 농도는 비색법을 사용하여 측정한 반면, CORT의 농도는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 사용하여 측정했습니다. 블랭크 대조군과 비교했을 때, MMPM 모델링에 따라 쥐는 악력이 현저히 감소하고 기억력이 손상되었습니다. 혈청 분석 결과 모델 그룹 쥐에서 LAC 및 CORT 수치가 증가한 것으로 나타났습니다. AFD는 이러한 불리한 변화를 어느 정도 눈에 띄게 되돌릴 수 있습니다. 이러한 결과는 AFD와 코엔자임Q10이 신체 및 인지 능력에 미치는 긍정적인 효과와 중추 피로 쥐의 혈청 바이오마커 수치 변화를 강조합니다.

서문

피로는 다면적이고 비특이적인 현상으로, 일반적으로 피로감과 기능 저하를 특징으로 합니다¹. 이는 근육 수준에서 발생하는 말초 피로 또는 중추 신경계에서 발생하는 중추 피로로 분류할 수 있습니다 ^3,4. 장기간의 중심 피로는 불안, 우울증, 심리적 고통, 기억력 문제를 포함한 심리적 문제의 중요한 원인이 될 수 있습니다 ^5,6. 심각한 고통을 유발하고 있음에도 불구하고, 중추 피로를 표적으로 하는 특정 약물이 부족하다⁷. 중추 신경계 자극제인 메틸페니데이트는 일시적인 완화를 제공할 수 있지만 불면증 및 심계항진과 같은 부작용으로 인해 상태가 악화될 수 있습니다 ^8,9.

이전의 임상 적용에서 중국 전통 의학은 경구 달인, 침술 및 태극권^10,11,12와 같은 접근 방식을 통합하여 중추 피로를 치료하는 데 유망한 결과를 보여주었습니다. 피로 달인(AFD)은 광범위한 임상 경험을 바탕으로 Li Feng 교수가 개발한 효과적인 포뮬러로 긍정적인 치료 효과를 입증했습니다. Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) 및 Dendrobium officinale(Shihu)로 구성되며 15 : 15 : 10 : 5 : 7 : 8의 비율로 구성됩니다. AFD 달인은 110 mL로 농축하여 탈이온수 부피의 10배로 1시간 3회 끓인 후 실시하였다. 이전 연구에서는 MMPM(Modified Multiple Platform Method)을 사용하여 중추 피로의 동물 모델을 확립하고 행동 및 중추 신경계 신경전달물질 평가를 통해 중추 피로의 발현을 확인했다¹³. 본 연구에서는 행동평가를 통해 약리학적 효과를 평가하기 위해 중추피로의 동물모델에 대한 AFD 중재를 활용하였다.

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프로토콜

본 연구는 동물복지를 위한 윤리적 가이드라인을 준수하고 있다. 동물의 건강과 복지를 보장하기 위해 적절한 보살핌과 사육 환경이 유지되었으며, 모든 절차는 베이징 중의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(BUCM-4-2019041504-2094)의 승인을 받았습니다.

1. 동물 사육 및 그룹화

참고: 연구 전반에 걸쳐 동물 복지는 3R(Reduction, Refinement, and Replacement) 원칙에 따라 유지되었습니다.

1. 이 연구를 위해 체중이 210g ± 10g인 6주 된 특정 병원체가 없는(SPF) Wistar 쥐 54마리를 선택합니다.
2. 23 ± 2 °C의 온도, 50%의 상대 습도, 12시간/12시간의 명암 주기와 같은 통제된 조건의 동물 시설에 쥐를 수용합니다. 실험 전 3일 동안 동물들이 순응할 때까지 기다립니다.
3. 쥐를 무작위로 빈 대조군(그림에서 "a"로 표시), 모델 그룹(그림에서 "b"로 표시), AFD-저용량(AFD-L, 그림에서 "c"로 표시) 그룹, AFD-중간 용량(AFD-M, 그림에서 "d"로 표시) 그룹, AFD-고용량(AFD-H, 그림에서 "e"로 표시) 그룹으로 나누고, 코엔자임 Q10 (CoQ10, 그림에서 "f"로 표시됨) 그룹, 각 그룹에 9 마리의 쥐가 있음, 난수 표 방법 사용.

2. 모델링 및 개입

참고: 이 모델의 확립은 이전 문헌¹³을 기반으로 합니다.

1. 자체 제작한 모델링 상자(Beijing University of Chinese Medicine의 신경면역학 실험실에서 제공)를 사용합니다.
   참고: 모델링 상자의 길이는 110cm, 너비는 60cm, 높이는 40cm입니다. 바닥은 15 개의 원형 플랫폼 (직경 6.5cm, 높이 8cm)으로 고정됩니다. 두 플랫폼 사이의 수평 간격은 13cm이고 수직 간격은 10cm입니다. 오픈 필드 박스의 길이, 너비, 높이는 각각 100cm, 100cm, 35cm입니다. 바닥은 검은 색이고 벽은 짙은 파란색입니다. 오픈 필드 박스의 바닥은 25cm 크기의 25 개의 정사각형 섹션으로 나뉘며, 중앙 9 개의 사각형은 중앙 구역으로, 바깥쪽 16 개의 사각형은 주변 구역으로 지정됩니다.
2. 수영장의 수위가 플랫폼에서 약 1cm 위에 있고 수온이 23 ± 2°C로 유지되는지 확인하십시오.
3. 실험이 시작된 후 표면에 철망으로 덮인 상자에 쥐를 넣고 동물이 탈출하지 못하도록 추로 누릅니다. 철망 아래에 충분한 음식을 매달아 깨끗한 식수를 제공하십시오.
4. 모델 그룹의 쥐를 매일 18:00에 상자에 넣고 다음날 8:00에 꺼내십시오. 각 모델링 세션이 끝나면 쥐를 말리고 깨끗한 케이지에 다시 넣으십시오. 21일 동안 지속적으로 모델링을 수행합니다.
5. 실험하는 동안 상자를 청소하고 매일 물을 갈아주고 충분한 음식을 제공하십시오.
6. 모델링 15^일째 되는 날, 매일 오전 10:00에 7일 연속 동안 위 세척을 통해 에이전트를 투여합니다.
   1. AFD-L 그룹은 3.24g/kg/d, AFD-M 그룹은 6.48g/kg/d, AFD-H 그룹은 12.96g/kg/d의 용량으로 투여합니다. 코엔자임 Q10을 10mg/kg/d의 용량으로 투여합니다.
   2. 위 세척제를 통해 제제를 투여할 때는 증류수에 필요한 용량을 혼합하여 현탁액을 준비합니다. 각 그룹의 투여 용량은 10mL/kg입니다. 블랭크 그룹과 모델 그룹에 동일한 양의 증류수를 제공합니다.
      참고: 쥐에게 투여된 투여량은 체표면적(Body Surface Area, BSA) 방법을 사용하여 계산하고 인간에 대한 정상적인 치료 용량에 따라 전환하였다¹⁴.

3. 행동 평가

1. 쥐의 악력
   1. 쥐의 꼬리를 잡고 악력 측정기에 부드럽게 올려 놓습니다.
   2. 컴퓨터 시스템이 데이터를 올바르게 기록하는지 확인하면서 균일한 힘으로 쥐를 뒤로 당깁니다.
      참고: 실험 전에, 기술자들은 쥐가 지속적으로 힘을 가할 수 있도록 다루도록 훈련을 받았다.
   3. 이 과정을 세 번 반복하고 세 가지 측정의 평균을 최종 그립 강도 값으로 계산합니다.
      참고: 인적 요인으로 인한 오류를 최소화하려면 한 사람이 전체 실험을 수행하도록 하십시오.
2. 쥐의 개방형 필드 테스트
   1. 조명이 어둡고 조용한 환경에서 행동 실험을 수행합니다. 각 실험을 시작하기 전에 쥐를 행동실에 1시간 동안 적응하도록 합니다.
   2. 세 명의 실험자가 작업에 참여했는지 확인하고 쥐를 배치하거나 안내할 때 검은색 옷을 입습니다. 실험하는 동안 실험자가 몸이나 팔로 상자의 경계를 넘지 않도록 합니다.
   3. 해석 소프트웨어를 엽니다.
      1. 상단 메뉴에서 파일을 클릭하고 새 실험 을 선택하여 새 프로젝트를 만듭니다. 아레나 설정에서 쥐가 이동할 경기장에 해당하는 모양을 선택합니다.
      2. 마우스를 사용하여 화면에 경기장을 그립니다. 카메라를 보정하고 경기장 설정을 저장합니다 .
   4. 검은 옷을 입은 두 번째 실험자에게 쥐의 등을 잡고 지정된 영역의 중앙에 순차적으로 놓고 재빨리 손을 빼게 합니다.
   5. 새 녹음을 시작합니다. 녹음 시간을 5분으로 설정합니다.
   6. 5분의 관찰 시간이 끝나면 열린 들판 상자에서 쥐를 신속하게 꺼내 배설물을 청소합니다. 75% 알코올을 사용하여 열린 필드 상자를 청소합니다.
   7. 모든 쥐에 대해 이 과정을 반복합니다.
   8. (1) 이동한 총 거리, (2) 중앙 구역 횡단 횟수: 쥐의 팔다리가 중앙 격자 사각형으로 교차하는 횟수, (3) 중앙 구역에서 보낸 시간, 즉 쥐가 9개의 중앙 격자 사각형에서 보낸 시간을 관찰하고 기록합니다.
3. 쥐의 Morris 물 미로
   1. 조명이 어둡고 조용한 환경에서 행동 실험을 수행합니다. 각 실험을 시작하기 전에 쥐를 행동실에 1시간 동안 적응하도록 놔두세요.
      참고 : 쥐는 4 일의 훈련을 받았습니다. 5^일 째 되는 날, 공식 실험이 시작되었습니다.
   2. 수영장의 수위가 플랫폼에서 약 1cm 위에 있고 수온이 23 ± 2°C로 유지되는지 확인하십시오.
   3. 세 명의 실험자가 작업에 참여했는지 확인하고 쥐를 배치하거나 안내할 때 검은색 옷을 입습니다.
   4. 물 웅덩이를 4개의 사분면으로 나눕니다. 두 번째 사분면의 중간에 플랫폼을 고정합니다. 다양한 색상과 모양의 종이 조각을 각 사분면의 벽 중앙에 부착합니다.
   5. 해석 소프트웨어를 엽니다.
      1. 상단 메뉴에서 파일을 클릭하고 새 실험 을 선택하여 새 프로젝트를 만듭니다. 아레나 설정에서 쥐가 이동할 경기장에 해당하는 모양을 선택합니다.
      2. 마우스를 사용하여 화면에 경기장을 그립니다. 카메라를 보정하고 경기장 설정을 저장합니다 .
   6. 학습 기간 동안 다른 실험자가 각 사분면의 수영장 벽을 향하도록 쥐를 순차적으로 배치하게 합니다. 배치 순서는 다음과 같이 매일 다릅니다.
      1. 첫째 날에는 쥐를 첫 번째 사분면, 두 번째 사분면, 세 번째 사분면, 네 번째 사분면의 순서로 배치합니다.
      2. 둘째 날에는 쥐를 두 번째 사분면, 첫 번째 사분면, 네 번째 사분면, 세 번째 사분면의 순서로 놓습니다.
      3. 셋째 날에는 쥐를 다음 순서로 놓습니다 : 네 번째 사분면, 세 번째 사분면, 두 번째 사분면, 첫 번째 사분면;
      4. 넷째 날에는 쥐를 세 번째 사분면, 첫 번째 사분면, 네 번째 사분면, 두 번째 사분면의 순서로 놓습니다.
   7. 쥐가 120초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 플랫폼으로 안내하고 10초 동안 머물도록 합니다.
   8. 일일 실험을 마친 후 세 번째 실험자가 수건으로 쥐의 몸에 묻은 물을 닦아내고 헤어드라이어로 말리게 합니다. 소음 간섭을 피하기 위해 다른 방에서 이 작업을 수행하십시오.
   9. 공식 실험에서는 플랫폼을 제거하고 쥐를 세 번째 사분면에 놓습니다. 120초 이내에 쥐의 이동 궤적을 기록합니다.
   10. (1) 플랫폼이 위치한 사분면에서 보낸 시간과 (2) 쥐가 처음으로 물웅덩이에 들어가 플랫폼에 도달하는 데 걸리는 시간인 탈출 대기 시간을 관찰하고 기록합니다.

4. 혈청 생화학 분석

1. 샘플 처리
   참고: 샘플링 전날에는 음식은 단식할 수 있지만 물은 허용되지 않았습니다.
   1. 체중 0.5 mL / 100 g에서 복강 내 주사를 통해 2 % (w / v) 나트륨 펜토 바르비탈 용액을 사용하여 쥐를 마취합니다.
   2. 완전 마취 후 혈액 채취 혈관을 사용하여 복부 대동맥에서 혈액을 채취합니다.
   3. 전혈을 실온(RT)에서 2시간 동안 놓고 4°C, 1522.38 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 혈청을 얻습니다. 나중에 사용할 수 있도록 세럼을 -80 °C에서 공유하고 보관하십시오.
2. 젖산(LAC) 분석
   참고 : LAC의 농도는 비색법을 사용하여 측정되었습니다.
   1. 효소 예비 용액과 효소 희석 용액을 1:100 부피 비율로 혼합하여 효소 작용 용액을 제조합니다.
   2. 키트의 지침에 따라 현상액을 준비합니다.
   3. 빈 튜브에 증류수 20μL를 추가합니다.
   4. 표준 튜브에 3mmol/L 표준 용액을 추가합니다.
   5. 측정 튜브에 시료 20μL를 추가합니다.
   6. 각 튜브에 1mL의 효소 작용 용액과 0.2mL의 현상액을 추가합니다. 37°C에서 10분 동안 배양한 다음 정지 용액 2mL를 추가합니다.
   7. 200 μL의 반응 용액을 96웰 ELISA 플레이트로 옮깁니다. 530nm에서 OD 값을 측정합니다. OD 값을 기반으로 LAC 농도를 계산합니다.
      참고: LAC 농도 = (샘플 웰 OD 값 - 블랭크 웰 OD 값)/(표준 웰 OD 값 - 블랭크 웰 OD 값) x 표준 용액 농도 x 희석 비율 계수.
3. 코르티코스테론 분석
   참고: 시중에서 판매되는 ELISA 키트는 쥐 혈청의 코르티손 농도를 측정하는 데 사용됩니다.
   1. 실험에 앞서 양고추냉이 과산화효소(HRP)와 세척 용액으로 접합된 항체를 희석하여 작동하는 용액을 만듭니다. 0 nmol/L, 5 nmol/L, 15 nmol/L, 30 nmol/L, 60 nmol/L, 120 nmol/L 및 240 nmol/L 농도의 표준 시료를 코팅된 플레이트에 20 μL 부피로 추가합니다.
   2. 혈청 샘플(20μL)을 각 웰에 추가한 다음 200μL의 효소 접합체를 추가합니다. 플레이트를 완전히 흔들어 60분 동안 배양합니다.
   3. 반응 용액을 버리고 세척 용액(매번 400μL)으로 플레이트를 3회 세척합니다. 흡수지에서 플레이트를 건조시킨 후 각 웰에 100μL의 기판 색상 시약을 추가합니다.
   4. RT에서 플레이트를 15분 동안 배양한 다음 각 웰에 정지 용액 50μL를 추가합니다.
   5. 450nm에서 각 웰의 OD 값을 측정합니다. 표준 웰의 OD 값을 사용하여 표준 곡선을 생성한 다음 이를 사용하여 샘플 웰의 농도를 계산합니다.

5. 통계 분석

1. 적절한 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 측정 데이터를 평균 ± 표준 편차로 나타냅니다.
2. 데이터가 정규 분포를 따르고 분산의 동질성을 보이면 독립적인 t-검정을 수행합니다.
3. 데이터가 정규 분포를 따랐지만 분산이 같지 않은 경우 근사 t-검정을 수행합니다.
4. 데이터가 정규 분포를 따르지 않으면 비교를 위해 비모수 검정을 사용하십시오.
5. Pearson의 카이제곱 검정을 사용하여 열거형/개수 데이터 분석을 수행할 수 있습니다.
   참고: α = 0.05의 유의 수준이 선택되었으며, 여기서 P < 0.05는 통계적으로 유의하다고 합니다.
6. 적절한 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 그림을 생성합니다.

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결과

대조군과 비교했을 때, 모델 그룹의 쥐는 악력에서 현저한 감소를 보였다. 그러나 저용량, 중용량 및 고용량에서 AFD를 투여하면 그림 1에서 볼 수 있듯이 용량 의존적 방식으로 이러한 효과를 역전시킬 수 있었습니다. 마찬가지로, 양성 대조군은 그립 강도 변화를 역전시키는 능력도 입증했습니다(그림 1).

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토론

AFD는 황기( Astragalus membranaceus , 황치), 프럭투스 아우란티(Fructus aurantii , Zhiqiao), 프럭투스 크라타에기(Fructus crataegi , Shanzha), 오미자 치넨시스(Schisandra chinensis, Wuweizi), 당귀(Angelica sinensis, Danggui), 덴드로비움 오피시날레(Dendrobium officinale , Shihu)로 구성되어 있으며, 이들은 비장을 활성화하고 정체된 간 에너지를 분산시키는 기능을 가?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone test kit	German DRG company	EIA4164	Step 4.3
Curve Expert 1.4 software	CurveExpert Professional	Version 1.4	For calculation in corticosterone assay
Ethovision software	Noldus Information Technology , Netherlands	Version 15	analysis software and video tracking system
Grip strength test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-ZL	Step 3.1
Lactic acid test kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute	A019-2-1	Step 4.2
Modified multiple platform method	Neuroimmunology Laboratory of Beijing University of Chinese Medicine	None	Step 2.1
Morris water maze test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-Morris	Step 3.3
Open field test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-KC	Step 3.2
Prism	GraphPad	Verson 8	For generating figures
SPSS 26.0	IBM	Verson 26.0	Statistical analysis
Wistar rats	SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd		license number: SCXK (Jing) 2019-0010