Die Wirkung der Anti-Ermüdungs-Abkochung auf das Verhalten und die serologischen Indikatoren in einem zentralen Ermüdungsmodell an Ratten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Auswirkungen von Anti-Müdigkeits-Abkochung (AFD) auf die zentrale Müdigkeit bei Ratten zu bewerten, das mit der modifizierten Multi-Plattform-Methode (MMPM) modelliert wurde, indem sowohl ihre Verhaltensreaktionen als auch serologische Marker überwacht wurden.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen von Anti-Fatigue Decoction (AFD) gegen zentrale Fatigue zu bewerten, indem das Verhalten und die serologischen Indikatoren von Ratten beobachtet wurden, die nach der modifizierten Multi-Plattform-Methode (MMPM) nach medikamentöser Intervention modelliert wurden. Messungen der Griffkraft wurden verwendet, um die Muskelkraft von Ratten zu bewerten. Der Freilandtest wurde verwendet, um angstähnliches Verhalten zu beurteilen, während der Morris-Wasserlabyrinth-Test durchgeführt wurde, um die Gedächtnisfunktion der Ratten zu bewerten. Im Anschluss an die Verhaltensbewertungen wurden Serumproben von Ratten entnommen, um die Konzentrationen von Corticosteron (CORT) und Milchsäure (LAC) zu messen. Die Konzentration von LAC wurde mit der kolorimetrischen Methode bestimmt, während die Konzentration von CORT mit der ELISA-Methode (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) gemessen wurde. Im Vergleich zur Blank-Kontrollgruppe zeigten Ratten nach MMPM-Modellierung eine signifikante Verringerung der Griffkraft und eine Beeinträchtigung des Gedächtnisses. Die Serumanalyse ergab erhöhte LAC- und CORT Spiegel bei den Ratten der Modellgruppe. AFD kann diese nachteiligen Veränderungen bis zu einem gewissen Grad spürbar rückgängig machen. Diese Ergebnisse unterstreichen die positiven Auswirkungen von AFD und Coenzym Q10 auf die körperlichen und kognitiven Fähigkeiten und Veränderungen der Serum-Biomarker-Spiegel von zentralen Müdigkeitsratten.

Einleitung

Fatigue ist ein vielschichtiges und unspezifisches Phänomen, das typischerweise durch Müdigkeitsgefühle und verminderte Funktionsfähigkeit gekennzeichnet ist¹. Sie kann entweder als periphere Müdigkeit, die auf muskulärer Ebene auftritt, oder als zentrale Müdigkeit, die vom Zentralnervensystem ausgeht ^3,4, klassifiziert werden. Anhaltende zentrale Müdigkeit kann einen erheblichen Beitrag zu psychischen Problemen wie Angstzuständen, Depressionen, psychischen Belastungen und Gedächtnisproblemen leisten ^5,6. Trotz erheblicher Belastung gibt es einen Mangel an spezifischen Medikamenten, die auf die zentrale Müdigkeit abzielen⁷. Während Methylphenidat, ein Stimulans des zentralen Nervensystems, vorübergehend Linderung verschaffen kann, können seine Nebenwirkungen wie Schlaflosigkeit und Herzklopfen den Zustand verschlimmern ^8,9.

In früheren klinischen Anwendungen hat die traditionelle chinesische Medizin vielversprechende Ergebnisse bei der Behandlung von zentraler Müdigkeit gezeigt, indem sie Ansätze wie orale Abkochungen, Akupunktur und Tai Chi umfasste 10,11,12. Anti-Müdigkeits-Abkochung (AFD) ist eine wirksame Formel, die von Professor Li Feng auf der Grundlage umfangreicher klinischer Erfahrungen entwickelt wurde und positive therapeutische Wirkungen gezeigt hat. Sie besteht aus Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) und Dendrobium officinale (Shihu), in einem Verhältnis von 15: 15: 10: 5: 7: 8. Der AFD-Sud wurde auf 110 ml konzentriert, nachdem er dreimal 1 h lang mit dem zehnfachen Volumen an deionisiertem Wasser gekocht hatte. In einer früheren Studie haben wir ein Tiermodell der zentralen Müdigkeit mit der Modified Multiple Platform Method (MMPM) etabliert und die Manifestation der zentralen Müdigkeit durch Verhaltens- und Neurotransmitterbewertungen des zentralen Nervensystems bestätigt¹³. In dieser Studie nutzten wir die AFD-Intervention im Tiermodell der zentralen Müdigkeit, um ihre pharmakologischen Effekte durch Verhaltensbewertungen zu bewerten.

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Protokoll

Diese Forschungsarbeit orientiert sich an ethischen Richtlinien zum Tierschutz. Um die Gesundheit und das Wohlbefinden der Tiere zu gewährleisten, wurden angemessene Pflege- und Haltungsbedingungen aufrechterhalten, und alle Verfahren wurden vom institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung der Universität für Chinesische Medizin Peking genehmigt (BUCM-4-2019041504-2094).

1. Aufzucht und Gruppierung von Tieren

HINWEIS: Während der gesamten Studie wurde der Tierschutz nach den 3R-Prinzipien (Reduction, Refinement, and Replacement) aufrechterhalten.

1. Für diese Studie wurden 54 sechs Wochen alte spezifische pathogenfreie (SPF) Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 210 g ± 10 g ausgewählt.
2. Halten Sie die Ratten in der Tieranlage unter kontrollierten Bedingungen: Temperatur von 23 ± 2 °C, relative Luftfeuchtigkeit von 50 % und ein Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h/12 h. Lassen Sie die Tiere vor dem Versuch 3 Tage lang akklimatisieren.
3. Teilen Sie die Ratten nach dem Zufallsprinzip in eine leere Kontrollgruppe (in den Abbildungen als "a" gekennzeichnet), eine Modellgruppe (in den Abbildungen als "b" gekennzeichnet), eine AFD-Gruppe mit niedriger Dosis (AFD-L; in den Abbildungen als "c" gekennzeichnet), eine AFD-Gruppe mit mittlerer Dosis (AFD-M; in den Abbildungen als "d" gekennzeichnet) und eine Gruppe mit AFD-hoher Dosis (AFD-H; in den Abbildungen als "e" gekennzeichnet) ein. eine Coenzym Q10 (CoQ10; in den Abbildungen als "f" gekennzeichnet) Gruppe mit 9 Ratten in jeder Gruppe, unter Verwendung einer Zufallszahlentabellenmethode.

2. Modellierung und Intervention

HINWEIS: Die Etablierung dieses Modells basierte auf der bisherigen Literatur¹³.

1. Verwenden Sie die selbstgebaute Modellierungsbox (zur Verfügung gestellt vom Neuroimmunology Laboratory der Beijing University of Chinese Medicine).
   HINWEIS: Der Modellbaukasten hat eine Länge von 110 cm, eine Breite von 60 cm und eine Höhe von 40 cm. Der Boden wird mit 15 kreisförmigen Plattformen (Durchmesser 6,5 cm, Höhe 8 cm) befestigt. Der horizontale Abstand zwischen den beiden Plattformen beträgt 13 cm und der vertikale Abstand 10 cm. Die offene Feldbox hat eine Länge, Breite und Höhe von 100 cm, 100 cm bzw. 35 cm. Die Unterseite ist schwarz und die Wand dunkelblau. Der Boden des offenen Feldkastens ist in 25 quadratische Abschnitte mit den Maßen 25 cm unterteilt, wobei die mittleren 9 Quadrate als Mittelzone und die äußeren 16 Quadrate als Randzone bezeichnet werden.
2. Stellen Sie sicher, dass sich der Wasserstand im Pool ca. 1 cm über der Plattform befindet und die Wassertemperatur bei 23 ± 2 °C gehalten wird.
3. Nachdem das Experiment begonnen hat, legen Sie die Ratte in die mit Drahtgeflecht bedeckte Box auf der Oberfläche und drücken Sie sie mit Gewichten nach unten, um ein Entkommen der Tiere zu verhindern. Hängen Sie ausreichend Lebensmittel unter das Drahtgeflecht und sorgen Sie für sauberes Trinkwasser.
4. Setzen Sie die Ratte in der Modellgruppe jeden Tag um 18:00 Uhr in die Box und nehmen Sie sie am nächsten Tag um 8:00 Uhr heraus. Trocknen Sie die Ratte nach jeder Modelliersitzung und setzen Sie sie wieder in einen sauberen Käfig. Führen Sie die Modellierung 21 Tage lang kontinuierlich durch.
5. Reinigen Sie während des Versuchs die Box, wechseln Sie täglich das Wasser und sorgen Sie für ausreichend Futter.
6. Verabreichen Sie die Wirkstoffe am 15^. Tag der Modellierung täglich um 10:00 Uhr über einen zusammenhängenden Zeitraum von 7 Tagen über eine Magenspülung.
   1. Verabreichen Sie die AFD-L-Gruppe in einer Dosierung von 3,24 g/kg/d, die AFD-M-Gruppe in einer Dosierung von 6,48 g/kg/d und die AFD-H-Gruppe in einer Dosierung von 12,96 g/kg/d. Coenzym Q10 in einer Dosierung von 10 mg/kg/Tag verabreichen.
   2. Bei der Verabreichung der Mittel über die Magenspülung ist eine Suspension herzustellen, indem die erforderliche Dosis in destilliertem Wasser gemischt wird. Das Verabreichungsvolumen für jede Gruppe beträgt 10 ml/kg. Geben Sie der Rohlings- und der Modellgruppe die gleiche Menge destilliertes Wasser.
      HINWEIS: Die den Ratten verabreichten Dosierungen wurden nach der Methode der Körperoberfläche (BSA) berechnet und entsprechend den normalen therapeutischen Dosierungen für den Menschen umgerechnet¹⁴.

3. Verhaltensbewertungen

1. Griffstärke von Ratten
   1. Fassen Sie den Schwanz der Ratte und legen Sie ihn vorsichtig auf die Griffstärkeanzeige.
   2. Ziehen Sie die Ratte mit gleichmäßiger Kraft nach hinten und stellen Sie sicher, dass das Computersystem die Daten korrekt aufzeichnet.
      HINWEIS: Vor den Experimenten wurden Techniker darin geschult, mit den Ratten umzugehen, um die Kraft gleichmäßig anzuwenden.
   3. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal und berechnen Sie den Durchschnitt der drei Messungen als endgültigen Wert für die Griffstärke.
      HINWEIS: Um Fehler zu minimieren, die durch menschliche Faktoren verursacht werden, lassen Sie eine Person das gesamte Experiment durchführen.
2. Offener Feldversuch an Ratten
   1. Führen Sie die Verhaltensexperimente in einer schwach beleuchteten und ruhigen Umgebung durch. Setzen Sie die Ratten vor Beginn jedes Experiments für 1 Stunde Anpassung in den Verhaltensraum.
   2. Stellen Sie sicher, dass drei Experimentatoren an der Operation beteiligt sind, und tragen Sie schwarze Kleidung, wenn Sie die Ratten platzieren oder führen. Achten Sie während des gesamten Experiments darauf, dass die Experimentatoren die Grenzen der Box nicht mit ihrem Körper oder ihren Armen überschreiten.
   3. Öffnen Sie die Analysesoftware.
      1. Klicken Sie im oberen Menü auf Datei und wählen Sie Neues Experiment , um ein neues Projekt zu erstellen. Wähle in den Arena-Einstellungen die Form aus, die der Arena entspricht, in der sich die Ratte bewegen wird.
      2. Zeichne mit der Maus die Arena auf dem Bildschirm. Kalibrieren Sie die Kamera und speichern Sie die Arena-Einstellungen.
   4. Lassen Sie einen zweiten Experimentator, der schwarz gekleidet ist, die Ratte am Rücken halten, platzieren Sie sie nacheinander in der Mitte des dafür vorgesehenen Bereichs und ziehen Sie schnell seine Hand zurück.
   5. Starten Sie eine neue Aufnahme. Stellen Sie die Aufnahmedauer auf 5 Minuten ein.
   6. Nehmen Sie die Ratte nach dem Beobachtungszeitraum von 5 Minuten schnell aus der offenen Feldbox und reinigen Sie ihren Kot. Verwenden Sie 75% Alkohol, um die offene Feldbox zu reinigen.
   7. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Ratten.
   8. Beobachten und notieren Sie (1) die zurückgelegte Gesamtstrecke, (2) die Anzahl der Durchquerungen der zentralen Zone: die Anzahl der Male, die die Gliedmaßen der Ratte in zentrale Gitterquadrate kreuzen, und (3) die Zeit, die sie in der zentralen Zone verbracht hat, d.h. die Zeit, die die Ratte in den 9 zentralen Gitterquadraten verbracht hat.
3. Morris-Wasserlabyrinth bei Ratten
   1. Führen Sie die Verhaltensexperimente in einer schwach beleuchteten und ruhigen Umgebung durch. Setzen Sie die Ratten vor Beginn jedes Experiments für 1 Stunde Anpassung in den Verhaltensraum.
      HINWEIS: Die Ratten wurden 4 Trainingstage durchlaufen; Am 5^. Tag begann das formale Experiment.
   2. Stellen Sie sicher, dass sich der Wasserstand im Pool ca. 1 cm über der Plattform befindet und die Wassertemperatur bei 23 ± 2 °C gehalten wird.
   3. Stellen Sie sicher, dass drei Experimentatoren an der Operation beteiligt sind, und tragen Sie schwarze Kleidung, wenn Sie die Ratten platzieren oder führen.
   4. Teilen Sie das Wasserbecken in vier Quadranten ein. Fixiere eine Plattform in der Mitte des zweiten Quadranten. Befestigen Sie verschiedenfarbige und geformte Papierstücke in der Mitte der Wände jedes Quadranten.
   5. Öffnen Sie die Analysesoftware.
      1. Klicken Sie im oberen Menü auf Datei und wählen Sie Neues Experiment , um ein neues Projekt zu erstellen. Wähle in den Arena-Einstellungen die Form aus, die der Arena entspricht, in der sich die Ratte bewegen wird.
      2. Zeichne mit der Maus die Arena auf dem Bildschirm. Kalibrieren Sie die Kamera und speichern Sie die Arena-Einstellungen.
   6. Lassen Sie während der Lernphase einen anderen Experimentator die Ratte nacheinander mit dem Gesicht zur Beckenwand in jedem Quadranten platzieren. Die Reihenfolge der Platzierung ist jeden Tag wie folgt unterschiedlich:
      1. Ordnen Sie die Ratte am ersten Tag in die folgende Reihenfolge: erster Quadrant, zweiter Quadrant, dritter Quadrant, vierter Quadrant.
      2. Ordnen Sie die Ratte am zweiten Tag in die folgende Reihenfolge: zweiter Quadrant, erster Quadrant, vierter Quadrant, dritter Quadrant.
      3. Ordnen Sie die Ratte am dritten Tag in der folgenden Reihenfolge ein: vierter Quadrant, dritter Quadrant, zweiter Quadrant, erster Quadrant;
      4. Ordnen Sie die Ratte am vierten Tag in die folgende Reihenfolge: dritter Quadrant, erster Quadrant, vierter Quadrant, zweiter Quadrant.
   7. Wenn die Ratte die Plattform innerhalb von 120 s nicht findet, führe sie zur Plattform und lasse sie 10 s auf ihr bleiben.
   8. Lassen Sie den dritten Versuchsleiter nach Beendigung des täglichen Experiments das Wasser mit einem Handtuch vom Körper der Ratte abwischen und trocknen Sie es mit einem Fön ab. Führen Sie dies in einem anderen Raum durch, um Störgeräusche zu vermeiden.
   9. Entfernen Sie im formalen Experiment die Plattform und platzieren Sie die Ratte im dritten Quadranten. Zeichnen Sie die Bewegungsbahn der Ratte innerhalb von 120 s auf.
   10. Beobachten und notieren Sie (1) die Zeit, die sie in dem Quadranten verbracht hat, in dem sich die Plattform befand, und (2) die Fluchtlatenz, d. h. die Zeit, die die Ratte benötigt, um die Plattform zu erreichen, nachdem sie das Wasserbecken zum ersten Mal betreten hat.

4. Biochemische Analyse des Serums

1. Probenaufbereitung
   HINWEIS: Am Tag vor der Probenahme war ein Fasten mit Lebensmitteln, aber ohne Wasser erlaubt.
   1. Betäuben Sie die Ratten mit einer 2%igen (w/v) Natrium-Pentobarbital-Lösung durch intraperitoneale Injektion bei 0,5 ml/100 g Körpergewicht.
   2. Nach vollständiger Anästhesie entnehmen Sie mit einem Blutentnahmegefäß Blut aus der Bauchschlagader.
   3. Legen Sie das Vollblut 2 h lang bei Raumtemperatur (RT) und zentrifugieren Sie es dann 20 Minuten lang bei 4 °C, 1522,38 x g , um Serum zu erhalten. Alitieren Sie das Serum und lagern Sie es bei -80 °C für die weitere Verwendung.
2. Milchsäure (LAC)-Assay
   HINWEIS: Die LAC-Konzentration wurde mit der kolorimetrischen Methode bestimmt.
   1. Mischen Sie die Enzymreservelösung und die Enzymverdünnungslösung in einem Volumenverhältnis von 1:100, um eine Enzymarbeitslösung herzustellen.
   2. Bereiten Sie den Farbentwickler gemäß den Anweisungen im Kit vor.
   3. In ein leeres Röhrchen 20 μl destilliertes Wasser geben.
   4. Geben Sie in ein Standardröhrchen 3 mmol/l Standardlösung.
   5. Geben Sie 20 μl der Probe in ein Messröhrchen.
   6. Geben Sie 1 ml Enzymarbeitslösung und 0,2 ml Farbentwickler in jedes Röhrchen. 10 min bei 37 °C inkubieren und dann 2 mL der Stopplösung hinzufügen.
   7. Übertragen Sie 200 μl der Reaktionslösung auf eine 96-Well-ELISA-Platte. Messen Sie den OD-Wert bei 530 nm. Berechnen Sie die LAC-Konzentration basierend auf den OD-Werten.
      HINWEIS: LAC-Konzentration = (OD-Wert der Probenvertiefung - OD-Wert der Blindvertiefung)/(Standard-Well-OD-Wert - OD-Wert der Blindwelle) x Konzentration der Standardlösung x Faktor des Verdünnungsverhältnisses.
3. Corticosteron-Assay
   HINWEIS: Im Handel erhältliche ELISA-Kits werden verwendet, um die Konzentration von Kortison im Rattenserum zu messen.
   1. Vor dem Experiment verdünnen Sie die mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierten Antikörper und Waschlösung, um eine Arbeitslösung herzustellen. Geben Sie Standardproben mit Konzentrationen von 0 nmol/L, 5 nmol/L, 15 nmol/L, 30 nmol/L, 60 nmol/L, 120 nmol/L und 240 nmol/L in einem Volumen von 20 μL auf die beschichtete Platte.
   2. Geben Sie die Serumproben (20 μl) in die jeweiligen Wells, gefolgt von der Zugabe von 200 μl Enzymkonjugat. Schütteln Sie die Platte gründlich und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang.
   3. Verwerfen Sie die Reaktionslösung und waschen Sie die Platte dreimal mit der Waschlösung (jeweils 400 μl). Nachdem Sie die Platte auf saugfähigem Papier getrocknet haben, geben Sie 100 μl des Substratfarbreagenzes in jede Vertiefung.
   4. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei RT und geben Sie dann 50 μl der Stopplösung in jede Vertiefung.
   5. Messen Sie die OD-Werte jeder Vertiefung bei 450 nm. Verwenden Sie die OD-Werte der Standard-Wells, um eine Standardkurve zu erstellen, und verwenden Sie diese dann, um die Konzentrationen der Proben-Wells zu berechnen.

5. Statistische Analyse

1. Führen Sie statistische Analysen mit einer geeigneten Softwareanwendung durch. Stellen Sie die Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung dar.
2. Wenn die Daten einer Normalverteilung folgten und Homogenität der Varianzen zeigten, führen Sie einen unabhängigen t-Test durch.
3. Wenn die Daten einer Normalverteilung folgten, aber keine Varianzgleichheit aufwiesen, führen Sie einen approximativen t-Test durch.
4. Wenn die Daten nicht einer Normalverteilung folgen, verwenden Sie zum Vergleich nicht-parametrische Tests.
5. Verwenden Sie den Chi-Quadrat-Test nach Pearson für die Analyse von Aufzählungs-/Zähldaten.
   HINWEIS: Es wurde ein Signifikanzniveau von α = 0,05 gewählt, wobei P < 0,05 als statistisch signifikant bezeichnet wird.
6. Generieren Sie die Zahlen mit einer entsprechenden Softwareanwendung.

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Ergebnisse

Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die Ratten in der Modellgruppe eine signifikante Abnahme der Griffstärke. Die Verabreichung von AFD in niedrigen, mittleren und hohen Dosen war jedoch in der Lage, diesen Effekt dosisabhängig umzukehren, wie in Abbildung 1 gezeigt. In ähnlicher Weise zeigte das Positivkontrollmedikament auch die Fähigkeit, die Veränderungen der Griffkraft umzukehren (Abbildung 1).

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Diskussion

AFD setzt sich zusammen aus Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) und Dendrobium officinale (Shihu), von dem in der traditionellen chinesischen Medizin angenommen wird, dass es die Funktion hat, die Milz zu beleben und die stagnierende Leberenergie zu verteilen. Außerdem gelten alle diese Kräuter als vorteilhaft und werde...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone test kit	German DRG company	EIA4164	Step 4.3
Curve Expert 1.4 software	CurveExpert Professional	Version 1.4	For calculation in corticosterone assay
Ethovision software	Noldus Information Technology , Netherlands	Version 15	analysis software and video tracking system
Grip strength test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-ZL	Step 3.1
Lactic acid test kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute	A019-2-1	Step 4.2
Modified multiple platform method	Neuroimmunology Laboratory of Beijing University of Chinese Medicine	None	Step 2.1
Morris water maze test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-Morris	Step 3.3
Open field test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-KC	Step 3.2
Prism	GraphPad	Verson 8	For generating figures
SPSS 26.0	IBM	Verson 26.0	Statistical analysis
Wistar rats	SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd		license number: SCXK (Jing) 2019-0010