L'effetto del decotto anti-fatica sui comportamenti e sugli indicatori sierologici in un modello di ratto a fatica centrale

Riepilogo

Qui, introduciamo un protocollo per valutare gli effetti del decotto anti-fatica (AFD) sulla fatica centrale nei ratti modellato con il metodo a piattaforma multipla modificata (MMPM) monitorando sia le loro risposte comportamentali che i marcatori sierologici.

Abstract

Questo studio mirava a valutare gli effetti del decotto anti-fatica (AFD) contro l'affaticamento centrale osservando i comportamenti e gli indicatori sierologici dei ratti modellati con il metodo a piattaforma multipla modificata (MMPM) dopo l'intervento farmacologico. Le misurazioni della forza di presa sono state utilizzate per valutare la forza muscolare dei ratti. Il test in campo aperto è stato utilizzato per valutare il comportamento ansioso, mentre il test del labirinto d'acqua di Morris è stato condotto per valutare la funzione di memoria dei ratti. A seguito delle valutazioni comportamentali, sono stati raccolti campioni di siero di ratto per misurare le concentrazioni di corticosterone (CORT) e acido lattico (LAC). La concentrazione di LAC è stata determinata utilizzando il metodo colorimetrico, mentre la concentrazione di CORT è stata misurata utilizzando il metodo ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Rispetto al gruppo di controllo in bianco, seguendo la modellazione MMPM, i ratti hanno mostrato riduzioni significative della forza di presa e una ridotta capacità di memoria. L'analisi sierica ha rivelato un aumento dei livelli di LAC e CORT nei ratti del gruppo modello. L'AFD può invertire notevolmente questi cambiamenti negativi in una certa misura. Questi risultati evidenziano gli effetti positivi dell'AFD e del coenzima Q10 sulle capacità fisiche e cognitive e le alterazioni dei livelli sierici di biomarcatori dei ratti con affaticamento centrale.

Introduzione

L'affaticamento è un fenomeno multiforme e aspecifico che è tipicamente caratterizzato da sensazioni di stanchezza e ridotta capacità di funzionare¹. Può essere classificata come affaticamento periferico, che si verifica a livello muscolare, o affaticamento centrale, che origina nel sistema nervoso centrale ^3,4. L'affaticamento centrale prolungato può contribuire in modo significativo a problemi psicologici, tra cui ansia, depressione, disagio psicologico e problemi di memoria ^5,6. Nonostante causi un disagio significativo, c'è una scarsità di farmaci specifici mirati all'affaticamento centrale⁷. Mentre il metilfenidato, uno stimolante del sistema nervoso centrale, può fornire un sollievo temporaneo, i suoi effetti collaterali, come l'insonnia e le palpitazioni, possono peggiorare la condizione ^8,9.

In precedenti applicazioni cliniche, la medicina tradizionale cinese ha mostrato risultati promettenti nel trattamento dell'affaticamento centrale, incorporando approcci come decotti orali, agopuntura e Tai Chi 10,11,12. Il decotto anti-fatica (AFD) è una formula efficace sviluppata dal professor Li Feng sulla base di una vasta esperienza clinica e ha dimostrato effetti terapeutici positivi. È costituito da Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) e Dendrobium officinale (Shihu), in un rapporto di 15: 15: 10: 5: 7: 8. Il decotto di AFD è stato concentrato a 110 ml dopo l'ebollizione con dieci volte il volume di acqua deionizzata per 1 ora tre volte. In uno studio precedente, abbiamo stabilito un modello animale di affaticamento centrale utilizzando il metodo MMPM (Modified Multiple Platform Method) e abbiamo confermato la manifestazione dell'affaticamento centrale attraverso valutazioni comportamentali e dei neurotrasmettitori del sistema nervoso centrale¹³. In questo studio, abbiamo utilizzato l'intervento AFD nel modello animale di affaticamento centrale per valutarne gli effetti farmacologici attraverso valutazioni comportamentali.

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Protocollo

Questo lavoro di ricerca aderisce alle linee guida etiche per il benessere degli animali. Sono state mantenute cure e condizioni di alloggio adeguate per garantire la salute e il benessere degli animali e tutte le procedure sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (BUCM-4-2019041504-2094).

1. Allevamento e raggruppamento di animali

NOTA: Durante lo studio, il benessere degli animali è stato mantenuto seguendo i principi delle 3R (Riduzione, Perfezionamento e Sostituzione).

1. Per questo studio, selezionare 54 ratti Wistar privi di patogeni specifici (SPF) di sei settimane con un peso corporeo compreso tra 210 g ± 10 g.
2. Alloggiare i ratti nella struttura per animali in condizioni controllate: temperatura di 23 ± 2 °C, umidità relativa del 50% e un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore. Lasciare acclimatare gli animali per 3 giorni prima dell'esperimento.
3. Dividere casualmente i ratti in un gruppo di controllo in bianco (etichettato come "a" nelle figure), un gruppo modello (etichettato come "b" nelle figure), un gruppo AFD-dose bassa (AFD-L; etichettato come "c" nelle figure), un gruppo AFD-dose media (AFD-M; etichettato come "d" nelle figure), un gruppo AFD-dose alta (AFD-H; etichettato come "e" nelle figure), un gruppo di Coenzima Q10 (CoQ10; etichettato come "f" nelle figure), con 9 ratti in ogni gruppo, utilizzando un metodo della tabella dei numeri casuali.

2. Modellazione e intervento

NOTA: L'istituzione di questo modello si è basata sulla letteratura precedente¹³.

1. Usa la scatola di modellazione autocostruita (fornita dal Laboratorio di Neuroimmunologia dell'Università di Medicina Cinese di Pechino).
   NOTA: La scatola per modellismo ha una lunghezza di 110 cm, una larghezza di 60 cm e un'altezza di 40 cm. Il fondo è fissato con 15 piattaforme circolari (diametro 6,5 cm, altezza 8 cm). La distanza orizzontale tra le due piattaforme è di 13 cm e la distanza verticale è di 10 cm. La scatola per campo aperto ha una lunghezza, una larghezza e un'altezza rispettivamente di 100 cm, 100 cm e 35 cm. Il fondo è nero e il muro è blu scuro. Il fondo della scatola di campo aperto è diviso in 25 sezioni quadrate con dimensioni di 25 cm, con i 9 quadrati centrali designati come zona centrale e i 16 quadrati esterni come zona periferica.
2. Assicurarsi che il livello dell'acqua nella piscina sia di circa 1 cm sopra la piattaforma e che la temperatura dell'acqua sia mantenuta a 23 ± 2 °C.
3. Dopo l'inizio dell'esperimento, posiziona il ratto nella scatola ricoperta di rete metallica sulla superficie e premila con dei pesi per evitare che gli animali scappino. Sospendi una quantità sufficiente di cibo sotto la rete metallica e fornisci acqua potabile pulita.
4. Posiziona il topo nel gruppo di modelli nella scatola alle 18:00 di ogni giorno e tiralo fuori alle 8:00 del giorno successivo. Dopo ogni sessione di modellazione, asciuga il ratto e rimettilo in una gabbia pulita. Eseguire la modellazione ininterrottamente per 21 giorni.
5. Durante l'esperimento, pulisci la scatola, cambia l'acqua ogni giorno e fornisci cibo a sufficienza.
6. Il 15^{° giorno di} modellazione, somministrare gli agenti tramite lavanda gastrica alle 10:00 di ogni giorno per un periodo continuativo di 7 giorni.
   1. Somministrare il gruppo AFD-L alla dose di 3,24 g/kg/giorno, il gruppo AFD-M a 6,48 g/kg/giorno e il gruppo AFD-H a 12,96 g/kg/giorno. Somministrare il coenzima Q10 alla dose di 10 mg/kg/die.
   2. Quando si somministrano gli agenti tramite lavanda gastrica, preparare una sospensione mescolando la dose necessaria in acqua distillata. Il volume di somministrazione per ciascun gruppo è di 10 ml/kg. Dare al grezzo e ai gruppi modello la stessa quantità di acqua distillata.
      NOTA: I dosaggi somministrati ai ratti sono stati calcolati utilizzando il metodo della superficie corporea (BSA) e convertiti secondo i normali dosaggi terapeutici per l'uomo¹⁴.

3. Valutazioni comportamentali

1. Forza di presa dei ratti
   1. Afferra la coda del topo e posizionala delicatamente sul misuratore di forza di presa.
   2. Tira il ratto all'indietro con una forza uniforme, assicurandoti che il sistema informatico registri correttamente i dati.
      NOTA: Prima degli esperimenti, i tecnici erano addestrati a maneggiare i ratti per applicare la forza in modo coerente.
   3. Ripetere questo processo tre volte e calcolare la media delle tre misurazioni come valore finale della forza di presa.
      NOTA: Per ridurre al minimo gli errori causati da fattori umani, lasciare che una persona conduca l'intero esperimento.
2. Test in campo aperto nei ratti
   1. Conduci gli esperimenti comportamentali in un ambiente poco illuminato e silenzioso. Prima dell'inizio di ogni esperimento, posizionare i ratti nella stanza del comportamento per 1 ora di adattamento.
   2. Assicurati che tre sperimentatori siano coinvolti nell'operazione e indossino abiti neri quando posizionano o guidino i ratti. Durante l'esperimento, assicurati che gli sperimentatori non oltrepassino i confini della scatola con il corpo o le braccia.
   3. Aprire il software di analisi.
      1. Fai clic su File nel menu in alto e seleziona Nuovo esperimento per creare un nuovo progetto. Nelle Impostazioni dell'Arena, scegli la forma corrispondente all'arena in cui si muoverà il topo.
      2. Usando il mouse, disegna l'arena sullo schermo. Calibra la telecamera e salva le impostazioni dell'arena.
   4. Consenti a un secondo sperimentatore, vestito con abiti neri, di tenere il topo per la schiena, posizionarlo in sequenza al centro dell'area designata e ritirare rapidamente la mano.
   5. Avvia una nuova registrazione. Impostare la durata della registrazione su 5 min.
   6. Dopo il periodo di osservazione di 5 minuti, rimuovere rapidamente il ratto dalla scatola del campo aperto e pulire le sue feci. Utilizzare il 75% di alcol per pulire la scatola da campo aperto.
   7. Ripeti il processo per tutti i ratti.
   8. Osservare e registrare (1) la distanza totale percorsa, (2) il numero di attraversamenti della zona centrale: il numero di volte in cui gli arti del ratto si incrociano nei quadrati della griglia centrale e (3) il tempo trascorso nella zona centrale, cioè il tempo trascorso dal ratto nei 9 quadrati della griglia centrale.
3. Labirinto d'acqua di Morris nei ratti
   1. Conduci gli esperimenti comportamentali in un ambiente poco illuminato e silenzioso. Prima di iniziare ogni esperimento, posizionare i ratti nella stanza del comportamento per 1 ora di adattamento.
      NOTA: I ratti sono stati sottoposti a 4 giorni di addestramento; Il 5^{° giorno iniziò} l'esperimento formale.
   2. Assicurarsi che il livello dell'acqua nella piscina sia di circa 1 cm sopra la piattaforma e che la temperatura dell'acqua sia mantenuta a 23 ± 2 °C.
   3. Assicurati che tre sperimentatori siano coinvolti nell'operazione e indossino abiti neri quando posizionano o guidino i ratti.
   4. Dividi la piscina d'acqua in quattro quadranti. Fissare una piattaforma al centro del secondo quadrante. Attacca pezzi di carta di diversi colori e forme al centro delle pareti di ogni quadrante.
   5. Aprire il software di analisi.
      1. Fai clic su File nel menu in alto e seleziona Nuovo esperimento per creare un nuovo progetto. Nelle Impostazioni dell'Arena, scegli la forma corrispondente all'arena in cui si muoverà il topo.
      2. Usando il mouse, disegna l'arena sullo schermo. Calibra la telecamera e salva le impostazioni dell'arena.
   6. Durante il periodo di apprendimento, lascia che un altro sperimentatore posizioni in sequenza il ratto di fronte alla parete della piscina in ogni quadrante. L'ordine di collocamento è diverso ogni giorno come segue:
      1. Il primo giorno, posiziona il ratto nel seguente ordine: primo quadrante, secondo quadrante, terzo quadrante, quarto quadrante.
      2. Il secondo giorno, posiziona il ratto nel seguente ordine: secondo quadrante, primo quadrante, quarto quadrante, terzo quadrante.
      3. Il terzo giorno, posizionare il ratto nel seguente ordine: quarto quadrante, terzo quadrante, secondo quadrante, primo quadrante;
      4. Il quarto giorno, posiziona il ratto nel seguente ordine: terzo quadrante, primo quadrante, quarto quadrante, secondo quadrante.
   7. Se il topo non riesce a trovare la piattaforma entro 120 s, guidalo verso la piattaforma e lascialo rimanere su di essa per 10 s.
   8. Dopo aver completato l'esperimento quotidiano, lascia che il terzo sperimentatore asciughi l'acqua dal corpo del ratto usando un asciugamano e asciugalo con un asciugacapelli. Eseguire questa operazione in un'altra stanza per evitare interferenze di rumore.
   9. Nell'esperimento formale, rimuovere la piattaforma e posizionare il ratto nel terzo quadrante. Registra la traiettoria del movimento del ratto entro 120 s.
   10. Osservare e registrare (1) il tempo trascorso nel quadrante in cui si trovava la piattaforma e (2) la latenza di fuga, che è il tempo impiegato dal ratto per raggiungere la piattaforma entrando per la prima volta nella piscina d'acqua.

4. Analisi biochimica del siero

1. Elaborazione dei campioni
   NOTA: Il giorno prima del campionamento era consentito un digiuno sul cibo, ma non sull'acqua.
   1. Anestetizzare i ratti utilizzando una soluzione di pentobarbital sodico al 2% (p/v) tramite iniezione intraperitoneale a 0,5 ml/100 g di peso corporeo.
   2. Dopo l'anestesia completa, raccogliere il sangue dall'aorta addominale utilizzando un recipiente per il prelievo di sangue.
   3. Porre il sangue intero a temperatura ambiente (RT) per 2 ore, quindi centrifugarlo a 4 °C, 1522,38 x g per 20 minuti per ottenere il siero. Aliquotare e conservare il siero a -80 °C per un ulteriore utilizzo.
2. Dosaggio dell'acido lattico (LAC)
   NOTA: La concentrazione di LAC è stata determinata utilizzando il metodo colorimetrico.
   1. Miscelare la soluzione di riserva enzimatica e la soluzione di diluizione enzimatica in un rapporto di volume 1:100 per preparare una soluzione enzimatica funzionante.
   2. Preparare lo sviluppatore di colore secondo le istruzioni del kit.
   3. In una provetta vuota, aggiungere 20 μl di acqua distillata.
   4. In una provetta standard, aggiungere 3 mmol/L di soluzione standard.
   5. In una provetta di misura, aggiungere 20 μl del campione.
   6. Aggiungere 1 mL di soluzione enzimatica di lavoro e 0,2 mL di ossidante colorante a ciascuna provetta. Incubare a 37 °C per 10 minuti e quindi aggiungere 2 mL della soluzione di stop.
   7. Trasferire 200 μl della soluzione di reazione su una piastra ELISA a 96 pozzetti. Misurare il valore OD a 530 nm. Calcolare la concentrazione di LAC in base ai valori OD.
      NOTA: Concentrazione LAC = (valore OD del pozzetto del campione - valore OD del pozzetto vuoto)/( valore OD del pozzetto standard - valore OD del pozzetto vuoto) x concentrazione della soluzione standard x fattore del rapporto di diluizione.
3. Dosaggio del corticosterone
   NOTA: I kit ELISA acquistati in commercio vengono utilizzati per misurare la concentrazione di cortisone nel siero di ratto.
   1. Prima dell'esperimento, diluire gli anticorpi coniugati con perossidasi di rafano (HRP) e soluzione di lavaggio per creare una soluzione funzionante. Aggiungere campioni standard con concentrazioni di 0 nmol/L, 5 nmol/L, 15 nmol/L, 30 nmol/L, 60 nmol/L, 120 nmol/L e 240 nmol/L alla piastra rivestita in volumi di 20 μL.
   2. Aggiungere i campioni di siero (20 μl) ai rispettivi pozzetti, quindi aggiungere 200 μl di coniugato enzimatico. Agitare accuratamente la piastra e incubarla per 60 minuti.
   3. Eliminare la soluzione di reazione e lavare la piastra tre volte con la soluzione di lavaggio (400 μl ogni volta). Dopo aver asciugato la piastra su carta assorbente, aggiungere 100 μl del reagente colorante del substrato a ciascun pozzetto.
   4. Incubare la piastra a RT per 15 minuti, quindi aggiungere 50 μl della soluzione di arresto a ciascun pozzetto.
   5. Misurare i valori OD di ciascun pozzetto a 450 nm. Utilizzare i valori OD dei pozzetti standard per generare una curva standard e quindi utilizzarla per calcolare le concentrazioni dei pozzetti del campione.

5. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche utilizzando un'applicazione software appropriata. Rappresenta i dati di misurazione come media ± deviazione standard.
2. Se i dati hanno seguito una distribuzione normale e hanno mostrato omogeneità delle varianze, eseguire un t-test indipendente.
3. Se i dati seguivano una distribuzione normale ma non avevano l'uguaglianza delle varianze, eseguire un test t approssimato.
4. Se i dati non seguono una distribuzione normale, utilizzare test non parametrici per il confronto.
5. Utilizzare il test del chi-quadrato di Pearson per l'analisi dei dati di enumerazione/conteggio.
   NOTA: È stato scelto un livello di significatività di α = 0,05, dove P < 0,05 è indicato come statisticamente significativo.
6. Genera le figure utilizzando un'applicazione software appropriata.

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Risultati

Rispetto al gruppo di controllo, i ratti del gruppo modello hanno mostrato diminuzioni significative della forza di presa. Tuttavia, la somministrazione di AFD a dosi basse, medie e alte è stata in grado di invertire questo effetto in modo dose-dipendente, come mostrato nella Figura 1. Allo stesso modo, il farmaco di controllo positivo ha anche dimostrato la capacità di invertire le variazioni della forza di presa (Figura 1).<...

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Discussione

L'AFD è composto da Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) e Dendrobium officinale (Shihu), che si ritiene abbia la funzione di rinvigorire la milza e disperdere l'energia epatica stagnante nella medicina tradizionale cinese. Inoltre, si ritiene che tutte queste erbe possiedano un profilo di sicurezza favorevole e sono quin...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone test kit	German DRG company	EIA4164	Step 4.3
Curve Expert 1.4 software	CurveExpert Professional	Version 1.4	For calculation in corticosterone assay
Ethovision software	Noldus Information Technology , Netherlands	Version 15	analysis software and video tracking system
Grip strength test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-ZL	Step 3.1
Lactic acid test kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute	A019-2-1	Step 4.2
Modified multiple platform method	Neuroimmunology Laboratory of Beijing University of Chinese Medicine	None	Step 2.1
Morris water maze test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-Morris	Step 3.3
Open field test device	Beijing Zhongshi Di Chuang limited company	ZS-KC	Step 3.2
Prism	GraphPad	Verson 8	For generating figures
SPSS 26.0	IBM	Verson 26.0	Statistical analysis
Wistar rats	SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd		license number: SCXK (Jing) 2019-0010