Modelo de trasplante heterotópico auxiliar de hígado entero en rata que utiliza una hepaticoureterostomía para estudios de rechazo de aloinjertos

Resumen

El protocolo de trasplante hepático auxiliar heterotópico en ratas descrito aquí ofrece una herramienta práctica de investigación para explorar los mecanismos de rechazo del aloinjerto hepático. Este modelo ayuda a aliviar los obstáculos quirúrgicos y el estrés animal del trasplante ortotópico de hígado en ratas.

Resumen

Los modelos de trasplante de animales pequeños son indispensables para los estudios de tolerancia a órganos que investigan intervenciones terapéuticas factibles en estudios preclínicos. Los protocolos de trasplante de hígado de rata (LTx) suelen utilizar un modelo ortotópico en el que se extrae el hígado nativo de los receptores y se sustituye por el hígado de un donante. Este procedimiento quirúrgico técnicamente exigente requiere habilidades microquirúrgicas avanzadas y se complica aún más por los largos tiempos de isquemia anhepática y de la parte inferior del cuerpo. Esto impulsó el desarrollo de un método heterotópico menos complicado que se puede realizar más rápido sin tiempo de isquemia anhepática o de la parte inferior del cuerpo, lo que reduce el estrés postoperatorio para el animal receptor.

Este protocolo heterotópico de LTx incluye dos pasos principales: extirpar el hígado de la rata donante y trasplantar todo el hígado a la rata receptora. Durante la extirpación del hígado del donante, el cirujano liga la vena cava suprahepática (SHVC) y la arteria hepática (HA). En el lado receptor, el cirujano extirpa el riñón izquierdo y coloca el hígado del donante con la vena porta (VP), la vena cava infrahepática (IHVC) y el conducto biliar frente a los vasos renales. Además, el cirujano anastomosa la vena renal del receptor de extremo a extremo con el IHVC del hígado y arterializa la VP con la arteria renal utilizando un stent. La hepaticoureterostomía se utiliza para el drenaje biliar mediante la anastomosis del conducto biliar al uréter del receptor, lo que permite la descarga de la bilis a través de la vejiga.

La duración media del trasplante fue de 130 min, la duración de la isquemia fría fue de alrededor de 35 min y la duración de la isquemia caliente fue de menos de 25 min. La histología histológica de hematoxilina y eosina del hígado auxiliar de trasplantes singénicos mostró una estructura normal de los hepatocitos sin alteraciones parenquimatosas significativas a los 30 días después del trasplante. Por el contrario, las muestras de injerto alogénico postrasplante de 8 días demostraron una infiltración linfocítica extensa con una puntuación del índice de actividad de rechazo del esquema de Banff de 9. Por lo tanto, este método LTx facilita un modelo de rechazo de baja morbilidad alternativo al LTx ortotópico.

Introducción

La LTx de los animales pequeños es un modelo inestimable para investigar los mecanismos de rechazo hepático. El trasplante hepático auxiliar heterotópico con arterialización de la vena porta (HALT-PVA) en ratas fue introducido en 1968 por Lee y Edgington¹cuando informaron sobre el uso de la vena renal y la arteria de un receptor para revascularizar un hígado auxiliar injertado. Posteriormente, Hess et ^al.2 mejoraron el protocolo con la mitigación de la competencia funcional entre los hígados nativos y auxiliares mediante la reducción del tamaño del hígado nativo y del donante, junto con la reconstrucción de la conexión del conducto biliar del donante, lo que resultó en la supervivencia del injerto a largo plazo. Con la introducción de la anastomosis del manguito ^3,4 se realizaron nuevos refinamientos, y Schleimer et ^al.5 determinaron el diámetro óptimo del stent para regular el flujo sanguíneo con el fin de obtener el flujo portal fisiológico y evitar la hiper o hipoperfusión del injerto. Otros investigadores desarrollaron alteraciones significativas en el método mediante el uso de la arteria esplénica⁶ o ilíaca^{común 7} para el suministro de sangre del injerto, mientras que algunos desarrollaron modelos que utilizaban solo sangre venosa⁸ o solo sangre arterial a través de la arteria hepática⁹ para suministrar el injerto hepático auxiliar.

El presente estudio planteó la hipótesis de que la competencia funcional del hígado nativo no interferiría con el rechazo del aloinjerto, por lo que desarrollamos un protocolo basado en el modelo¹⁰ de Schleimer regulado por flujo que no incluyó ninguna reducción de tamaño del hígado nativo o auxiliar. Se seleccionó el lado izquierdo del receptor para ubicar el injerto porque proporcionaba una orientación óptima entre los vasos renales del receptor y los vasos hepáticos del donante. Inicialmente, intentamos la reconstrucción biliar mediante hepaticoduodenostomía, pero estos ensayos no hicieron más que confirmar la afirmación de Schleimer de que "el drenaje biliar es el talón de Aquiles del trasplante hepático"¹⁰. Esto impulsó el desarrollo de una nueva técnica en la que el conducto biliar se anastomosa de extremo a extremo utilizando un stent con el uréter del receptor, lo que permite la descarga de bilis a través de la vejiga. Un beneficio notable del uso de una hepaticoureterostomía es que la funcionalidad del injerto hepático se puede monitorear diariamente mediante la observación de la orina; Un injerto de hígado productor de bilis colorea la orina de un amarillo brillante. La Figura 1 representa la descripción esquemática del método HALT-PVA.

Una ventaja importante de la LTx heterotópica sobre la ortotópica se relaciona con la ausencia de tiempo de isquemia anhepática o total de la parte inferior del cuerpo, lo que permite recuperaciones más rápidas y fáciles para los receptores heterotópicos. Además, los estudios inmunológicos de LTx que utilizan métodos ortotópicos a menudo se basan en el rechazo grave o la muerte del receptor como criterio de valoración experimental, lo que no es el caso de los trasplantes heterotópicos, en los que el animal permanece sano incluso si el aloinjerto deja de funcionar debido al rechazo. Ambas características del método heterotópico apoyan los principios de la iniciativa internacional de las 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento)¹¹, que promueve un marco para minimizar el dolor, el sufrimiento y la angustia experimentados por los animales de investigación y mejorar su bienestar.

El modelo HALT-PVA reportado aquí es un método práctico y confiable para investigar los mecanismos de rechazo del injerto hepático en estudios preclínicos. Esta útil técnica experimental ayuda a superar las considerables demandas quirúrgicas y el estrés animal de la LTx ortotópica en ratas. En el futuro, tenemos la intención de utilizar este método para investigar los mecanismos del rechazo inmunitario agudo mientras exploramos nuevas dianas y estrategias terapéuticas para suprimir el rechazo del injerto hepático.

Protocolo

Los animales fueron criados y alojados en condiciones específicas libres de patógenos en las instalaciones de cuidado animal del Instituto de Investigación Médica de la Universidad de Wisconsin (UW)-Madison de acuerdo con las pautas institucionales. El protocolo del estudio (No. M006022) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Washington, y todos los animales fueron tratados éticamente.

1. Animales

1. Utilice ratas hembras Lewis adultas que pesen entre 205 y 235 g y machos Lewis que pesen 250-280 g como ratas donantes. Utilice ratas Lewis y Brown Norway macho adultas que pesen entre 365 y 420 g como recipientes.
2. Realizar trasplantes singénicos mediante el trasplante de donantes de Lewis a receptores de Lewis, mientras que los trasplantes alogénicos utilizaron donantes de Lewis trasplantados a receptores de Brown Norway.
3. Realizar todas las cirugías por dos personas utilizando un microscopio de doble cabezal.

2. Procedimiento auxiliar de obtención de hígado de donante

1. Anestesiar a la rata donante con inhalación de isoflurano al 5% en una cámara de inducción. Registra el peso de la rata y afeita el abdomen con una tijera eléctrica.
2. Coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla de cirugía caliente con la nariz en un cono de anestesia e inmovilice las extremidades con cinta adhesiva. Desinfectar el abdomen con alcohol al 75% y bajar el isoflurano al 2%.
3. Haz una incisión longitudinal en la línea media de la piel y el músculo desde el pubis hasta el xifoides con unas tijeras. Cerca del punto medio de la incisión longitudinal, extiéndala lateralmente hacia la izquierda y la derecha, luego instale retractores a ambos lados de la pared abdominal y la apófisis xifoides.
4. Con hisopos de algodón húmedos, retraiga los intestinos hacia el lado izquierdo del abdomen mientras usa tijeras de resorte para cortar los ligamentos gastrointestinales unidos al hígado, luego inmovilice los intestinos con una gasa humedecida. Cubra el hígado con un pequeño trozo de gasa estéril humedecida con solución salina tibia.
5. Use hisopos de algodón húmedos para retraer el hígado y diseccionar los ligamentos falciformes, triangulares, hepatogásticos y hepatoduodenales. A continuación, cauterizar con pinzas bipolares y dividir los vasos paraesofágicos entre el lóbulo caudado lateral izquierdo y anterior.
6. Con pinzas angulares o portaagujas, diseccione detrás del SHVC inferior al diafragma, luego pase una sutura de seda 5-0 por debajo del SHVC y haga un nudo doble sin apretar para su uso posterior.
7. Retraiga el lóbulo lateral inferior derecho hacia arriba, corte el ligamento e inmovilice bajo una gasa humedecida. Aislar la IHVC desde el tejido retroperitoneal hasta la vena renal derecha y ligar la vena suprarrenal derecha con una sutura de seda 6-0 lo más cerca posible de la IHVC. Divida esta vena más tarde cuando se extraiga el injerto.
8. Con una aguja de hidrodisección de 27 G (Figura 2A), disocie la VP del tejido conectivo circundante y sepárela de las venas pilórica y esplénica ligándolas y dividiéndolas con una sutura de seda 7-0.
9. Aísle, lige con sutura de seda 6-0 y divida la arteria hepática común cerca de donde pasa por debajo de la VP.
10. Ligar, el conducto biliar con una sutura de seda 5-0 en la ramificación de la arteria gastroduodenal, preservando el tejido graso alrededor del conducto biliar tanto como sea posible; En particular, evite separar el conducto biliar de la arteria hepática adecuada y mantenga la longitud total lo más corta posible.
11. Con unas tijeras de resorte, haga una pequeña incisión en la pared del conducto biliar proximal a la ligadura. Inserte un stent de tubo de poliimida de 0,0215" de diámetro por 5 mm de largo en la luz del conducto biliar y asegúrelo con una sutura de seda 6-0, dejando un extremo de la sutura largo para su uso posterior. Divida el conducto biliar cortando entre las ligaduras 5-0 y 6-0.
12. Marque la parte superior de la IHVC y la PV con una pluma de tinte quirúrgico para ayudar a alinear los vasos durante la anastomosis, luego pinza la vena porta con una pinza de microvasos lo más distal posible al hígado.
13. Insertar una jeringa de 20 mL con una aguja de 26 G en el PV proximal a la micropinza y perfundir el hígado con 10-15 mL de solución salina heparinizada helada; Al mismo tiempo, divida el IHVC con unas tijeras de resorte lo más cerca posible de la vena renal derecha.
14. Extirpar el hígado con unas tijeras de resorte diseccionando el PV proximal a la micropinza, apretando la sutura 5-0 previamente colocada alrededor del SHVC y diseccionando el diafragma para seccionar la vena cava intratorácica.
15. Continúe diseccionando los ligamentos restantes en la parte posterior del hígado y divida la vena suprarrenal previamente ligada. Coloque el hígado extirpado en solución salina fría sobre hielo.

3. Procedimiento auxiliar de trasplante de receptor de hígado

1. Anestesiar a la rata receptora con inhalación de isoflurano al 5% en una cámara de inducción. Registra el peso de la rata y afeita el abdomen con una tijera eléctrica.
2. Coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla de cirugía caliente con la nariz en un cono de anestesia e inmovilice las extremidades con cinta adhesiva. Aplique un lubricante ocular, desinfecte el abdomen con alcohol al 75% y baje el isoflurano al 2%.
3. Con unas tijeras, haga una incisión longitudinal en la piel y el músculo de la línea media desde el pubis hasta el xifoides, luego instale retractores a ambos lados de la pared abdominal.
4. Con hisopos de algodón húmedos, retraiga los intestinos hacia el lado derecho del abdomen y cúbralos con una gasa humedecida. Aplique otra gasa húmeda para cubrir el estómago, el bazo y el hígado, exponiendo el riñón izquierdo y los vasos renales.
5. Con una aguja de hidrodisección de 27 G y pinzas de punta roma, separe la vena renal izquierda de la arteria renal, eliminando cuidadosamente la grasa y el tejido conectivo de ambos vasos.
6. Aísle las venas gonadales y suprarrenales, y use seda 6-0 para ligarlas proximales a la vena renal temporalmente. Cauterizar, con pinzas bipolares, todas las micro ramas laterales que aíslan la vena renal y la arteria entre la aorta/VC y el riñón.
7. Movilizar y ligar el uréter con una sutura de seda 6-0 en el polo inferior. Marque la vena y la arteria renal con un bolígrafo de tinte quirúrgico para ayudar a orientar los vasos durante la anastomosis y asegurarse de que no haya torceduras.
8. Pinzar la arteria renal y la vena renal con una pinza de microvasos lo más cerca posible de la aorta y la VC. Transito la arteria renal con unas tijeras de resorte justo después de la bifurcación del vaso y divide la vena renal aproximadamente a mitad de camino entre la VC y el riñón. Movilizar el riñón izquierdo del tejido conectivo circundante y extraerlo.
9. Enjuague ambos vasos con solución salina heparinizada con una aguja de hidrodisección de 27 G para eliminar toda la sangre restante.
10. Con unas tijeras de resorte, corte una pequeña abertura de boca de pez en la horquilla de la bifurcación de la arteria renal para hacer una abertura en forma de embudo e inserte un stent de 8 mm cortado de un catéter de 26 G (Figura 2B). Asegure el stent con una sutura de seda 6-0, dejando un extremo de la sutura largo para su uso posterior.
11. Introduzca el hígado del donante y colóquelo con el PV, el IHVC y el conducto biliar frente a la vena renal y la arteria izquierda del receptor. Con una sutura de nailon 9-0, instale dos suturas de soporte en lados opuestos de la conexión entre la IHVC y la vena renal.
12. Compare el ancho de los vasos y haga una pequeña incisión en la boca del pez con unas tijeras de resorte en la cara de la vena renal hasta que tenga un ancho similar al IHVC del donante (Figura 2C).
13. Usando una sutura de nylon 9-0, anastomusque el IHVC hepático de extremo a extremo a la vena renal con 9 o 10 suturas continuas a través de las paredes frontal y posterior del vaso. Alternativamente, utilice un método de manguito para completar esta anastomosis ^3,4.
14. Confirme que la colocación de la arteria renal está por debajo de la IHVC (Figura 2D) e inserte el stent previamente colocado en la arteria renal en la vena porta del hígado y asegúrelo con una sutura de seda 6-0, dejando un extremo de la sutura largo para que se adhiera a la rosca opuesta en la arteria. Junte los extremos para evitar que cada uno se deslice fuera del stent.
15. Retire primero la micropinza de la vena renal y, a continuación, retire la micropinza de la arteria renal.
16. Durante la reperfusión hepática, se utilizan gasas e hisopos de algodón para aplicar una ligera presión alrededor de la región de la anastomosis hasta lograr una anastomosis permeable (Figura 2D). Retirar las ligaduras temporales previamente colocadas en las venas suprarrenal y gonadal.
17. Movilice cuidadosamente aproximadamente 10 mm por el extremo del uréter izquierdo desde el tejido conectivo circundante, dejando una cantidad significativa de tejido graso adherido. Con unas tijeras de muelle, realizar una pequeña incisión en la pared del uréter proximal a la ligadura 5-0 previamente colocada.
18. Insertar el stent de poliimida previamente adherido a la vía biliar en la pequeña incisión realizada en la pared del uréter. Asegúrelo con una sutura de seda 6-0 y ate un extremo con el hilo largo en el lado del conducto biliar del stent, juntando ambos extremos firmemente.
19. Regrese los intestinos a su posición natural (Figura 2E), irrigar con 2-3 mL de solución salina y cierre el abdomen en dos capas con suturas de seda 3-0.
20. Inyecte 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea, coloque al receptor en una jaula limpia y climatizada y controle la recuperación durante 1-2 horas antes de devolver al animal al establo de animales.

4. Seguimiento postquirúrgico

1. A partir del día 2 después de la cirugía, inyecte heparina (1 UI/g) por vía subcutánea a los receptores de trasplantes alogénicos diariamente.
2. A partir del día 2 después de la cirugía, inyecte heparina (1 UI/2 g) por vía subcutánea a los receptores de trasplantes singénicos cada dos días.

Resultados

En la actualidad, se han utilizado 29 pares de ratas para establecer el protocolo HALT-PVA, 17 trasplantes singénicos y 12 trasplantes alogénicos. Los hígados trasplantados singénicos sobrevivieron a su criterio de valoración experimental designado de 8 o 30 días con una tasa de éxito del 70%, mientras que los hígados trasplantados alogénicos sobrevivieron a sus criterios de valoración designados de 3 u 8 días con una tasa de éxito del 50%. Los fracasos incluyen ratas que mur...

Discusión

El trasplante de hígado es la única opción de tratamiento para los pacientes con enfermedad hepática terminal, con casi 9.000 LTxs realizados anualmente en los EE. UU.¹³. Desafortunadamente, el rechazo inmunológico se observa hasta en el 25% de los receptores de LTx, y este rechazo es perjudicial para el órgano trasplantado y el paciente^14,15. Para mejorar los resultados después de la LTx, se requie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	C013D
5-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-50
6-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-60
7-0 Silk ties	Teleflex	103-s
9-0 Polyamide Suture	AROSurgical	T05A09N10-13	Black
Bipolar Cautery	Codman & Shurtleff Inc.	P.H. 234
Buprenorphine HCL	Hospira	409201232
Forceps, Adson-Brown	Fine Science Tools	11627-12	12.5 cm
Forceps, Angled Dumont	Fine Science Tools	11253-25	Medical #5/45 11 cm
Forceps, Suture Tying	Fine Science Tools	18025-10	10 cm
Heparin Sodium Injection, USB	Fresenius Kabi	504015	10,000 USP units per 10 mL
Hydrodissection Cannula	Ambler Surgical	1021E	27 G
Isoflurane	Dechra Vet. Products	17033-091-25
I.V. Catheter	Kendall	2619PUR	26 G x 3/4"
Magnetic Retraction System	Fine Science Tools	18200-50
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-05	6 mm
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-06	4 mm
Micro Clamp Applicator	Fine Science Tools	18057-14	14 cm
Micro Needle Holder	S&T	C-14	14 cm
Microscope	Zeiss	Universal S3	Dual head
Ophthalmic Ointment	Puralube	14590500
Polyimidi Tubing	Cole Parmer	95820-04	OD 0.0215", ID 0.0195", wall 0.0010"
Saline	Baxter	281324	0.9% Sodium Chloride
Surgical Spring Scissors	S&T	SDC-15	Blunt 14 cm
Surgical Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Vannas 14 cm