Modèle de greffe de foie entier auxiliaire hétérotopique utilisant une hépaticourétérostomie pour des études de rejet d’allogreffe

Résumé

Le protocole de greffe hépatique auxiliaire hétérotopique de rat décrit ici offre un outil d’investigation pratique pour explorer les mécanismes de rejet de l’allogreffe hépatique. Ce modèle permet d’atténuer les obstacles chirurgicaux et le stress animal de la transplantation hépatique orthotopique chez le rat.

Résumé

Les modèles de transplantation de petits animaux sont indispensables pour les études de tolérance d’organe qui étudient les interventions thérapeutiques réalisables dans les études précliniques. Les protocoles de transplantation hépatique de rat (LTx) utilisent généralement un modèle orthotopique où le foie natif du receveur est retiré et remplacé par un foie de donneur. Cette procédure chirurgicale techniquement exigeante nécessite des compétences microchirurgicales avancées et est encore compliquée par de longs temps d’anhépatie et d’ischémie du bas du corps. Cela a conduit au développement d’une méthode hétérotopique moins compliquée qui peut être réalisée plus rapidement sans temps d’anhépatie ou d’ischémie du bas du corps, réduisant ainsi le stress post-opératoire pour l’animal receveur.

Ce protocole LTx hétérotopique comprend deux étapes principales : l’excision du foie du rat donneur et la transplantation de l’ensemble du foie dans le rat receveur. Lors de l’exérèse du foie du donneur, le chirurgien ligature la veine cave supra-hépatique (CVH) et l’artère hépatique (HA). Du côté du receveur, le chirurgien enlève le rein gauche et positionne le foie du donneur avec la veine porte (PV), la veine cave infra-hépatique (CIVH) et le canal biliaire face aux vaisseaux rénaux. De plus, le chirurgien anastomose la veine rénale du receveur d’une extrémité à l’autre avec l’IHVC du foie et artérialise le PV avec l’artère rénale à l’aide d’un stent. L’hépaticourétérostomie est utilisée pour le drainage biliaire en anastomosant le canal biliaire jusqu’à l’uretère du receveur, ce qui permet l’évacuation de la bile par la vessie.

La durée moyenne de la transplantation était de 130 min, la durée de l’ischémie froide était d’environ 35 minutes et la durée de l’ischémie chaude était inférieure à 25 min. L’histologie de l’hématoxyline et de l’éosine du foie auxiliaire des greffes syngéniques a montré une structure hépatocytaire normale sans altérations parenchymateuses significatives 30 jours après la greffe. En revanche, les échantillons de greffe allogénique de 8 jours après la greffe ont montré une infiltration lymphoïde étendue avec un score de 9 de l’indice d’activité de rejet du schéma de Banff. Par conséquent, cette méthode LTx facilite une alternative au modèle de rejet de faible morbidité au LTx orthotopique.

Introduction

Le LTx chez les petits animaux est un modèle inestimable pour étudier les mécanismes de rejet hépatique. La transplantation hépatique auxiliaire hétérotopique avec artérialisation de la veine porte (HALT-PVA) chez le rat a été introduite en 1968 par Lee et Edgington¹lorsqu’ils ont rapporté avoir utilisé la veine rénale et l’artère d’un receveur pour revasculariser un foie auxiliaire greffé. Par la suite, Hess et ^al.2 ont amélioré le protocole en atténuant la compétition fonctionnelle entre les foies natif et auxiliaire en réduisant la taille du foie natif et du foie donneur ainsi qu’en reconstruisant la connexion des voies biliaires du donneur, ce qui a entraîné la survie à long terme du greffon. D’autres améliorations ont été apportées avec l’introduction de l’anastomose du ballonnet ^3,4, et Schleimer et ^al.5 ont déterminé le diamètre optimal du stent pour réguler le flux sanguin afin d’obtenir un flux porte physiologique et d’éviter l’hyper- ou l’hypo-perfusion du greffon. D’autres chercheurs ont apporté des modifications significatives à la méthode en utilisant l’artère splénique⁶ ou l’artère iliaque^{commune 7} pour l’approvisionnement en sang du greffon, tandis que certains ont développé des modèles qui utilisaient uniquement du sang veineux⁸ ou uniquement du sang artériel via l’artère hépatique⁹ pour alimenter la greffe hépatique auxiliaire.

La présente étude a émis l’hypothèse que la compétition fonctionnelle du foie natif n’interférerait pas avec le rejet de l’allogreffe, nous avons donc développé un protocole basé sur le modèle de Schleimer¹⁰ régulé en flux qui n’incluait aucune réduction de taille du foie natif ou auxiliaire. Le côté gauche du receveur a été sélectionné pour localiser le greffon car il offrait une orientation optimale entre les vaisseaux rénaux et hépatiques du receveur et du donneur. Initialement, nous avons tenté une reconstruction biliaire par hépaticoduodénostomie, mais ces essais ont simplement confirmé l’affirmation de Schleimer selon laquelle « le drainage biliaire est le talon d’Achille de la transplantation hépatique »¹⁰. Cela a conduit au développement d’une nouvelle technique où le canal biliaire est anastomosé de bout en bout à l’aide d’un stent avec l’uretère des receveurs, permettant l’évacuation de la bile par la vessie. Un avantage notable de l’utilisation d’une hépaticourétérostomie est que la fonctionnalité hépatique du greffon peut être surveillée quotidiennement en observant l’urine ; Une greffe de foie productrice de bile colore l’urine d’un jaune vif. La figure 1 représente la vue d’ensemble schématique de la méthode HALT-PVA.

Un avantage important de l’hétérotopie de rat LTx par rapport à l’orthotopique est l’absence de tout anhépatique ou de temps d’ischémie totale du bas du corps, ce qui permet une récupération plus rapide et plus facile pour les receveurs hétérotopiques. De plus, les études immunologiques LTx utilisant des méthodes orthotopiques reposent souvent sur un rejet sévère ou la mort du receveur comme critère expérimental, ce qui n’est pas le cas avec les greffes hétérotopiques, où l’animal reste en bonne santé même si l’allogreffe cesse de fonctionner en raison du rejet. Ces deux caractéristiques de la méthode hétérotopique soutiennent les principes de l’initiative internationale 3R (Replacement, Reduction, and Refinement)¹¹, qui promeut un cadre pour minimiser la douleur, la souffrance et la détresse ressenties par les animaux de recherche et améliorer leur bien-être.

Le modèle HALT-PVA présenté ici est une méthode pratique et fiable pour étudier les mécanismes de rejet de l’allogreffe hépatique dans les études précliniques. Cette technique expérimentale utile permet de surmonter les exigences chirurgicales considérables et le stress animal de la LTx orthotopique chez le rat. À l’avenir, nous avons l’intention d’utiliser cette méthode pour étudier les mécanismes du rejet immunitaire aigu tout en explorant de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques pour supprimer le rejet hépatique de l’allogreffe.

Protocole

Les animaux ont été élevés et logés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes dans les installations de soins aux animaux de l’Institut de recherche médicale de l’Université du Wisconsin (UW)-Madison, conformément aux directives institutionnelles. Le protocole d’étude (n° M006022) a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine et de santé publique de l’UW, et tous les animaux ont été traités de manière éthique.

1. Animaux

1. Utilisez des rats femelles Lewis adultes pesant de 205 à 235 g et des rats Lewis mâles pesant de 250 à 280 g comme rats donneurs. Utilisez des rats Lewis et des rats surmulots bruns mâles adultes pesant de 365 à 420 g comme receveurs.
2. Effectuer des greffes syngéniques en transplantant des donneurs Lewis chez des receveurs Lewis, tandis que les greffes allogéniques ont utilisé des donneurs Lewis transplantés chez des receveurs Brown Norway.
3. Effectuez toutes les interventions chirurgicales par deux personnes à l’aide d’un microscope à deux têtes.

2. Procédure d’obtention d’un donneur de foie auxiliaire

1. Anesthésier le rat donneur avec une inhalation d’isoflurane à 5 % dans une chambre d’induction. Enregistrez le poids du rat et rasez l’abdomen avec une tondeuse électrique.
2. Placez le rat en position couchée sur un coussin de chirurgie chauffé avec son nez dans un cône d’anesthésie et immobilisez les membres avec du ruban adhésif. Désinfectez l’abdomen avec de l’alcool à 75 % et abaissez l’isoflurane à 2 %.
3. Faites une incision longitudinale médiane de la peau et des muscles du pubis au xiphoïde à l’aide de ciseaux. Près du point médian de l’incision longitudinale, étendez-la latéralement vers la gauche et la droite, puis installez des écarteurs des deux côtés de la paroi abdominale et du processus xiphoïde.
4. À l’aide de cotons-tiges humides, rétractez les intestins vers le côté gauche de l’abdomen tout en utilisant des ciseaux à ressort pour couper les ligaments gastro attachés au foie, puis immobilisez les intestins sous de la gaze humidifiée. Couvrez le foie d’un petit morceau de gaze stérile imbibé d’une solution saline chaude.
5. Utilisez des cotons-tiges humides pour rétracter le foie et disséquer les ligaments falciforme, triangulaire, hépatogastrique et hépatoduodénal. Ensuite, cautérisez avec une pince bipolaire et divisez les vaisseaux para-œsophagiens entre le lobe latéral gauche et le lobe caudé antérieur.
6. À l’aide d’une pince à angle ou d’un porte-aiguille, disséquez derrière le SHVC inférieur au diaphragme, puis passez une suture en soie 5-0 sous le SHVC et faites un double nœud sans serrer pour une utilisation ultérieure.
7. Rétractez le lobe latéral droit inférieur vers le haut, coupez le ligament et immobilisez sous de la gaze humidifiée. Isolez l’IHVC du tissu rétropéritonéal jusqu’à la veine rénale droite et ligaturez la veine surrénale droite avec une suture en soie 6-0 aussi près que possible de l’IHVC. Divisez cette veine plus tard lorsque le greffon est retiré.
8. À l’aide d’une aiguille d’hydro-dissection de 27 G (Figure 2A), dissociez le PV du tissu conjonctif environnant et séparez-le des veines pyloriques et spléniques en les ligaturant et en les divisant à l’aide d’une suture en soie 7-0.
9. Isolez, ligaturez avec une suture en soie 6-0 et divisez l’artère hépatique commune près de l’endroit où elle passe sous le PV.
10. Lister le canal biliaire avec une suture en soie 5-0 au niveau de la ramification de l’artère gastroduodénale tout en préservant autant que possible le tissu adipeux autour du canal biliaire ; En particulier, évitez de séparer le canal biliaire de l’artère hépatique appropriée tout en gardant la longueur totale aussi courte que possible.
11. À l’aide de ciseaux à ressort, faites une petite incision dans la paroi du canal biliaire à proximité de la ligature. Insérez un stent en polyimide de 0,0215" de diamètre sur 5 mm de long dans la lumière du canal biliaire et fixez-le avec une suture en soie 6-0, en laissant une extrémité de la suture longue pour une utilisation ultérieure. Divisez le canal biliaire en coupant entre les ligatures 5-0 et 6-0.
12. Marquez la face supérieure de l’IHVC et du PV avec un stylo à colorant chirurgical pour aider à aligner les vaisseaux pendant l’anastomose, puis clampez la veine porte avec une pince à microvaisseaux aussi distale que possible par rapport au foie.
13. Insérez une seringue de 20 mL avec une aiguille de 26 G dans le PV proximal du micro-clamp et perfuser le foie avec 10 à 15 mL de solution saline héparinée glacée ; simultanément, divisez l’IHVC à l’aide de ciseaux à ressort aussi près que possible de la veine rénale droite.
14. Excise le foie à l’aide de ciseaux à ressort en disséquant le PV proximal à la micro-pince, en resserrant la suture 5-0 précédemment placée autour du SHVC et en disséquant le diaphragme pour transecter la veine cave intrathoracique.
15. Continuez en disséquant les ligaments restants à l’arrière du foie et divisez la veine surrénale précédemment ligaturée. Placez le foie excisé dans une solution saline froide sur de la glace.

3. Procédure de greffe de foie auxiliaire

1. Anesthésier le rat receveur avec une inhalation d’isoflurane à 5 % dans une chambre d’induction. Enregistrez le poids du rat et rasez l’abdomen avec une tondeuse électrique.
2. Placez le rat en position couchée sur un coussin de chirurgie chauffé avec son nez dans un cône d’anesthésie et immobilisez les membres avec du ruban adhésif. Appliquez un lubrifiant pour les yeux, désinfectez l’abdomen avec de l’alcool à 75 % et abaissez l’isoflurane à 2 %.
3. À l’aide de ciseaux, faites une incision longitudinale médiane de la peau et des muscles du pubis au xiphoïde, puis installez des écarteurs des deux côtés de la paroi abdominale.
4. À l’aide de cotons-tiges humides, rétractez les intestins vers le côté droit de l’abdomen et couvrez-les de gaze humidifiée. Appliquez une autre gaze humide pour couvrir l’estomac, la rate et le foie, en exposant le rein gauche et les vaisseaux rénaux.
5. À l’aide d’une aiguille d’hydrodissection de 27 g et d’une pince à pointe émoussée, séparez la veine rénale gauche de l’artère rénale, en retirant soigneusement la graisse et le tissu conjonctif des deux vaisseaux.
6. Isolez les veines gonadiques et surrénales et utilisez de la soie 6-0 pour les ligaturer temporairement à proximité de la veine rénale. Cautériser, à l’aide d’une pince bipolaire, toutes les micro branches latérales en isolant la veine rénale et l’artère entre l’aorte/VC et le rein.
7. Mobilisez et ligaturez l’uretère avec une suture en soie 6-0 au pôle inférieur. Marquez la veine et l’artère rénales avec un stylo à colorant chirurgical pour aider à orienter les vaisseaux pendant l’anastomose et vous assurer qu’il n’y a pas de torsions.
8. Clampez l’artère rénale et la veine rénale à l’aide d’une pince à microvaisseaux aussi près que possible de l’aorte et du VC. Transectez l’artère rénale avec des ciseaux à ressort juste après la bifurcation du vaisseau et divisez la veine rénale à peu près à mi-chemin entre le VC et le rein. Mobilisez le rein gauche du tissu conjonctif environnant et retirez-le.
9. Rincer les deux vaisseaux avec une solution saline héparinisée à l’aide d’une aiguille d’hydro-dissection de 27 G pour éliminer tout le sang restant.
10. À l’aide de ciseaux à ressort, découpez une petite ouverture en bouche de poisson dans la fourche de la bifurcation de l’artère rénale pour en faire une ouverture en forme d’entonnoir et insérez une endoprothèse de 8 mm découpée dans un cathéter de 26 G (figure 2B). Fixez le stent avec une suture en soie 6-0, en laissant une extrémité de la suture longue pour une utilisation ultérieure.
11. Introduisez le foie du donneur et placez-le avec le PV, l’IHVC et le canal biliaire face à la veine rénale et à l’artère gauche du receveur. À l’aide d’une suture en nylon 9-0, installez deux sutures de maintien sur les côtés opposés de la connexion veineuse rénale IHVC.
12. Comparez la largeur des vaisseaux et faites une petite incision dans la bouche du poisson à l’aide de ciseaux à ressort dans la face de la veine rénale jusqu’à ce qu’elle ait une largeur similaire à l’IHVC du donneur (figure 2C).
13. À l’aide d’une suture en nylon 9-0, anastomose l’IHVC hépatique d’un bout à l’autre de la veine rénale à l’aide de 9 ou 10 sutures courantes sur les parois avant et arrière du vaisseau. Alternativement, utilisez une méthode de brassard pour compléter cette anastomose ^3,4.
14. Confirmez que l’artère rénale est placée sous l’IHVC (Figure 2D), et insérez l’endoprothèse précédemment placée dans l’artère rénale dans la veine porte du foie et fixez-la avec une suture en soie 6-0, en laissant une extrémité de la suture longue pour s’attacher au fil opposé sur l’artère. Rassemblez les extrémités pour empêcher chacune de glisser de l’endoprothèse.
15. Retirez d’abord la micro-pince sur la veine rénale, puis retirez la micro-pince sur l’artère rénale.
16. Pendant la reperfusion du foie, utilisez de la gaze et des cotons-tiges pour appliquer une légère pression autour de la région de l’anastomose jusqu’à ce qu’une anastomose patente soit obtenue (figure 2D). Retirez les ligatures temporaires précédemment placées sur les veines surrénales et gonadiques.
17. Mobilisez soigneusement environ 10 mm à l’extrémité de l’uretère gauche à partir du tissu conjonctif environnant, en laissant une quantité importante de tissu adipeux attaché. Avec des ciseaux à ressort, faites une petite incision dans la paroi de l’uretère proximal à la ligature 5-0 précédemment placée.
18. Insérez l’endoprothèse en polyimide préalablement fixée au canal biliaire dans la petite incision pratiquée dans la paroi de l’uretère. Fixez avec une suture en soie 6-0 et attachez une extrémité avec le long fil du côté des voies biliaires de l’endoprothèse, en rapprochant fermement les deux extrémités.
19. Remettez les intestins dans leur position naturelle (figure 2E), irriguez avec 2-3 mL de solution saline et fermez l’abdomen en deux couches à l’aide de sutures en soie 3-0.
20. Injectez 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée, placez le receveur dans une cage propre et chauffée et surveillez la récupération pendant 1 à 2 heures avant de ramener l’animal à l’animalerie.

4. Suivi post-chirurgical

1. À partir du 2e jour post-opératoire, injectez quotidiennement de l’héparine (1 UI/g) par voie sous-cutanée aux receveurs d’une greffe allogénique.
2. À partir du 2e jour post-opératoire, injectez de l’héparine (1 UI/2 g) par voie sous-cutanée tous les deux jours aux receveurs d’une greffe syngénique.

Résultats

À l’heure actuelle, 29 paires de rats ont été utilisées pour établir le protocole HALT-PVA, 17 greffes syngéniques et 12 greffes allogéniques. Les foies transplantés syngéniques ont survécu jusqu’à leur point final expérimental désigné de 8 ou 30 jours avec un taux de réussite de 70 %, tandis que les foies transplantés allogéniques ont survécu jusqu’à leurs critères d’évaluation désignés de 3 ou 8 jours avec un taux de réussite de 50 %. Les échecs compr...

Discussion

La transplantation hépatique est la seule option de traitement pour les patients atteints d’une maladie hépatique en phase terminale, avec près de 9 000 LTx effectuées chaque année aux États-Unis¹³. Malheureusement, le rejet immunologique est observé chez jusqu’à 25 % des receveurs de LTx, et ce rejet est préjudiciable à l’organe transplanté et au patient ^14,15. Pour améliorer les résult...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	C013D
5-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-50
6-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-60
7-0 Silk ties	Teleflex	103-s
9-0 Polyamide Suture	AROSurgical	T05A09N10-13	Black
Bipolar Cautery	Codman & Shurtleff Inc.	P.H. 234
Buprenorphine HCL	Hospira	409201232
Forceps, Adson-Brown	Fine Science Tools	11627-12	12.5 cm
Forceps, Angled Dumont	Fine Science Tools	11253-25	Medical #5/45 11 cm
Forceps, Suture Tying	Fine Science Tools	18025-10	10 cm
Heparin Sodium Injection, USB	Fresenius Kabi	504015	10,000 USP units per 10 mL
Hydrodissection Cannula	Ambler Surgical	1021E	27 G
Isoflurane	Dechra Vet. Products	17033-091-25
I.V. Catheter	Kendall	2619PUR	26 G x 3/4"
Magnetic Retraction System	Fine Science Tools	18200-50
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-05	6 mm
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-06	4 mm
Micro Clamp Applicator	Fine Science Tools	18057-14	14 cm
Micro Needle Holder	S&T	C-14	14 cm
Microscope	Zeiss	Universal S3	Dual head
Ophthalmic Ointment	Puralube	14590500
Polyimidi Tubing	Cole Parmer	95820-04	OD 0.0215", ID 0.0195", wall 0.0010"
Saline	Baxter	281324	0.9% Sodium Chloride
Surgical Spring Scissors	S&T	SDC-15	Blunt 14 cm
Surgical Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Vannas 14 cm