同種移植拒絶反応研究のための肝瘻造設術を用いたヘテロトピア補助全肝ラット移植モデル

要約

ここで説明するラットヘテロトピア補助肝移植プロトコルは、肝同種移植片拒絶反応のメカニズムを調査するための実用的な調査ツールを提供します。このモデルは、ラットの同所性肝移植の外科的ハードルと動物的ストレスを軽減するのに役立ちます。

要約

小動物移植モデルは、前臨床試験で実行可能な治療介入を調査する臓器耐性研究に不可欠です。ラット肝移植(LTx)プロトコルは、通常、レシピエントの天然肝臓を切除し、ドナーの肝臓に置き換える同所性モデルを使用します。この技術的に要求の厳しい外科的処置には、高度なマイクロサージェリー技術が必要であり、長い無肝および下半身の虚血時間によってさらに複雑になります。これにより、無肝や下半身の虚血時間なしでより迅速に実行できる、より複雑でないヘテロトピア法の開発が促され、レシピエント動物の術後ストレスが軽減されました。

このヘテロトピアLTxプロトコルには、ドナーラットからの肝臓の切除と、レシピエントラットへの肝臓全体の移植という2つの主要なステップが含まれます。ドナーの肝臓の切除中に、外科医は肝上大静脈 (SHVC) と肝動脈 (HA) を結紮します。レシピエント側では、外科医は左腎臓を切除し、門脈(PV)、肝下大静脈(IHVC)、および胆管を腎血管に面してドナーの肝臓を配置します。さらに、外科医は、レシピエントの腎静脈を肝臓のIHVCで端から端まで吻合し、ステントを使用してPVを腎動脈で動脈化します。肝尿道切開術は、胆管をレシピエントの尿管に吻合することにより、膀胱を介した胆汁の排出を可能にする胆道ドレナージに利用されます。

移植の平均期間は130分、寒冷虚血の持続時間は約35分、温虚血の持続時間は25分未満でした。同系移植による補助肝臓のヘマトキシリンおよびエオシン組織型は、移植後30日で正常な肝細胞構造を示し、有意な実質的変化は認められなかった。対照的に、移植後8日間の同種移植片標本は、広範なリンパ球浸潤を示し、バンフスキーマ拒絶活性指数スコアは9でした。したがって、この LTx 法は、同所性 LTx に代わる低罹患率拒絶モデルを容易にします。

概要

小動物のLTxは、肝臓拒絶反応のメカニズムを調査するための非常に貴重なモデルです。ラットの門脈動脈化を伴う異所性補助肝移植(HALT-PVA)は、1968年にLeeとEdgington1によって導入され、レシピエントの腎静脈と動脈を使用して移植された補助肝臓を再血管化したことを報告しました。その後、Hess et ^al.2 は、天然肝臓と補助肝臓との間の機能的競争を緩和し、天然肝臓と補助肝臓との間の機能的競争を緩和し、ドナーの胆管接続を再構築するとともに、プロトコルを強化し、移植片の長期生存をもたらしました。カフ吻合^3,4の導入によりさらに改良が加えられ、Schleimerら⁵は、生理学的門脈流を取得し、移植片の過灌流または低灌流を回避するために、血流を調節するための最適なステント径を決定しました。他の研究者は、移植血液供給に脾臓⁶動脈または総腸骨⁷動脈を使用することにより、方法に大幅な変更を加えたが、一部の研究者は、補助肝移植片を供給するために静脈血⁸のみまたは肝動脈⁹を介した動脈血のみを使用するモデルを開発した。

本研究では、天然肝臓との機能的競争が同種移植片拒絶反応を妨げないという仮説を立てたため、天然肝臓または補助肝臓のサイズ縮小を含まない、流れ調節されたシュライマーモデル¹⁰ に基づくプロトコルを開発しました。レシピエントの左側は、レシピエントの腎臓血管とドナーの肝臓血管との間の最適な配向を提供するため、移植片の位置を特定するために選択されました。当初、私たちは肝十二指腸吻合術による胆道再建を試みましたが、これらの試験は、「胆道ドレナージは肝移植のアキレス腱である」というシュライマーの主張を単に確認したに過ぎません¹⁰。これにより、レシピエントの尿管を備えたステントを使用して胆管を端から端まで吻合し、膀胱を介した胆汁の排出を可能にする新しい技術の開発が促されました。肝瘻造設術を使用することの注目すべき利点は、移植片の肝臓の機能を尿を観察することで毎日監視できることです。胆汁産生肝臓移植片は、尿を明るい黄色に着色します。 図1 は、HALT-PVA方式の概略図を示しています。

同所性ラットLTxに対するヘテロトピアの重要な利点は、無肝または総下半身虚血時間がないことに関連しており、これによりヘテロトピアレシピエントの回復がより迅速かつ容易になります。さらに、同所性法を利用したLTx免疫学的研究は、実験的エンドポイントとしてレシピエントの重度の拒絶反応または死亡に依存することがよくありますが、異所性移植には当てはまりません。これは、拒絶反応により同種移植片が機能を停止しても動物が健康なままである。ヘテロトピア法のこれらの特徴は、研究動物が経験する痛み、苦しみ、苦痛を最小限に抑え、その福祉を向上させるための枠組みを推進する国際的な3Rイニシアチブ(Replacement, Reduction, and Refinement)¹¹の原理を支えています。

ここで報告されているHALT-PVAモデルは、前臨床試験における肝同種移植片拒絶反応のメカニズムを調査するための実用的で信頼性の高い方法です。この有用な実験技術は、ラットの同所性LTxのかなりの外科的要求と動物ストレスを克服するのに役立ちます。将来的には、この手法を用いて急性免疫拒絶反応のメカニズムを解明するとともに、肝臓の同種移植片拒絶反応を抑制する新たな標的や治療戦略を探求していきたいと考えています。

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プロトコル

動物は、ウィスコンシン大学(UW)-マディソン医学研究所の動物管理施設で、機関のガイドラインに従って、特定の病原体のない条件で飼育および飼育されました。研究プロトコル(第M006022号)は、UW医学部および公衆衛生学部の施設動物管理および使用委員会によって承認され、すべての動物が倫理的に扱われました。

1. 動物たち

1. ドナーラットには、体重205-235gの成体ルイス雌ラットと体重250-280gのルイス雄を使用します。レシピエントとして、体重365〜420gの成体のオスのルイスラットとブラウンノルウェーラットを使用します。
2. ルイスドナーをルイスレシピエントに移植することにより同系移植を行い、同種移植はブラウンノルウェーレシピエントに移植されたルイスドナーを利用しました。
3. すべての手術は、デュアルヘッド顕微鏡を使用して2人で行います。

2.補助肝臓ドナー調達手続き

1. 誘導チャンバーで5%イソフルラン吸入でドナーラットに麻酔をかけます。ラットの体重を記録し、電動バリカンで腹部を剃ります。
2. ラットを加熱された手術パッドの仰臥位に置き、鼻を麻酔コーンに入れ、手足をテープで固定します。腹部を75%アルコールで消毒し、イソフルランを2%に下げます。
3. はさみを使用して、恥骨から剣状突起までの縦方向の正中線の皮膚と筋肉の切開を行います。縦方向の切開の中間点近くで、それを左右に横方向に伸ばし、次に腹壁と剣状突起の両側に開創器を取り付けます。
4. 湿った綿棒を使用して、腸を腹部の左側に引っ込めながら、スプリングハサミを使用して肝臓に付着した胃靭帯を切断し、湿らせたガーゼの下で腸を固定します。温かい生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼの小片で肝臓を覆います。
5. 湿った綿棒を使用して肝臓を引っ込め、鎌状靭帯、三角形靭帯、肝胃靭帯、および肝十二指腸靭帯を解剖します。次に、双極鉗子で焼灼し、傍食道血管を左外側尾状葉と前尾状葉の間で分割します。
6. アングル鉗子またはニードルホルダーを使用して、横隔膜より下のSHVCの後ろを解剖し、次にSHVCの下に5-0シルク縫合糸を通し、後で使用するために二重結び目を緩く結びます。
7. 下右外側葉を上方に引っ込め、靭帯を切断し、湿らせたガーゼの下で固定します。IHVCを後腹膜組織から右腎静脈まで分離し、IHVCにできるだけ近い6-0シルク縫合糸で右副腎静脈を結紮します。後でグラフトを取り外すときに、この静脈を分割します。
8. 27 Gのハイドロ解剖針(図2A)を使用して、PVを周囲の結合組織から解離し、7-0シルク縫合糸を使用してそれらを結紮および分割することにより、幽門静脈と脾静脈からPVを分離します。
9. 分離し、6-0シルク縫合糸で結紮し、総肝動脈をPVの下を通過する場所の近くで分割します。
10. 胆管の周りの脂肪組織を可能な限り保存しながら、胃十二指腸動脈の分岐部で5-0シルク縫合糸で胆管を結紮します。特に、胆管を適切な肝動脈から分離することは避け、全体の長さは実用的にできるだけ短く保ちます。
11. スプリングハサミを使用して、結紮の近位にある胆管の壁に小さな切開を行います。直径0.0215インチ×長さ5mmのポリイミドチューブステントを胆管内腔に挿入し、6-0シルク縫合糸で固定し、縫合糸の一端を後で使用するために長く残します。5-0と6-0の結紮を切断して胆管を分割します。
12. IHVCとPVの上面を外科用染料ペンでマークして、吻合中に血管の位置を合わせてから、肝臓のできるだけ遠位に門脈をクランプします。
13. 26 G針付きの20 mLシリンジをマイクロクランプの近位のPVに挿入し、10〜15 mLの氷冷ヘパリン食塩水で肝臓を灌流します。同時に、スプリングハサミを使用してIHVCを右腎静脈にできるだけ近づけて分割します。
14. スプリングハサミを使用して、マイクロクランプの近位にあるPVを解剖し、以前にSHVCの周りに配置された5-0縫合糸を締め、横隔膜を解剖して胸腔内大静脈を横断することにより、肝臓を切除します。
15. 肝臓の後ろに残っている靭帯を解剖し続け、以前に結紮した副腎静脈を分割します。切除した肝臓を氷の上の冷たい生理食塩水に入れます。

3. 補助的な肝臓レシピエント移植の手技

1. 誘導チャンバーで5%イソフルラン吸入でレシピエントラットに麻酔をかけます。ラットの体重を記録し、電動バリカンで腹部を剃ります。
2. ラットを加熱された手術パッドの仰臥位に置き、鼻を麻酔コーンに入れ、手足をテープで固定します。アイローションを塗布し、腹部を75%アルコールで消毒し、イソフルランを2%に下げます。
3. はさみを使用して、縦方向の正中線の皮膚と恥骨から剣状突起までの筋肉を切開し、次に腹壁の両側に開創器を取り付けます。
4. 湿った綿棒を使用して、腸を腹部の右側に引っ込め、湿らせたガーゼで覆います。別の湿ったガーゼを胃、脾臓、肝臓に当て、左の腎臓と腎臓の血管を露出させます。
5. 27 Gのハイドロダイセクション針と鈍い先端鉗子を使用して、左腎静脈を腎動脈から分離し、両方の血管から脂肪と結合組織を慎重に除去します。.
6. 性腺静脈と副腎静脈を分離し、6-0シルクを使用してそれらを一時的に腎静脈の近位に結紮します。バイポーラ鉗子を使用して、大動脈/VCと腎臓の間の腎静脈と動脈を隔離するすべての微小側枝を焼灼します。
7. 尿管を動員し、下極で6-0シルク縫合糸で結紮します。腎静脈と動脈に外科用染料ペンで印を付け、吻合中に血管の向きを調整し、ねじれがないことを確認します。
8. 腎動脈と腎静脈を、大動脈とVCにできるだけ近い微小血管クランプでクランプします。血管の分岐部を過ぎたところでスプリングハサミで腎動脈を横断し、VCと腎臓の約半分で腎静脈を分割します。周囲の結合組織から左腎臓を動員し、それを取り除きます。
9. 27 Gのハイドロ解剖針を使用して、両方の血管をヘパリン化生理食塩水で洗い流し、残りの血液をすべて除去します。.
10. スプリングハサミを使用して、腎動脈分岐部のフォークに小さな魚の口の開口部を切って漏斗状の開口部を作り、26 Gカテーテルから切り取った8 mmのステントを挿入します(図2B)。ステントを6-0シルク縫合糸で固定し、縫合糸の一端を後で使用するために長く残します。
11. ドナーの肝臓を導入し、PV、IHVC、胆管をレシピエントの左腎静脈と動脈に向けます。9-0ナイロン縫合糸を使用して、IHVCと腎静脈接続の反対側に2つのステー縫合糸を取り付けます。
12. 血管の幅を比較し、スプリングハサミを使用して腎静脈の顔に小さな魚の口を切開し、ドナーのIHVCと同じ幅になるまでします(図2C)。
13. 9-0ナイロン縫合糸を使用して、血管の前壁と後壁の両方に9または10のランニング縫合糸を使用して、肝臓IHVCを腎静脈まで端から端まで吻合します。あるいは、カフ法を使用して、この吻合^3,4を完了します。
14. 腎動脈の配置がIHVCの下にあることを確認し(図2D)、以前に腎動脈に留置したステントを肝臓の門脈に挿入し、6-0シルク縫合糸で固定し、縫合糸の一方の端を動脈の反対側の糸に取り付けます。両端を一緒に引き寄せて、それぞれがステントから滑り落ちないようにします。
15. 最初に腎静脈のマイクロクランプを取り外し、次に腎動脈のマイクロクランプを取り外します。
16. 肝臓の再灌流中は、ガーゼと綿棒を使用して、パテント吻合が達成されるまで吻合領域の周囲に軽い圧力を加えます(図2D)。以前に副腎静脈と性腺静脈に配置されていた一時的な結紮を取り除きます。
17. 周囲の結合組織から左尿管の端を約10mm慎重に動かし、かなりの量の脂肪組織が付着したままになります。スプリングハサミを使用して、以前に配置した5-0結紮の近位にある尿管の壁に小さな切開を行います。
18. 胆管に以前に取り付けたポリイミドステントを、尿管壁に作られた小さな切開部に挿入します。6-0シルク縫合糸で固定し、一方の端をステントの胆管側の長い糸で結び、両端をしっかりと引き込みます。
19. 腸を自然な位置に戻し(図2E)、生理食塩水2〜3mLで洗浄し、3〜0シルクランニング縫合糸を使用して腹部を2層に閉じます。
20. 0.1 mg / kgのブプレノルフィンを皮下注射し、レシピエントを清潔で加熱されたケージに入れ、動物を動物飼育施設に戻す前に1〜2時間回復を監視します。.

4. 術後の経過観察

1. 術後 2 日目から、同種異系移植レシピエントにヘパリン (1 IU/g) を毎日皮下注射します。
2. 術後2日目から、同系移植レシピエントにヘパリン(1IU / 2 g)を隔日で皮下注射します。

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結果

現在、29組のラットを使用してHALT-PVAプロトコルを確立し、17組の同系移植、および12組の同種移植を行っています。同系移植された肝臓は、指定された8日または30日間の実験エンドポイントまで70%の成功率で生存し、同種移植された肝臓は、指定された3日または8日間のエンドポイントまで50%の成功率で生存しました。失敗には、外科的合併症により死亡したラット?...

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ディスカッション

肝移植は、末期肝疾患の患者にとって唯一の治療選択肢であり、米国では年間約9,000回のLTxが行われています¹³。残念ながら、免疫学的拒絶反応はLTxレシピエントの最大25%に見られ、この拒絶反応は移植された臓器と患者に有害です^14,15。LTx後の転帰を改善するためには、臓器拒絶反応を研究する革新的な?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	C013D
5-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-50
6-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-60
7-0 Silk ties	Teleflex	103-s
9-0 Polyamide Suture	AROSurgical	T05A09N10-13	Black
Bipolar Cautery	Codman & Shurtleff Inc.	P.H. 234
Buprenorphine HCL	Hospira	409201232
Forceps, Adson-Brown	Fine Science Tools	11627-12	12.5 cm
Forceps, Angled Dumont	Fine Science Tools	11253-25	Medical #5/45 11 cm
Forceps, Suture Tying	Fine Science Tools	18025-10	10 cm
Heparin Sodium Injection, USB	Fresenius Kabi	504015	10,000 USP units per 10 mL
Hydrodissection Cannula	Ambler Surgical	1021E	27 G
Isoflurane	Dechra Vet. Products	17033-091-25
I.V. Catheter	Kendall	2619PUR	26 G x 3/4"
Magnetic Retraction System	Fine Science Tools	18200-50
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-05	6 mm
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-06	4 mm
Micro Clamp Applicator	Fine Science Tools	18057-14	14 cm
Micro Needle Holder	S&T	C-14	14 cm
Microscope	Zeiss	Universal S3	Dual head
Ophthalmic Ointment	Puralube	14590500
Polyimidi Tubing	Cole Parmer	95820-04	OD 0.0215", ID 0.0195", wall 0.0010"
Saline	Baxter	281324	0.9% Sodium Chloride
Surgical Spring Scissors	S&T	SDC-15	Blunt 14 cm
Surgical Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Vannas 14 cm