Modello di trapianto di fegato intero di ratto ausiliario eterotopico che utilizza un'epaticoureterostomia per studi di rigetto dell'allotrapianto

Riepilogo

Il protocollo di trapianto di fegato ausiliario eterotopico di ratto qui descritto offre uno strumento sperimentale pratico per esplorare i meccanismi di rigetto dell'allotrapianto epatico. Questo modello aiuta ad alleviare gli ostacoli chirurgici e lo stress animale del trapianto di fegato ortotopico nei ratti.

Abstract

I modelli di trapianto di piccoli animali sono indispensabili per gli studi di tolleranza d'organo che studiano interventi terapeutici fattibili negli studi preclinici. I protocolli di trapianto di fegato di ratto (LTx) utilizzano in genere un modello ortotopico in cui il fegato nativo dei riceventi viene rimosso e sostituito con un fegato di donatore. Questa procedura chirurgica tecnicamente impegnativa richiede competenze microchirurgiche avanzate ed è ulteriormente complicata dai lunghi tempi di ischemia anepatica e della parte inferiore del corpo. Ciò ha portato allo sviluppo di un metodo eterotopico meno complicato che può essere eseguito più velocemente senza tempo di ischemia anepatica o della parte inferiore del corpo, riducendo lo stress post-operatorio per l'animale ricevente.

Questo protocollo LTx eterotopico comprende due passaggi principali: l'asportazione del fegato dal ratto donatore e il trapianto dell'intero fegato nel ratto ricevente. Durante l'escissione del fegato del donatore, il chirurgo lega la vena cava sopraepatica (SHVC) e l'arteria epatica (HA). Sul lato ricevente, il chirurgo rimuove il rene sinistro e posiziona il fegato del donatore con la vena porta (PV), la vena cava infraepatica (IHVC) e il dotto biliare rivolti verso i vasi renali. Inoltre, il chirurgo anastomosi la vena renale del ricevente da un capo all'altro con l'IHVC del fegato e arterializza il PV con l'arteria renale utilizzando uno stent. L'epaticoureterostomia viene utilizzata per il drenaggio biliare anastomizzando il dotto biliare all'uretere del ricevente, consentendo lo scarico della bile attraverso la vescica.

La durata media del trapianto è stata di 130 minuti, la durata dell'ischemia fredda è stata di circa 35 minuti e la durata dell'ischemia calda è stata inferiore a 25 minuti. L'ematossilina e l'eosina istologica del fegato ausiliario da trapianti singenici hanno mostrato una struttura epatocitaria normale senza alterazioni parenchimali significative 30 giorni dopo il trapianto. Al contrario, i campioni di trapianto allogenico post-trapianto di 8 giorni hanno dimostrato un'estesa infiltrazione linfocitaria con un punteggio dell'indice di attività di rigetto dello schema di Banff di 9. Pertanto, questo metodo LTx facilita un modello di rigetto a bassa morbilità alternativo all'LTx ortotopico.

Introduzione

L'LTx per piccoli animali è un modello inestimabile per studiare i meccanismi di rigetto epatico. Il trapianto di fegato ausiliario eterotopico con arterializzazione della vena porta (HALT-PVA) nei ratti è stato introdotto nel 1968 da Lee e Edgington¹quando hanno riferito di aver utilizzato la vena renale e l'arteria di un ricevente per rivascolarizzare un fegato ausiliario innestato. Successivamente, Hess et ^al.2 hanno migliorato il protocollo con la mitigazione della competizione funzionale tra il fegato nativo e quello ausiliario, riducendo le dimensioni del fegato nativo e del donatore e ricostruendo la connessione del dotto biliare del donatore, con conseguente sopravvivenza a lungo termine del trapianto. Ulteriori perfezionamenti sono stati apportati con l'introduzione dell'anastomosi della cuffia ^3,4 e Schleimer et ^al.5 hanno determinato il diametro ottimale dello stent per regolare il flusso sanguigno per ottenere il flusso portale fisiologico ed evitare l'iper- o ipo-perfusione dell'innesto. Altri ricercatori hanno sviluppato modifiche significative al metodo utilizzando l'arteria splenica⁶ o l'arteria iliaca⁷ comune per l'alimentazione del sangue dell'innesto, mentre alcuni hanno sviluppato modelli che utilizzavano solo sangue venoso⁸ o solo sangue arterioso attraverso l'arteria epatica⁹ per fornire l'innesto epatico ausiliario.

Il presente studio ha ipotizzato che la competizione funzionale del fegato nativo non interferisca con il rigetto dell'allotrapianto, quindi abbiamo sviluppato un protocollo basato sul modello di Schleimer¹⁰ regolato dal flusso che non includeva alcuna riduzione delle dimensioni del fegato nativo o ausiliario. Il lato sinistro del ricevente è stato selezionato per localizzare l'innesto perché forniva un orientamento ottimale tra i vasi renali e epatici del ricevente e del donatore. Inizialmente, abbiamo tentato la ricostruzione biliare tramite epaticoduodenostomia, ma questi studi hanno semplicemente confermato l'affermazione di Schleimer che "il drenaggio biliare è il tallone d'Achille del trapianto di fegato"¹⁰. Ciò ha portato allo sviluppo di una nuova tecnica in cui il dotto biliare viene anastomizzato end-to-end utilizzando uno stent con l'uretere dei riceventi, consentendo lo scarico della bile attraverso la vescica. Un vantaggio degno di nota dell'utilizzo di un'epaticoureterostomia è che la funzionalità epatica del trapianto può essere monitorata quotidianamente osservando le urine; Un trapianto di fegato che produce bile colora l'urina di un giallo brillante. La Figura 1 rappresenta la panoramica schematica del metodo HALT-PVA.

Un importante vantaggio dell'LTx eterotopico rispetto a quello ortotopico del ratto è legato all'assenza di qualsiasi tempo di ischemia anepatica o totale della parte inferiore del corpo, che consente recuperi più rapidi e facili per i riceventi eterotopici. Inoltre, gli studi immunologici LTx che utilizzano metodi ortotopici spesso si basano sul grave rigetto o sulla morte del ricevente come endpoint sperimentale, cosa che non è il caso dei trapianti eterotopici, in cui l'animale rimane sano anche se l'allotrapianto smette di funzionare a causa del rigetto. Entrambe queste caratteristiche del metodo eterotopico supportano i principi dell'iniziativa internazionale delle 3R (Replacement, Reduction, and Refinement)¹¹, che promuove un quadro per ridurre al minimo il dolore, la sofferenza e l'angoscia vissuti dagli animali da ricerca e migliorare il loro benessere.

Il modello HALT-PVA qui riportato è un metodo pratico e affidabile per studiare i meccanismi di rigetto dell'allotrapianto epatico negli studi preclinici. Questa utile tecnica sperimentale aiuta a superare le notevoli esigenze chirurgiche e lo stress animale della LTx ortotopica nei ratti. In futuro, intendiamo utilizzare questo metodo per studiare i meccanismi del rigetto immunitario acuto, esplorando nuovi bersagli e strategie terapeutiche per sopprimere il rigetto dell'allotrapianto epatico.

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Protocollo

Gli animali sono stati allevati e alloggiati in specifiche condizioni prive di agenti patogeni nelle strutture di cura degli animali dell'Università del Wisconsin (UW)-Madison Institute for Medical Research in conformità con le linee guida istituzionali. Il protocollo di studio (n. M006022) è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la UW School of Medicine and Public Health e tutti gli animali sono stati trattati in modo etico.

1. Animali

1. Utilizzare ratti femmine di Lewis adulti del peso di 205-235 g e maschi di Lewis del peso di 250-280 g come ratti donatori. Utilizzare come riceventi ratti maschi adulti di Lewis e Brown Norway del peso di 365-420 g.
2. Eseguire trapianti singenici trapiantando donatori di Lewis in riceventi di Lewis, mentre i trapianti allogenici utilizzavano donatori di Lewis trapiantati in riceventi di Norvegia marrone.
3. Eseguire tutti gli interventi chirurgici da parte di due persone utilizzando un microscopio a doppia testa.

2. Procedura ausiliaria di reperimento del donatore di fegato

1. Anestetizzare il ratto donatore con inalazione di isoflurano al 5% in una camera di induzione. Registra il peso del ratto e rade l'addome con un tagliacapelli elettrico.
2. Posizionare il ratto in posizione supina su un cuscinetto chirurgico riscaldato con il naso in un cono per anestesia e immobilizzare gli arti con del nastro adesivo. Disinfettare l'addome con alcol al 75% e abbassare l'isoflurano al 2%.
3. Praticare un'incisione longitudinale della pelle e dei muscoli della linea mediana dal pube allo xifoide usando le forbici. Vicino al punto medio dell'incisione longitudinale, estenderla lateralmente a sinistra e a destra, quindi installare i divaricatori su entrambi i lati della parete addominale e del processo xifoideo.
4. Usando tamponi di cotone umidi, ritrarre l'intestino sul lato sinistro dell'addome mentre si usano le forbici a molla per tagliare i legamenti gastrointestinali attaccati al fegato, quindi immobilizzare l'intestino sotto una garza inumidita. Copri il fegato con un pezzetto di garza sterile inumidita con soluzione salina calda.
5. Utilizzare tamponi di cotone umidi per ritrarre il fegato e sezionare i legamenti falciformi, triangolari, epatogastrici ed epatoduodenali. Successivamente, cauterizzare con una pinza bipolare e dividere i vasi para-esofagei tra il lobo caudato laterale sinistro e quello anteriore.
6. Utilizzando una pinza angolare o un portaaghi, sezionare dietro l'SHVC inferiore al diaframma, quindi passare una sutura di seta 5-0 sotto l'SHVC e fare un doppio nodo per un uso successivo.
7. Ritrarre il lobo laterale destro inferiore verso l'alto, tagliare il legamento e immobilizzare sotto una garza inumidita. Isolare l'IHVC dal tessuto retroperitoneale fino alla vena renale destra e legare la vena surrenalica destra con una sutura di seta 6-0 il più vicino possibile all'IHVC. Dividi questa vena in un secondo momento, quando l'innesto viene rimosso.
8. Utilizzando un ago per idrodissezione da 27 G (Figura 2A), dissociare il PV dal tessuto connettivo circostante e separarlo dalle vene piloriche e spleniche legandole e dividendole utilizzando una sutura di seta 7-0.
9. Isolare, legare con sutura di seta 6-0 e dividere l'arteria epatica comune vicino al punto in cui passa sotto il PV.
10. Legare il dotto biliare con una sutura di seta 5-0 alla ramificazione dell'arteria gastroduodenale, preservando il più possibile il tessuto adiposo intorno al dotto biliare; In particolare, evitare di separare il dotto biliare dall'arteria epatica corretta, mantenendo la lunghezza complessiva il più corta possibile.
11. Usando le forbici a molla, praticare una piccola incisione nella parete del dotto biliare prossimale alla legatura. Inserire uno stent per tubo in poliimmide di 0,0215" di diametro per 5 mm di lunghezza nel lume del dotto biliare e fissarlo con una sutura di seta 6-0, lasciando un'estremità della sutura lunga per un uso successivo. Dividi il dotto biliare tagliando tra le legature 5-0 e 6-0.
12. Segnare il lato superiore dell'IHVC e del PV con una penna chirurgica per aiutare ad allineare i vasi durante l'anastomosi, quindi bloccare la vena porta con un morsetto per microvasi il più distale possibile al fegato.
13. Inserire una siringa da 20 ml con un ago da 26 G nel PV prossimale al micro morsetto e perfondere il fegato con 10-15 ml di soluzione salina eparinizzata ghiacciata; contemporaneamente, dividere l'IHVC usando le forbici a molla il più vicino possibile alla vena renale destra.
14. Asportare il fegato usando le forbici a molla sezionando il PV prossimale al micro morsetto, stringendo la sutura 5-0 precedentemente posizionata attorno all'SHVC e sezionando il diaframma per sezionare la vena cava intratoracica.
15. Continuare sezionando i legamenti rimanenti nella parte posteriore del fegato e dividere la vena surrenalica precedentemente legata. Mettere il fegato asportato in soluzione salina fredda su ghiaccio.

3. Procedura ausiliaria di trapianto di fegato ricevente

1. Anestetizzare il ratto ricevente con inalazione di isoflurano al 5% in una camera di induzione. Registra il peso del ratto e rade l'addome con un tagliacapelli elettrico.
2. Posizionare il ratto in posizione supina su un cuscinetto chirurgico riscaldato con il naso in un cono per anestesia e immobilizzare gli arti con del nastro adesivo. Applicare un lubrificante per gli occhi, disinfettare l'addome con alcol al 75% e abbassare l'isoflurano al 2%.
3. Usando le forbici, praticare un'incisione longitudinale della pelle e dei muscoli della linea mediana dal pube allo xifoide, quindi installare i divaricatori su entrambi i lati della parete addominale.
4. Usando tamponi di cotone umidi, ritrarre l'intestino sul lato destro dell'addome e coprirlo con una garza inumidita. Applicare un'altra garza umida per coprire lo stomaco, la milza e il fegato, esponendo il rene sinistro e i vasi renali.
5. Utilizzando un ago per idrodissezione da 27 G e una pinza a punta smussata, separare la vena renale sinistra dall'arteria renale, rimuovendo accuratamente il grasso e il tessuto connettivo da entrambi i vasi.
6. Isolare le vene gonadiche e surrenali e utilizzare la seta 6-0 per legarle temporaneamente prossimalmente alla vena renale. Cauterizzare, utilizzando una pinza bipolare, tutti i micro rami laterali isolando la vena renale e l'arteria tra l'aorta/VC e il rene.
7. Mobilizzare e legare l'uretere con una sutura di seta 6-0 al polo inferiore. Contrassegna la vena renale e l'arteria con una penna chirurgica per aiutare a orientare i vasi durante l'anastomosi e assicurarti che non ci siano torsioni.
8. Bloccare l'arteria renale e la vena renale con un morsetto per microvasi il più vicino possibile all'aorta e al VC. Sezionare l'arteria renale con le forbici a molla appena oltre la biforcazione del vaso e dividere la vena renale circa a metà strada tra il VC e il rene. Mobilizzare il rene sinistro dal tessuto connettivo circostante e rimuoverlo.
9. Lavare entrambi i vasi con soluzione fisiologica eparinizzata utilizzando un ago per idrodissezione da 27 G per rimuovere tutto il sangue rimanente.
10. Con le forbici a molla, tagliare una piccola apertura della bocca di pesce nella forchetta della biforcazione dell'arteria renale per creare un'apertura a forma di imbuto e inserire uno stent da 8 mm tagliato da un catetere da 26 G (Figura 2B). Fissare lo stent con una sutura di seta 6-0, lasciando un'estremità della sutura lunga per un uso successivo.
11. Introdurre il fegato del donatore e posizionarlo con il PV, l'IHVC e il dotto biliare rivolti verso la vena renale sinistra e l'arteria del ricevente. Utilizzando una sutura in nylon 9-0, installare due suture di permanenza sui lati opposti della connessione IHVC-vena renale.
12. Confrontare la larghezza dei vasi e praticare una piccola incisione della bocca di pesce utilizzando le forbici a molla nella faccia della vena renale fino a quando non ha una larghezza simile all'IHVC del donatore (Figura 2C).
13. Utilizzando una sutura in nylon 9-0, anastomizzare l'IHVC epatico end-to-end alla vena renale con 9 o 10 suture in esecuzione su entrambe le pareti anteriore e posteriore del vaso. In alternativa, utilizzare un metodo del bracciale per completare questa anastomosi ^3,4.
14. Verificare che il posizionamento dell'arteria renale sia al di sotto dell'IHVC (Figura 2D) e inserire lo stent precedentemente posizionato nell'arteria renale nella vena porta del fegato e fissarlo con una sutura di seta 6-0, lasciando un'estremità della sutura lunga per attaccarsi al filo opposto sull'arteria. Avvicinare le estremità per evitare che ciascuna scivoli via dallo stent.
15. Rimuovere prima il micro morsetto sulla vena renale, quindi rimuovere il micro morsetto sull'arteria renale.
16. Durante la riperfusione del fegato, utilizzare una garza e tamponi di cotone per applicare una leggera pressione intorno alla regione dell'anastomosi fino a raggiungere un'anastomosi pervietà (Figura 2D). Rimuovere le legature temporanee precedentemente posizionate sulle vene surrenali e gonadiche.
17. Mobilizzare con cautela circa 10 mm lungo l'estremità dell'uretere sinistro dal tessuto connettivo circostante, lasciando attaccata una quantità significativa di tessuto adiposo. Con le forbici a molla, praticare una piccola incisione nella parete dell'uretere prossimale alla legatura 5-0 precedentemente posizionata.
18. Inserire lo stent in poliimmide precedentemente attaccato al dotto biliare nella piccola incisione praticata nella parete dell'uretere. Fissare con una sutura di seta 6-0 e legare un'estremità insieme al filo lungo sul lato del dotto biliare dello stent, unendo saldamente entrambe le estremità.
19. Riportare l'intestino nella loro posizione naturale (Figura 2E), irrigare con 2-3 ml di soluzione fisiologica e chiudere l'addome in due strati utilizzando suture di seta 3-0.
20. Iniettare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea, posizionare il ricevente in una gabbia pulita e riscaldata e monitorare il recupero per 1-2 ore prima di riportare l'animale alla struttura di stabulazione per animali.

4. Follow-up post-chirurgico

1. A partire dal 2° giorno dopo l'intervento, iniettare quotidianamente eparina (1 UI/g) per via sottocutanea ai riceventi di trapianto allogenico.
2. A partire dal 2° giorno dopo l'intervento, iniettare ai riceventi di trapianto singenico eparina (1 UI/2 g) per via sottocutanea a giorni alterni.

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Risultati

Attualmente, 29 coppie di ratti sono state utilizzate per stabilire il protocollo HALT-PVA, 17 trapianti singenici e 12 trapianti allogenici. I fegati trapiantati singenici sono sopravvissuti all'endpoint sperimentale designato di 8 o 30 giorni con un tasso di successo del 70%, mentre i fegati trapiantati allogenici sono sopravvissuti agli endpoint designati di 3 o 8 giorni con un tasso di successo del 50%. I fallimenti includono ratti morti a causa di complicazioni chirurgiche e fegati ...

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Discussione

Il trapianto di fegato è l'unica opzione di trattamento per i pazienti con malattia epatica allo stadio terminale, con quasi 9.000 LTx eseguiti ogni anno negli Stati Uniti¹³. Sfortunatamente, il rigetto immunologico si osserva fino al 25% dei riceventi di LTx e questo rigetto è dannoso per l'organo trapiantato e per il paziente^14,15. Per migliorare gli esiti dopo LTx, è necessario lo sviluppo di modelli...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	C013D
5-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-50
6-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-60
7-0 Silk ties	Teleflex	103-s
9-0 Polyamide Suture	AROSurgical	T05A09N10-13	Black
Bipolar Cautery	Codman & Shurtleff Inc.	P.H. 234
Buprenorphine HCL	Hospira	409201232
Forceps, Adson-Brown	Fine Science Tools	11627-12	12.5 cm
Forceps, Angled Dumont	Fine Science Tools	11253-25	Medical #5/45 11 cm
Forceps, Suture Tying	Fine Science Tools	18025-10	10 cm
Heparin Sodium Injection, USB	Fresenius Kabi	504015	10,000 USP units per 10 mL
Hydrodissection Cannula	Ambler Surgical	1021E	27 G
Isoflurane	Dechra Vet. Products	17033-091-25
I.V. Catheter	Kendall	2619PUR	26 G x 3/4"
Magnetic Retraction System	Fine Science Tools	18200-50
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-05	6 mm
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-06	4 mm
Micro Clamp Applicator	Fine Science Tools	18057-14	14 cm
Micro Needle Holder	S&T	C-14	14 cm
Microscope	Zeiss	Universal S3	Dual head
Ophthalmic Ointment	Puralube	14590500
Polyimidi Tubing	Cole Parmer	95820-04	OD 0.0215", ID 0.0195", wall 0.0010"
Saline	Baxter	281324	0.9% Sodium Chloride
Surgical Spring Scissors	S&T	SDC-15	Blunt 14 cm
Surgical Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Vannas 14 cm