동종이식 거부 반응 연구를 위한 간절개술을 활용하는 이주제 보조 전체 간 쥐 이식 모델

요약

여기에 설명된 쥐 이소성 보조 간 이식 프로토콜은 간 동종이식 거부 반응의 메커니즘을 탐색하기 위한 실용적인 조사 도구를 제공합니다. 이 모델은 쥐의 정형소 간 이식의 수술 장애물과 동물의 스트레스를 완화하는 데 도움이 됩니다.

초록

소동물 이식 모델은 전임상 연구에서 실현 가능한 치료 개입을 조사하는 장기 내성 연구에 필수적입니다. 쥐 간 이식(LTx) 프로토콜은 일반적으로 수혜자의 원래 간을 제거하고 기증자 간으로 대체하는 정형외과 모델을 사용합니다. 기술적으로 까다로운 이 수술 절차는 고급 미세 수술 기술을 필요로 하며 장시간의 무간 및 하체 허혈로 인해 더욱 복잡합니다. 이로 인해 무간 또는 하체 허혈 시간 없이 더 빠르게 수행할 수 있는 덜 복잡한 이종 요법의 개발이 촉진되어 이식 동물의 수술 후 스트레스를 줄일 수 있습니다.

이 이종성 LTx 프로토콜에는 두 가지 주요 단계가 포함됩니다: 기증자 쥐에서 간을 절제하고 간 전체를 수혜자 쥐에 이식하는 것입니다. 기증자의 간을 절제하는 동안 외과의는 상간대정맥(SHVC)과 간동맥(HA)을 결찰합니다. 수혜자 측에서 외과의는 왼쪽 신장을 제거하고 기증자의 간을 문맥(PV), 하부간대정맥(IHVC) 및 담관이 신장 혈관을 향하도록 배치합니다. 또한, 외과의는 간의 IHVC로 수혜자의 신정맥을 끝에서 끝까지 문합하고 스텐트를 사용하여 PV를 신장 동맥과 동맥화합니다. 간절개술은 담관을 수혜자의 요관으로 문합하여 담즙이 방광을 통해 담즙이 배출될 수 있도록 하여 담즙 배출에 사용됩니다.

평균 이식 시간은 130분, 냉허혈 기간은 약 35분, 온열 허혈 기간은 25분 미만이었습니다. 신유전자 이식으로 인한 보조 간의 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신 조직학(eosin histology)은 이식 후 30일 동안 유의한 실질 변화 없이 정상적인 간세포 구조를 보여주었다. 대조적으로, 이식 후 8일 후 동종 이식편 표본은 Banff Schema 거부 반응 활성 지수 점수가 9로 광범위한 림프구 침투를 보여주었습니다. 따라서 이 LTx 방법은 정소성 LTx에 대한 낮은 이환율 거부 모델을 용이하게 합니다.

서문

소동물 LTx는 간 거부 반응을 일으키는 기전을 조사하는 데 매우 유용한 모델입니다. 쥐에서 문맥 동맥 삽입술을 동반한 이소성 보조 간 이식(HALT-PVA)은 1968년 Lee와 Edgington1에 의해 소개되었는데, 당시 수혜자의 신장 정맥과 동맥을 사용하여 이식된 보조 간을 재혈관화한다고 보고했습니다. 그 후, Hess 등^[2]은 기증자 담관 연결을 재구성하는 것과 함께 본래 간과 기증자 간 크기를 줄임으로써 본래 간과 보조 간 간의 기능적 경쟁을 완화하여 프로토콜을 강화하여 이식편의 장기 생존을 초래했습니다. 커프 문합 ^3,4의 도입으로 추가적인 개선이 이루어졌으며, Schleimer 등5은 생리학적 문맥 흐름을 얻고 이식편의 과관류 또는 저관류를 피하기 위해 혈류를 조절하기 위한 최적의 스텐트 직경^{을 결정했습니다.} 다른 연구자들은 이식 혈액 공급을 위해 비장⁶ 또는 총장골⁷ 동맥을 사용하여 방법을 크게 변경했으며, 일부는 정맥혈⁸ 또는 간 동맥⁹을 통한 동맥혈만 사용하여 보조 간 이식편에 공급하는 모델을 개발했습니다.

본 연구는 천연 간과의 기능적 경쟁이 동종이식 거부 반응을 방해하지 않을 것이라는 가설을 세웠기 때문에 천연 간 또는 보조 간의 크기 축소를 포함하지 않는 흐름 조절 슐라이머 모델¹⁰ 을 기반으로 프로토콜을 개발했습니다. 이식편의 위치를 찾기 위해 수혜자의 왼쪽을 선택했는데, 이는 수혜자의 신장 혈관과 기증자 간 혈관 사이에 최적의 방향을 제공했기 때문입니다. 초기에는 간십이지장절개술을 통해 담즙 재건을 시도했지만, 이 임상시험은 "담도 배액은 간 이식의 아킬레스건"이라는 Schleimer의 주장을 확인시켜주었을 뿐입니다¹⁰. 이로 인해 수혜자의 요관과 함께 스텐트를 사용하여 담관을 끝에서 끝까지 문합하여 방광을 통해 담즙을 배출할 수 있는 새로운 기술이 개발되었습니다. 간절개술의 주목할 만한 이점은 소변을 관찰하여 이식편 간 기능을 매일 모니터링할 수 있다는 것입니다. 담즙을 생성하는 간 이식편은 소변을 밝은 노란색으로 착색합니다. 그림 1 은 HALT-PVA 방법의 개략도를 나타냅니다.

정형소성 쥐 LTx에 비해 이종소성의 중요한 장점은 간질환 또는 하체 전허혈 시간이 없다는 점과 관련이 있으며, 이는 이종외 이식자가 더 빠르고 쉽게 회복할 수 있도록 합니다. 또한 정형소적 방법을 활용한 LTx 면역학적 연구는 종종 수혜자의 심각한 거부 또는 사망에 실험적 종점으로 의존하는데, 이는 거부 반응으로 인해 동종이식편이 기능을 중단하더라도 동물이 건강을 유지하는 이소성 이식의 경우에는 그렇지 않습니다. 헤테로토피 방법의 이러한 두 가지 특징은 연구 동물이 경험하는 고통, 고통 및 괴로움을 최소화하고 그들의 복지를 개선하기 위한 틀을 촉진하는 국제 3R의 이니셔티브(Replacement, Reduction, and Refinement)¹¹의 원칙을 지원합니다.

여기에 보고된 HALT-PVA 모델은 전임상 연구에서 간 동종이식 거부 반응을 조사하기 위한 실용적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 유용한 실험 기술은 쥐에서 정소성 LTx의 상당한 수술 요구와 동물 스트레스를 극복하는 데 도움이 됩니다. 앞으로 우리는 이 방법을 사용하여 급성 면역 거부 반응의 메커니즘을 조사하는 동시에 간 동종 이식 거부 반응을 억제하기 위한 새로운 표적과 치료 전략을 모색할 계획입니다.

프로토콜

동물들은 기관 지침에 따라 위스콘신 대학교(University of Wisconsin, UW)-매디슨 의학 연구소(Madison Institute for Medical Research)의 동물 보호 시설에서 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되고 수용되었습니다. 연구 프로토콜(No. M006022)은 UW 의과 대학 및 공중 보건 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 모든 동물은 윤리적으로 대우되었습니다.

1. 동물

1. 205-235g 무게의 성인 루이스 암컷 쥐와 250-280g 무게의 루이스 수컷 쥐를 기증자 쥐로 사용하십시오. 체중이 365-420g인 성인 수컷 Lewis 및 Brown Norway 쥐를 수신자로 사용합니다.
2. 루이스 기증자를 루이스 수혜자에게 이식하여 합성유전자 이식을 수행하고, 동종 이식은 브라운 노르웨이 수혜자에게 이식된 루이스 기증자를 활용했습니다.
3. 모든 수술은 이중 헤드 현미경을 사용하여 두 사람이 수행합니다.

2. 간 보조 기증자 조달 절차

1. 유도 챔버에서 5% 이소플루란 흡입으로 기증자 쥐를 마취합니다. 쥐의 체중을 기록하고 전기 가위기로 복부를 면도하십시오.
2. 마취 원뿔에 코를 대고 가열된 수술 패드 위에 쥐를 누운 자세로 놓고 테이프로 팔다리를 고정합니다. 75% 알코올로 복부를 소독하고 이소플루란을 2%로 낮춥니다.
3. 가위를 사용하여 치골에서 xiphoid까지 세로로 정중선 피부와 근육을 절개합니다. 세로 절개의 중간 지점 근처에서 왼쪽과 오른쪽으로 측면으로 확장한 다음 복벽과 xiphoid process의 양쪽에 견인기를 설치합니다.
4. 촉촉한 면봉을 사용하여 장을 복부 왼쪽으로 후퇴시키고 스프링 가위를 사용하여 간에 붙어있는 위인대를 자른 다음 축축한 거즈로 장을 고정합니다. 따뜻한 식염수를 적신 작은 멸균 거즈로 간을 덮습니다.
5. 축축한 면봉을 사용하여 간을 수축시키고 팔시폼, 삼각, 간위, 간십이지장 인대를 절개합니다. 다음으로, 양극성 겸자로 소작하고 왼쪽 외측과 전방 미상엽 사이의 식도 주위 혈관을 나눕니다.
6. 앵글 핀셋 또는 바늘 홀더를 사용하여 다이어프램보다 아래쪽 SHVC 뒤를 절개 한 다음 SHVC 아래에 5-0 실크 봉합사를 통과시키고 나중에 사용할 수 있도록 이중 매듭을 느슨하게 묶습니다.
7. 하측 우측 측엽을 위쪽으로 후퇴시키고 인대를 절단하고 축축한 거즈 아래에서 움직이지 못하게 합니다. IHVC를 후복막 조직에서 우측 신정맥까지 분리하고 IHVC에 최대한 가까운 6-0 실크 봉합사로 우측 부신 정맥을 결찰합니다. 나중에 이식편을 제거할 때 이 정맥을 나누십시오.
8. 27G 수압 해부 바늘(그림 2A)을 사용하여 PV를 주변 결합 조직에서 분리하고 7-0 실크 봉합사를 사용하여 결찰 및 분할하여 유문 및 비장 정맥에서 분리합니다.
9. 6-0 실크 봉합사로 분리하고 결찰하고 PV 아래를 통과하는 곳에 가깝게 총간동맥을 분할합니다.
10. 위십이지장 동맥의 분기부에서 5-0 실크 봉합사로 담관을 결찰하면서 담관 주변의 지방 조직을 가능한 한 보존합니다. 특히, 담관을 적절한 간 동맥에서 분리하지 말고 전체 길이를 가능한 한 짧게 유지하십시오.
11. 스프링 가위를 사용하여 결찰부 근위부의 담관 벽을 작게 절개합니다. 담관 내강에 직경 0.0215인치 x 5mm 길이의 폴리이미드 튜브 스텐트를 삽입하고 6-0 실크 봉합사로 고정하여 나중에 사용할 수 있도록 봉합사의 한쪽 끝을 길게 둡니다. 5-0과 6-0 결찰 사이를 절단하여 담관을 나눕니다.
12. 문합 중 혈관을 정렬하는 데 도움이 되도록 수술용 염료 펜으로 IHVC 및 PV의 윗면을 표시한 다음 가능한 한 간 원위부에 있는 미세 혈관 클램프로 문맥을 고정합니다.
13. 26G 바늘이 달린 20mL 주사기를 마이크로 클램프 근처의 PV에 삽입하고 10-15mL의 얼음처럼 차가운 헤파린 식염수로 간을 관류합니다. 동시에 스프링 가위를 사용하여 IHVC를 가능한 한 오른쪽 신장 정맥에 가깝게 나눕니다.
14. 마이크로 클램프에 근접한 PV를 해부하고, SHVC 주위에 이전에 배치된 5-0 봉합사를 조이고, 횡격막을 절개하여 흉곽내 대정맥을 절제하여 스프링 가위를 사용하여 간을 절제합니다.
15. 간 뒤쪽에 남아 있는 인대를 절개하고 이전에 결찰된 부신 정맥을 나누면서 계속합니다. 절제된 간을 얼음 위에 차가운 식염수에 넣습니다.

3. 보조 간 수혜자 이식 절차

1. 유도 챔버에서 5% 이소플루란 흡입으로 수용 쥐를 마취합니다. 쥐의 체중을 기록하고 전기 가위기로 복부를 면도하십시오.
2. 마취 원뿔에 코를 대고 가열된 수술 패드 위에 쥐를 누운 자세로 놓고 테이프로 팔다리를 고정합니다. 눈 윤활제를 바르고 75% 알코올로 복부를 소독한 다음 이소플루란을 2%로 낮춥니다.
3. 가위를 사용하여 치골에서 치골까지 세로 정중선 피부와 근육을 절개 한 다음 복벽 양쪽에 견인기를 설치하십시오.
4. 촉촉한 면봉을 사용하여 장을 복부 오른쪽으로 후퇴시키고 적신 거즈로 덮습니다. 또 다른 촉촉한 거즈를 바르고 위, 비장, 간을 덮어 왼쪽 신장과 신장 혈관을 노출시킵니다.
5. 27G의 수압 박리 바늘과 뭉툭한 집게를 사용하여 왼쪽 신장 정맥과 신장 동맥을 분리하고 양쪽 혈관에서 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.
6. 생식선과 부신 정맥을 분리하고 6-0 실크를 사용하여 일시적으로 신장 정맥 근위부를 접합합니다. 양극성 겸자를 사용하여 대동맥/VC와 신장 사이의 신장 정맥과 동맥을 분리하는 모든 마이크로 곁가지를 소작합니다.
7. 하극에서 6-0 실크 봉합사로 요관을 동원하고 결찰합니다. 신장 정맥과 동맥을 수술용 염료 펜으로 표시하여 문합 중에 혈관의 방향을 잡고 꼬인 부분이 없는지 확인합니다.
8. 신장 동맥과 신장 정맥을 미세혈관 클램프로 대동맥과 VC에 최대한 가깝게 고정합니다. 혈관 분기점을 지나 스프링 가위로 신장 동맥을 절제하고 VC와 신장 사이의 약 절반 지점에서 신장 정맥을 나눕니다. 주변 결합 조직에서 왼쪽 신장을 동원하여 제거합니다.
9. 27G 수압 해부 바늘을 사용하여 두 혈관을 헤파린 식염수로 세척하여 남아 있는 혈액을 모두 제거합니다.
10. 스프링 가위로 신장 동맥 분기점의 포크에 있는 작은 물고기 입 구멍을 잘라 깔때기 모양의 구멍을 만들고 26G 카테터에서 절단한 8mm 스텐트를 삽입합니다(그림 2B). 6-0 실크 봉합사로 스텐트를 고정하고 나중에 사용할 수 있도록 봉합사의 한쪽 끝을 길게 둡니다.
11. 기증자의 간을 소개하고 PV, IHVC 및 담관이 수혜자의 왼쪽 신장 정맥 및 동맥을 향하도록 배치합니다. 9-0 나일론 봉합사를 사용하여 IHVC-신장 정맥 연결부의 반대쪽에 두 개의 스테이 봉합사를 설치합니다.
12. 혈관의 너비를 비교하고 기증자의 IHVC와 비슷한 너비가 될 때까지 스프링 가위를 사용하여 신장 정맥 면에 작은 물고기 입을 절개합니다(그림 2C).
13. 9-0 나일론 봉합사를 사용하여 혈관의 앞벽과 뒷벽을 가로질러 9개 또는 10개의 실행 봉합사로 간 IHVC를 신장 정맥에 끝에서 끝까지 문합합니다. 또는 커프 방법을 사용하여 이 문합을 완료합니다 ^3,4.
14. 신장 동맥이 IHVC 아래에 있는지 확인하고(그림 2D), 이전에 신장 동맥에 삽입한 스텐트를 간 문맥에 삽입하고 봉합사의 한쪽 끝을 동맥의 반대쪽 실에 부착할 수 있도록 길게 남겨둔 후 6-0 실크 봉합사로 고정합니다. 스텐트에서 미끄러지지 않도록 끝을 함께 그립니다.
15. 먼저 신장 정맥의 마이크로 클램프를 제거한 다음 신장 동맥의 마이크로 클램프를 제거합니다.
16. 간을 재관류하는 동안 거즈와 면봉을 사용하여 특허 문합이 이루어질 때까지 문합 부위 주위에 가벼운 압력을 가합니다(그림 2D). 이전에 부신과 생식선 정맥에 배치된 임시 결찰을 제거합니다.
17. 주변 결합 조직에서 왼쪽 요관 끝으로 약 10mm 아래로 조심스럽게 동원하여 상당한 양의 지방 조직이 부착되도록 합니다. 스프링 가위를 사용하여 이전에 배치 한 5-0 결찰에 가까운 요관 벽을 작게 절개합니다.
18. 이전에 담관에 부착된 폴리이미드 스텐트를 요관 벽에 만들어진 작은 절개 부위에 삽입합니다. 6-0 실크 봉합사로 고정하고 한쪽 끝을 스텐트의 담관 쪽에 있는 긴 실로 묶어 양쪽 끝을 단단히 잡아당깁니다.
19. 장을 원래 위치로 되돌리고(그림 2E), 2-3mL의 식염수를 세척하고, 3-0 실크 러닝 봉합사를 사용하여 복부를 두 겹으로 닫습니다.
20. 0.1mg/kg 부프레노르핀을 피하주사하고, 수혜자를 깨끗하고 가열된 케이지에 넣고, 동물을 동물 사육 시설로 돌려보내기 전에 1-2시간 동안 회복을 모니터링합니다.

4. 수술 후 후속 조치

1. 수술 후 2일차부터 동종 이식 수혜자에게 헤파린(1IU/g)을 매일 피하 주사합니다.
2. 수술 후 2일차부터 합성유전자 이식 수혜자에게 격일로 헤파린(1IU/2g)을 피하주사합니다.

결과

현재 29쌍의 쥐가 HALT-PVA 프로토콜을 확립하는 데 사용되었으며, 17건의 신유전자 이식 및 12건의 동종 이식이 사용되었습니다. syngeneic 이식된 간은 70%의 성공률로 지정된 8일 또는 30일 실험 종료점까지 생존한 반면, 동종 이식된 간은 50%의 성공률로 지정된 3일 또는 8일 종료점까지 생존했습니다. 실패에는 수술 합병증으로 인해 죽은 쥐와 수혜자가 살아남았음에도 불구하?...

토론

간 이식은 말기 간 질환 환자를 위한 유일한 치료 옵션이며, 미국에서는 매년 약 9,000건의 LTx가 시행되고 있습니다¹³. 불행히도 LTx 수혜자의 최대 25%에서 면역학적 거부 반응이 나타나며, 이러한 거부 반응은 이식된 장기와 환자에게 해롭습니다^14,15. LTx 이후의 결과를 개선하기 위해서는 장기 거부 반응을 연구?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	C013D
5-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-50
6-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-60
7-0 Silk ties	Teleflex	103-s
9-0 Polyamide Suture	AROSurgical	T05A09N10-13	Black
Bipolar Cautery	Codman & Shurtleff Inc.	P.H. 234
Buprenorphine HCL	Hospira	409201232
Forceps, Adson-Brown	Fine Science Tools	11627-12	12.5 cm
Forceps, Angled Dumont	Fine Science Tools	11253-25	Medical #5/45 11 cm
Forceps, Suture Tying	Fine Science Tools	18025-10	10 cm
Heparin Sodium Injection, USB	Fresenius Kabi	504015	10,000 USP units per 10 mL
Hydrodissection Cannula	Ambler Surgical	1021E	27 G
Isoflurane	Dechra Vet. Products	17033-091-25
I.V. Catheter	Kendall	2619PUR	26 G x 3/4"
Magnetic Retraction System	Fine Science Tools	18200-50
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-05	6 mm
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-06	4 mm
Micro Clamp Applicator	Fine Science Tools	18057-14	14 cm
Micro Needle Holder	S&T	C-14	14 cm
Microscope	Zeiss	Universal S3	Dual head
Ophthalmic Ointment	Puralube	14590500
Polyimidi Tubing	Cole Parmer	95820-04	OD 0.0215", ID 0.0195", wall 0.0010"
Saline	Baxter	281324	0.9% Sodium Chloride
Surgical Spring Scissors	S&T	SDC-15	Blunt 14 cm
Surgical Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Vannas 14 cm