Allogreft Rejeksiyon Çalışmaları için Hepaticoureerostomi Kullanan Heterotopik Yardımcı Tüm Karaciğer Sıçan Nakli Modeli

Özet

Burada tarif edilen sıçan heterotopik yardımcı karaciğer nakli protokolü, hepatik allogreft rejeksiyon mekanizmalarını araştırmak için pratik bir araştırma aracı sunmaktadır. Bu model, sıçanlarda ortotopik karaciğer naklinin cerrahi engellerini ve hayvan stresini hafifletmeye yardımcı olur.

Özet

Küçük hayvan nakli modelleri, klinik öncesi çalışmalarda uygulanabilir terapötik müdahaleleri araştıran organ toleransı çalışmaları için vazgeçilmezdir. Sıçan karaciğer nakli (LTx) protokolleri tipik olarak, alıcıların doğal karaciğerinin çıkarıldığı ve bir donör karaciğeri ile değiştirildiği bir ortotopik model kullanır. Teknik olarak zorlu olan bu cerrahi işlem, ileri mikrocerrahi beceriler gerektirir ve uzun anhepatik ve alt vücut iskemi süreleri ile daha da komplike hale gelir. Bu, anhepatik veya alt vücut iskemi süresi olmadan daha hızlı gerçekleştirilebilen daha az karmaşık bir heterotopik yöntemin geliştirilmesine yol açtı ve alıcı hayvan için ameliyat sonrası stresi azalttı.

Bu heterotopik LTx protokolü iki ana adım içerir: karaciğerin donör sıçandan çıkarılması ve tüm karaciğerin alıcı sıçana nakledilmesi. Donör karaciğerin eksizyonu sırasında, cerrah supra-hepatik vena kava (SHVC) ve hepatik arteri (HA) bağlar. Alıcı tarafta, cerrah sol böbreği çıkarır ve donör karaciğeri portal ven (PV), infra-hepatik vena kava (IHVC) ve safra kanalı böbrek damarlarına bakacak şekilde konumlandırır. Ayrıca, cerrah alıcının renal venini karaciğerin IHVC'si ile uçtan uca anastomoz eder ve bir stent kullanarak PV'yi renal arter ile arteriyalize eder. Safra kanalını alıcının üreterine anastomoz ederek safra drenajı için bir hepaticoureterostomi kullanılır ve safranın mesane yoluyla boşaltılmasına izin verir.

Transplantasyon süresi ortalama 130 dk, soğuk iskemi süresi 35 dk ve sıcak iskemi süresi 25 dk'dan azdı. Sinjeneik nakillerden elde edilen yardımcı karaciğerin hematoksilen ve eozin histolojisi, nakilden 30 gün sonra önemli parankimal değişiklik olmaksızın normal hepatosit yapısı gösterdi. Buna karşılık, nakil sonrası 8 günlük allojenik greft örnekleri, Banff Şeması rejeksiyon aktivite indeksi skoru 9 olan geniş lenfositik infiltrasyon gösterdi. Bu nedenle, bu LTx yöntemi, ortotopik LTx'e alternatif düşük bir morbidite reddetme modelini kolaylaştırır.

Giriş

Küçük hayvan LTx, karaciğer reddi mekanizmalarını araştırmak için paha biçilmez bir modeldir. Sıçanlarda portal ven arteriyalizasyonu ile heterotopik yardımcı karaciğer nakli (HALT-PVA), 1968'de Lee ve Edgington¹tarafından, aşılanmış bir yardımcı karaciğeri yeniden vaskülarize etmek için bir alıcının renal venini ve arterini kullandıklarını bildirdiklerinde tanıtıldı. Daha sonra, Hess ve ^ark.2, donör safra kanalı bağlantısını yeniden yapılandırmanın yanı sıra doğal ve donör karaciğer boyutunu azaltarak doğal ve yardımcı karaciğerler arasındaki fonksiyonel rekabetin azaltılması ile protokolü geliştirdi ve bu da uzun süreli greft sağkalımı ile sonuçlandı. Manşet anastomozu ^3,4'ün eklenmesiyle daha fazla iyileştirme yapıldı ve Schleimer ve ^ark.5, fizyolojik portal akışı elde etmek ve greftin hiper veya hipo-perfüzyonunu önlemek için kan akışını düzenlemek için en uygun stent çapını belirledi. Diğer araştırmacılar, greft kan temini için splenik⁶ veya ortak iliak⁷ arteri kullanarak yöntemde önemli değişiklikler geliştirirken, bazıları yardımcı karaciğer greftini sağlamak için sadece venöz kan⁸ veya hepatik arter⁹ yoluyla sadece arteriyel kan kullanan modeller geliştirdi.

Bu çalışma, doğal karaciğerden gelen fonksiyonel rekabetin allogreft reddine müdahale etmeyeceğini varsaymıştır, bu nedenle, doğal veya yardımcı karaciğerde herhangi bir boyut azalması içermeyen akış regülasyonlu Schleimer model^10'a dayalı bir protokol geliştirdik. Grefti bulmak için alıcının sol tarafı seçildi çünkü alıcının böbrek ve donör karaciğer damarları arasında optimal oryantasyon sağladı. Başlangıçta, hepatikoduodenostomi yoluyla biliyer rekonstrüksiyon girişiminde bulunduk, ancak bu denemeler Schleimer'in "safra drenajının karaciğer transplantasyonunun Aşil topuğu olduğu" iddiasını ^{doğruladı10}. Bu, safra kanalının, alıcıların üreteriyle bir stent kullanılarak uçtan uca anastomoz edildiği ve safranın mesane yoluyla boşaltılmasına izin veren yeni bir tekniğin geliştirilmesine yol açtı. Hepatikureterostomi kullanmanın kayda değer bir yararı, greft karaciğer işlevselliğinin idrarı gözlemleyerek günlük olarak izlenebilmesidir; Safra üreten bir karaciğer grefti, idrarı parlak sarı renkte renklendirir. Şekil 1 , HALT-PVA yönteminin şematik genel bakışını temsil etmektedir.

Heterotopik sıçan LTx'e göre önemli bir avantajı, heterotopik alıcılar için daha hızlı ve daha kolay iyileşmeye izin veren herhangi bir anhepatik veya total alt vücut iskemi zamanının olmaması ile ilgilidir. Ek olarak, ortotopik yöntemleri kullanan LTx immünolojik çalışmaları, genellikle deneysel bir son nokta olarak alıcının ciddi şekilde reddedilmesine veya ölümüne dayanır, bu da allogreftin reddedilme nedeniyle çalışmayı durdursa bile hayvanın sağlıklı kaldığı heterotopik nakillerde geçerli değildir. Heterotopik yöntemin bu özelliklerinin her ikisi de, araştırma hayvanlarının yaşadığı acı, ıstırap ve sıkıntıyı en aza indirmek ve refahlarını iyileştirmek için bir çerçeveyi teşvik eden uluslararası 3R'nin girişiminin (Değiştirme, Azaltma ve İyileştirme)¹¹ ilkelerini desteklemektedir.

Burada bildirilen HALT-PVA modeli, klinik öncesi çalışmalarda hepatik allogreft reddi mekanizmalarını araştırmak için pratik ve güvenilir bir yöntemdir. Bu yararlı deneysel teknik, sıçanlarda ortotopik LTx'in önemli cerrahi taleplerinin ve hayvan stresinin üstesinden gelmeye yardımcı olur. Gelecekte, hepatik allogreft reddini baskılamak için yeni hedefler ve terapötik stratejiler araştırırken akut immün rejeksiyon mekanizmalarını araştırmak için bu yöntemi kullanmayı planlıyoruz.

Protokol

Hayvanlar, Wisconsin Üniversitesi (UW)-Madison Tıbbi Araştırma Enstitüsü'ndeki hayvan bakım tesislerinde kurumsal yönergelere uygun olarak belirli patojen içermeyen koşullarda yetiştirildi ve barındırıldı. Çalışma protokolü (No. M006022), UW Tıp ve Halk Sağlığı Okulu'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve tüm hayvanlara etik olarak muamele edildi.

1. Hayvanlar

1. Donör sıçan olarak 205-235 g ağırlığındaki yetişkin Lewis dişi sıçanları ve 250-280 g ağırlığındaki Lewis erkeklerini kullanın. Alıcı olarak 365-420 g ağırlığındaki yetişkin erkek Lewis ve Brown Norway sıçanlarını kullanın.
2. Lewis donörlerini Lewis alıcılarına naklederek sinjeneik nakiller gerçekleştirirken, allojenik nakillerde Brown Norway alıcılarına nakledilen Lewis donörleri kullanıldı.
3. Tüm ameliyatları çift kafalı mikroskop kullanarak iki kişi tarafından gerçekleştirin.

2. Yardımcı karaciğer donörü tedarik prosedürü

1. Donör sıçanı bir indüksiyon odasında% 5 izofluran inhalasyonu ile uyuşturun. Sıçanın ağırlığını kaydedin ve karnı elektrikli bir kesme makinesiyle tıraş edin.
2. Fareyi, burnu bir anestezi konisi içinde olacak şekilde ısıtılmış bir ameliyat pedi üzerinde sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve uzuvları bantla hareketsiz hale getirin. Karnı% 75 alkolle dezenfekte edin ve% 2'ye düşürün.
3. Makas kullanarak pubisten ksifoide kadar uzunlamasına bir orta hat derisi ve kas kesisi yapın. Boyuna insizyonun orta noktasına yakın, yanal olarak sola ve sağa uzatın, ardından karın duvarının her iki tarafına ve ksifoid işlemine ekartörler takın.
4. Nemli pamuklu çubuklar kullanarak, karaciğere bağlı gastro bağları kesmek için yaylı makas kullanırken bağırsakları karnın sol tarafına geri çekin, ardından bağırsakları nemli gazlı bez altında hareketsiz hale getirin. Karaciğeri ılık tuzlu su ile nemlendirilmiş küçük bir steril gazlı bez ile örtün.
5. Karaciğeri geri çekmek ve falsiform, üçgen, hepatogastrik ve hepatoduodenal bağları incelemek için nemli pamuklu çubuklar kullanın. Daha sonra, bipolar forseps ile koterize edin ve para-özofagus damarlarını sol lateral ve anterior kaudat lob arasında bölün.
6. Açılı forseps veya iğne tutucular kullanarak, diyaframın altındaki SHVC'nin arkasına diseksiyon yapın, ardından SHVC'nin altına 5-0 ipek sütür geçirin ve daha sonra kullanmak üzere gevşek bir şekilde çift düğüm atın.
7. İnferior sağ lateral lobu yukarı doğru çekin, bağı kesin ve nemli gazlı bez altında hareketsiz hale getirin. IHVC'yi retroperitoneal dokudan sağ renal ven'e kadar izole edin ve sağ adrenal veni IHVC'ye mümkün olduğunca yakın 6-0 ipek sütür ile bağlayın. Bu damarı daha sonra greft çıkarıldığında bölün.
8. 27 G'lik bir hidrodiseksiyon iğnesi kullanarak (Şekil 2A), PV'yi çevredeki bağ dokusundan ayırın ve 7-0 ipek sütür kullanarak bağlayarak ve bölerek pilor ve dalak damarlarından ayırın.
9. İzole edin, 6-0 ipek sütür ile bağlayın ve ortak hepatik arteri PV'nin altından geçtiği yere yakın bir yere bölün.
10. Safra kanalının etrafındaki yağ dokusunu mümkün olduğunca koruyarak gastroduodenal arterin dallanmasında safra kanalını 5-0 ipek sütür ile bağlayın; Özellikle, toplam uzunluğu mümkün olduğu kadar kısa tutarken safra kanalını uygun hepatik arterden ayırmaktan kaçının.
11. Yaylı makas kullanarak, ligasyonun proksimalindeki safra kanalının duvarında küçük bir kesi yapın. Safra kanalı lümenine 0,0215 "çapında ve 5 mm uzunluğunda bir poliimid boru stenti yerleştirin ve 6-0 ipek sütürle sabitleyin, sütürün bir ucunu daha sonra kullanmak üzere uzun bırakın. Safra kanalını 5-0 ve 6-0 ligasyonları arasında keserek bölün.
12. Anastomoz sırasında damarları hizalamaya yardımcı olmak için IHVC ve PV'nin üst tarafını cerrahi bir boya kalemi ile işaretleyin, ardından portal veni mümkün olduğunca karaciğerin distalinde bir mikro damar klempi ile klempleyin.
13. Mikro kelepçenin proksimalindeki PV'ye 26 G iğneli 20 mL'lik bir şırınga yerleştirin ve karaciğeri 10-15 mL buz gibi soğuk heparinize salin ile perfüze edin; aynı anda, IHVC'yi yaylı makas kullanarak sağ böbrek damarına mümkün olduğunca yakın bölün.
14. PV'yi mikro klemp proksimaline diseke ederek, daha önce SHVC etrafına yerleştirilmiş 5-0 sütürü sıkarak ve intratorasik vena kava'yı kesmek için diyaframı diseksiyon yaparak yaylı makas kullanarak karaciğeri eksize edin.
15. Karaciğerin arkasında kalan bağları diseke ederek devam edin ve daha önce bağlanmış adrenal veni bölün. Eksize edilen karaciğeri buz üzerinde soğuk tuzlu suya yerleştirin.

3. Yardımcı karaciğer alıcı nakli prosedürü

1. Alıcı sıçanı bir indüksiyon odasında% 5 izofluran inhalasyonu ile uyuşturun. Sıçanın ağırlığını kaydedin ve karnı elektrikli bir kesme makinesiyle tıraş edin.
2. Fareyi, burnu bir anestezi konisi içinde olacak şekilde ısıtılmış bir ameliyat pedi üzerinde sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve uzuvları bantla hareketsiz hale getirin. Bir göz kayganlaştırıcı uygulayın, karnı% 75 alkolle dezenfekte edin ve izofluranı% 2'ye düşürün.
3. Makas kullanarak, pubisten ksifoide uzunlamasına bir orta hat derisi ve kas kesisi yapın, ardından karın duvarının her iki tarafına ekartörler takın.
4. Nemli pamuklu çubuklar kullanarak, bağırsakları karnın sağ tarafına geri çekin ve nemli gazlı bezle örtün. Mideyi, dalağı ve karaciğeri kaplamak için başka bir nemli gazlı bez uygulayın ve sol böbrek ve böbrek damarlarını açığa çıkarın.
5. 27 G'lik bir hidrodiseksiyon iğnesi ve künt uçlu forseps kullanarak, sol böbrek damarını böbrek arterinden ayırın, her iki damardan yağ ve bağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
6. Gonadal ve adrenal damarları izole edin ve geçici olarak böbrek damarına proksimalde bağlamak için 6-0 ipek kullanın. Bipolar forseps kullanarak, aort / VC ve böbrek arasındaki renal ven ve arteri izole eden tüm mikro yan dalları koterize edin.
7. Üreteri alt kutupta 6-0 ipek sütür ile harekete geçirin ve bağlayın. Anastomoz sırasında damarları yönlendirmeye yardımcı olmak için renal ven ve arteri cerrahi bir boya kalemi ile işaretleyin ve bükülme olmadığından emin olun.
8. Renal arteri ve renal veni, aort ve VC'ye mümkün olduğunca yakın bir mikrodamar klempi ile klempleyin. Renal arteri, damar çatallanmasını hemen geçecek şekilde yaylı makasla kesin ve renal veni VC ile böbrek arasında yaklaşık yarıya kadar bölün. Sol böbreği çevredeki bağ dokusundan mobilize edin ve çıkarın.
9. Kalan tüm kanı çıkarmak için 27 G'lik bir hidrodiseksiyon iğnesi kullanarak her iki damarı heparinize tuzlu su ile yıkayın.
10. Yaylı makasla, renal arter çatalının çatalında küçük bir balık ağzı açıklığı açarak huni şeklinde bir açıklık açın ve 26 G'lik bir kateterden kesilmiş 8 mm'lik bir stent yerleştirin (Şekil 2B). Stenti 6-0 ipek sütür ile sabitleyin ve dikişin bir ucunu daha sonra kullanmak üzere uzun bırakın.
11. Donör karaciğeri tanıtın ve PV, IHVC ve safra kanalı alıcının sol renal venine ve arterine bakacak şekilde konumlandırın. 9-0 naylon sütür kullanarak, IHVC-renal ven bağlantısının zıt taraflarına iki tane askı sütürü takın.
12. Damarların genişliğini karşılaştırın ve vericinin IHVC'sine benzer bir genişliğe sahip olana kadar böbrek damarının yüzüne yaylı makas kullanarak küçük bir balık ağzı kesisi yapın (Şekil 2C).
13. 9-0 naylon sütür kullanarak, damarın hem ön hem de arka duvarları boyunca 9 veya 10 çalışan sütür ile karaciğer IHVC'sini böbrek damarına uçtan uca anastomoz edin. Alternatif olarak, bu anastomozu tamamlamak için bir manşet yöntemi kullanın ^3,4.
14. Renal arterin yerleşiminin IHVC'nin altında olduğunu onaylayın (Şekil 2D) ve daha önce renal artere yerleştirilen stenti karaciğer portal venine yerleştirin ve 6-0 ipek sütür ile sabitleyin, sütürün bir ucunu arter üzerindeki karşı ipliğe tutunacak şekilde uzun bırakın. Her birinin stentten kaymasını önlemek için uçları bir araya getirin.
15. Önce böbrek damarı üzerindeki mikro kelepçeyi çıkarın, ardından böbrek atardamarı üzerindeki mikro kelepçeyi çıkarın.
16. Karaciğerin reperfüzyonu sırasında, patent anastomozu elde edilene kadar anastomoz bölgesi çevresinde hafif basınç uygulamak için gazlı bez ve pamuklu çubuklar kullanın (Şekil 2D). Daha önce adrenal ve gonadal venlere yerleştirilen geçici ligasyonları çıkarın.
17. Sol üreterin ucundan yaklaşık 10 mm aşağıya, çevredeki bağ dokusundan dikkatlice hareket ettirin ve önemli miktarda yağ dokusu bağlı bırakın. Yaylı makasla, daha önce yerleştirilen 5-0 ligasyonunun proksimalindeki üreter duvarında küçük bir kesi yapın.
18. Daha önce safra kanalına takılan poliimid stent, üreter duvarında yapılan küçük kesiye yerleştirin. 6-0 ipek sütürle sabitleyin ve bir ucunu stentin safra kanalı tarafındaki uzun iplikle birbirine bağlayın ve her iki ucu sıkıca birbirine çekin.
19. Bağırsakları doğal pozisyonlarına geri getirin (Şekil 2E), 2-3 mL tuzlu su ile yıkayın ve 3-0 ipek koşu dikişleri kullanarak karnı iki kat halinde kapatın.
20. Deri altına 0.1 mg / kg buprenorfin enjekte edin, alıcıyı temiz, ısıtılmış bir kafese koyun ve hayvanı hayvan barınağına geri göndermeden önce 1-2 saat boyunca iyileşmeyi izleyin.

4. Ameliyat sonrası takip

1. Ameliyattan sonraki 2. günden başlayarak, allojenik nakil alıcılarına her gün deri altına heparin (1 IU / g) enjekte edin.
2. Ameliyattan sonraki 2. günden başlayarak, sinjeneik nakil alıcılarına her gün deri altına heparin (1 IU / 2 g) enjekte edin.

Sonuçlar

Halen, HALT-PVA protokolünü oluşturmak için 29 çift sıçan, 17 sinjeneik nakil ve 12 allojenik nakil kullanılmıştır. Sinjeneik nakledilen karaciğerler, belirlenen 8 veya 30 günlük deneysel son noktalarına %70 başarı oranı ile hayatta kalırken, allojenik nakledilen karaciğerler, %50 başarı oranı ile belirlenen 3 veya 8 günlük son noktalarına kadar hayatta kaldı. Başarısızlıklar, cerrahi komplikasyonlar nedeniyle ölen fareleri ve alıcı hayatta kalsa bile ba...

Tartışmalar

Karaciğer nakli, son dönem karaciğer hastalığı olan hastalar için tek tedavi seçeneğidir ve ABD'de yılda yaklaşık 9.000 LTx gerçekleştirilmektedir¹³. Ne yazık ki, LTx alıcılarının %25 kadarında immünolojik rejeksiyon görülmektedir ve bu rejeksiyon nakledilen organ ve hasta için zararlıdır^14,15. LTx sonrası sonuçları iyileştirmek için, organ reddini incelemek ve reddi azaltmak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	C013D
5-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-50
6-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-60
7-0 Silk ties	Teleflex	103-s
9-0 Polyamide Suture	AROSurgical	T05A09N10-13	Black
Bipolar Cautery	Codman & Shurtleff Inc.	P.H. 234
Buprenorphine HCL	Hospira	409201232
Forceps, Adson-Brown	Fine Science Tools	11627-12	12.5 cm
Forceps, Angled Dumont	Fine Science Tools	11253-25	Medical #5/45 11 cm
Forceps, Suture Tying	Fine Science Tools	18025-10	10 cm
Heparin Sodium Injection, USB	Fresenius Kabi	504015	10,000 USP units per 10 mL
Hydrodissection Cannula	Ambler Surgical	1021E	27 G
Isoflurane	Dechra Vet. Products	17033-091-25
I.V. Catheter	Kendall	2619PUR	26 G x 3/4"
Magnetic Retraction System	Fine Science Tools	18200-50
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-05	6 mm
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-06	4 mm
Micro Clamp Applicator	Fine Science Tools	18057-14	14 cm
Micro Needle Holder	S&T	C-14	14 cm
Microscope	Zeiss	Universal S3	Dual head
Ophthalmic Ointment	Puralube	14590500
Polyimidi Tubing	Cole Parmer	95820-04	OD 0.0215", ID 0.0195", wall 0.0010"
Saline	Baxter	281324	0.9% Sodium Chloride
Surgical Spring Scissors	S&T	SDC-15	Blunt 14 cm
Surgical Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Vannas 14 cm