Heterotopes Hilfstransplantationsmodell für die ganze Leber von Ratten unter Verwendung einer Hepaticoureterostomie für Studien zur Abstoßung von Allotransplantaten

Zusammenfassung

Das hier beschriebene heterotope Hilfslebertransplantationsprotokoll der Ratte bietet ein praktisches Untersuchungswerkzeug zur Erforschung der Mechanismen der Abstoßung von Lebertransplantaten. Dieses Modell trägt dazu bei, die chirurgischen Hürden und den Stress der orthotopen Lebertransplantation bei Ratten zu verringern.

Zusammenfassung

Kleintiertransplantationsmodelle sind unverzichtbar für Organtoleranzstudien, um in präklinischen Studien praktikable therapeutische Interventionen zu untersuchen. Bei der Rattenlebertransplantation (LTx) wird in der Regel ein orthotopes Modell verwendet, bei dem die native Leber des Empfängers entnommen und durch eine Spenderleber ersetzt wird. Dieser technisch anspruchsvolle chirurgische Eingriff erfordert fortgeschrittene mikrochirurgische Fähigkeiten und wird durch lange anhepatische und unterkörpereigene Ischämiezeiten zusätzlich erschwert. Dies führte zur Entwicklung einer weniger komplizierten heterotopen Methode, die schneller und ohne anhepatische oder ischämieartige Zeit des Unterkörpers durchgeführt werden kann, wodurch der postoperative Stress für das Empfängertier reduziert wird.

Dieses heterotope LTx-Protokoll umfasst zwei Hauptschritte: das Herausschneiden der Leber der Spenderratte und das Transplantieren der gesamten Leber in die Empfängerratte. Während der Exzision der Spenderleber ligatisiert der Chirurg die suprahepatische Hohlvene (SHVC) und die Leberarterie (HA). Auf der Empfängerseite entfernt der Chirurg die linke Niere und positioniert die Spenderleber mit der Pfortader (PV), der infrahepatischen Hohlvene (IHVC) und dem Gallengang in Richtung der Nierengefäße. Weiterhin anastomosiert der Chirurg die Nierenvene des Empfängers von Ende zu Ende mit dem IHVC der Leber und arteriisiert die PV mit der Nierenarterie unter Verwendung eines Stents. Eine Hepaticoureterostomie wird für die Gallendrainage eingesetzt, indem der Gallengang in den Harnleiter des Empfängers anastomosiert wird, wodurch die Galle über die Blase abgeführt werden kann.

Die durchschnittliche Dauer der Transplantation betrug 130 Minuten, die Dauer der kalten Ischämie betrug etwa 35 Minuten und die Dauer der warmen Ischämie betrug weniger als 25 Minuten. Die Hämatoxylin- und Eosin-Histologie der Hilfsleber aus syngenen Transplantaten zeigte 30 Tage nach der Transplantation eine normale Hepatozytenstruktur ohne signifikante parenchymale Veränderungen. Im Gegensatz dazu zeigten allogene Transplantatproben 8 Tage nach der Transplantation eine umfangreiche lymphozytäre Infiltration mit einem Banff-Schema-Abstoßungsaktivitätsindex von 9. Daher ermöglicht diese LTx-Methode eine Alternative zu orthotopem LTx mit niedrigem Morbiditätsabstoßungsmodell.

Einleitung

Kleintier-LTx ist ein unschätzbares Modell für die Untersuchung von Mechanismen der Leberabstoßung. Die heterotope Hilfslebertransplantation mit Pfortaderarterialisation (HALT-PVA) bei Ratten wurde 1968 von Lee und Edgington¹eingeführt, als sie berichteten, dass die Nierenvene und die Arterie eines Empfängers verwendet wurden, um eine transplantierte Hilfsleber wieder zu vaskularisieren. In der Folge verbesserten Hess et ^al.2 das Protokoll durch die Abschwächung der funktionellen Konkurrenz zwischen der nativen und der Hilfsleber, indem sie die Größe der nativen Leber und der Spenderleber reduzierten und die Verbindung zwischen den Spendergallengängen rekonstruierten, was zu einem langfristigen Überleben des Transplantats führte. Weitere Verfeinerungen wurden mit der Einführung der Manschettenanastomose ^3,4 vorgenommen, und Schleimer et ^al.5 bestimmten den optimalen Stentdurchmesser für die Regulierung des Blutflusses, um einen physiologischen Pfortaderfluss zu erhalten und eine Hyper- oder Hypoperfusion des Transplantats zu vermeiden. Andere Forscher entwickelten signifikante Veränderungen des Verfahrens, indem sie die Milzarterie⁶ oder die Arteria iliaca⁷ communis für die Blutversorgung des Transplantats verwendeten, während einige Modelle entwickelten, die nur venöses Blut⁸ oder nur arterielles Blut über die Leberarterie⁹ verwendeten, um das zusätzliche Lebertransplantat zu versorgen.

Die vorliegende Studie ging von der Hypothese aus, dass die funktionelle Konkurrenz durch die native Leber die Abstoßung des Allotransplantats nicht beeinträchtigen würde, daher entwickelten wir ein Protokoll auf der Grundlage des flussregulierten Schleimer-Modells¹⁰ , das keine Größenreduktion der nativen oder Hilfsleber beinhaltete. Die linke Seite des Empfängers wurde ausgewählt, um das Transplantat zu lokalisieren, da sie eine optimale Orientierung zwischen den Nieren- und Spenderlebergefäßen des Empfängers bietet. Ursprünglich versuchten wir eine Gallenrekonstruktion mittels Hepaticoduodenostomie, aber diese Versuche bestätigten lediglich Schleimers Behauptung, dass "die Gallendrainage die Achillesferse der Lebertransplantation ist"¹⁰. Dies veranlasste die Entwicklung einer neuen Technik, bei der der Gallengang mit einem Stent mit dem Harnleiter des Empfängers durchgehend anastomosiert wird, was den Abfluss der Galle über die Blase ermöglicht. Ein bemerkenswerter Vorteil einer Hepatikureterostomie besteht darin, dass die Leberfunktion des Transplantats täglich durch Beobachtung des Urins überwacht werden kann. Ein Gallen produzierendes Lebertransplantat färbt den Urin hellgelb. Abbildung 1 stellt einen schematischen Überblick über die HALT-PVA-Methode dar.

Ein wichtiger Vorteil der heterotopen gegenüber der orthotopen Ratten-LTx bezieht sich auf das Fehlen einer anhepatischen oder totalen Unterkörperischämiezeit, was eine schnellere und einfachere Genesung der heterotopen Empfänger ermöglicht. Darüber hinaus stützen sich immunologische LTx-Studien mit orthotopen Methoden oft auf eine schwere Abstoßung oder den Tod des Empfängers als experimentellen Endpunkt, was bei heterotopen Transplantaten nicht der Fall ist, bei denen das Tier auch dann gesund bleibt, wenn das Allotransplantat aufgrund einer Abstoßung nicht mehr funktioniert. Beide Merkmale der heterotopen Methode unterstützen die Prinzipien der internationalen 3R-Initiative (Replacement, Reduction, and Refinement)¹¹, die einen Rahmen zur Minimierung von Schmerzen, Leiden und Leiden von Versuchstieren und zur Verbesserung ihres Wohlbefindens fördert.

Das hier vorgestellte HALT-PVA-Modell ist eine praktische und zuverlässige Methode, um die Mechanismen der Abstoßung von Allotransplantaten in der Leber in präklinischen Studien zu untersuchen. Diese nützliche experimentelle Technik hilft, den erheblichen chirurgischen Bedarf und den Stress der orthotopen LTx bei Ratten zu überwinden. In Zukunft beabsichtigen wir, diese Methode zu nutzen, um die Mechanismen der akuten Immunabstoßung zu untersuchen und gleichzeitig neue Ziele und therapeutische Strategien zur Unterdrückung der Abstoßung von Lebertransplantaten zu erforschen.

Protokoll

Die Tiere wurden in den Tierpflegeeinrichtungen der University of Wisconsin (UW)-Madison Institute for Medical Research gemäß den institutionellen Richtlinien gezüchtet und unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Das Studienprotokoll (Nr. M006022) wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee an der UW School of Medicine and Public Health genehmigt, und alle Tiere wurden ethisch behandelt.

1. Tiere

1. Als Spenderratten werden adulte weibliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 205-235 g und männliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 250-280 g verwendet. Als Empfänger werden adulte männliche Lewis- und Brown-Ratten mit einem Gewicht von 365-420 g verwendet.
2. Führen Sie syngene Transplantationen durch, indem Lewis-Spender in Lewis-Empfänger transplantiert werden, während bei den allogenen Transplantaten Lewis-Spender verwendet werden, die in Brown-Norwegen-Empfänger transplantiert wurden.
3. Führen Sie alle Operationen von zwei Personen mit einem Doppelkopfmikroskop durch.

2. Verfahren zur Beschaffung von Leberhilfsspendern

1. Betäuben Sie die Spenderratte mit 5% Isofluran-Inhalation in einer Induktionskammer. Notieren Sie das Gewicht der Ratte und rasieren Sie den Bauch mit einer elektrischen Schermaschine.
2. Positionieren Sie die Ratte in Rückenlage auf einer beheizten Operationsunterlage mit der Nase in einem Anästhesiekegel und fixieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Desinfizieren Sie den Bauch mit 75% Alkohol und senken Sie den Isofluran auf 2%.
3. Machen Sie mit einer Schere einen Haut- und Muskelschnitt in Längsrichtung der Mittellinie vom Schambein bis zum Xiphoid. Nahe der Mitte des Längsschnitts wird dieser seitlich nach links und rechts verlängert, dann werden auf beiden Seiten der Bauchdecke und des Xiphoid-Prozesses Retraktoren installiert.
4. Ziehen Sie den Darm mit feuchten Wattestäbchen auf die linke Seite des Bauches zurück, während Sie mit einer Federschere die an der Leber befestigten Magenbänder durchtrennen und dann den Darm unter angefeuchteter Gaze ruhigstellen. Decken Sie die Leber mit einem kleinen Stück steriler Gaze ab, die mit warmer Kochsalzlösung angefeuchtet ist.
5. Verwenden Sie feuchte Wattestäbchen, um die Leber zurückzuziehen und die falciformen, dreieckigen, hepatogastrischen und hepatoduodenalen Bänder zu präparieren. Anschließend wird mit einer bipolaren Pinzette kauterisiert und die paraösophagealen Gefäße zwischen dem linken lateralen und dem vorderen Schwanzlappen geteilt.
6. Präparieren Sie mit einer Winkelzange oder Nadelhaltern hinter dem SHVC unterhalb des Zwerchfells, führen Sie dann eine 5-0-Seidennaht unter das SHVC und binden Sie locker einen Doppelknoten für den späteren Gebrauch.
7. Ziehen Sie den unteren rechten Seitenlappen nach oben zurück, durchtrennen Sie das Band und immobilisieren Sie es unter angefeuchteter Gaze. Isolieren Sie das IHVC aus dem retroperitonealen Gewebe bis hinunter zur rechten Nierenvene und ligieren Sie die rechte Nebennierenvene mit einer 6-0-Seidennaht so nah wie möglich an der IHVC. Teilen Sie diese Vene später, wenn das Transplantat entfernt wird.
8. Dissoziieren Sie das PV mit einer 27-G-Hydrodissektionsnadel (Abbildung 2A) vom umgebenden Bindegewebe und trennen es von den Pylorus- und Milzvenen, indem Sie sie mit einer 7-0-Seidennaht ligatisieren und teilen.
9. Isolieren, mit einer 6-0-Seidennaht ligatisieren und die Arteria hepatica communis in der Nähe der Stelle teilen, an der sie unter der PV verläuft.
10. Lilizieren Sie den Gallengang mit einer 5-0-Seidennaht an der Verzweigung der Arteria gastroduodenalis, wobei das Fettgewebe um den Gallengang herum so weit wie möglich erhalten bleibt. Vermeiden Sie insbesondere, den Gallengang von der eigentlichen Leberarterie zu trennen, und halten Sie die Gesamtlänge so kurz wie möglich.
11. Machen Sie mit einer Federschere einen kleinen Schnitt in die Wand des Gallengangs proximal der Ligatur. Führen Sie einen Polyimidschlauch-Stent mit einem Durchmesser von 0,0215 Zoll und einem Durchmesser von 5 mm in das Gallengangslumen ein und befestigen Sie ihn mit einer 6-0-Seidennaht, wobei ein Ende der Naht für die spätere Verwendung lang bleibt. Teilen Sie den Gallengang, indem Sie zwischen den Ligaturen 5-0 und 6-0 schneiden.
12. Markieren Sie die Oberseite von IHVC und PV mit einem chirurgischen Färbestift, um die Gefäße während der Anastomose auszurichten, und klemmen Sie dann die Pfortader mit einer Mikrogefäßklemme so distal wie möglich zur Leber ein.
13. Führen Sie eine 20-ml-Spritze mit einer 26-g-Nadel in das PV proximal der Mikroklemme ein und perfundieren Sie die Leber mit 10-15 ml eiskalter, heparinisierter Kochsalzlösung; Teilen Sie gleichzeitig den IHVC mit einer Federschere so nah wie möglich an der rechten Nierenvene.
14. Exzitieren Sie die Leber mit einer Federschere, indem Sie das PV proximal zur Mikroklemme präparieren, die zuvor um das SHVC gelegte 5-0-Naht festziehen und das Zwerchfell präparieren, um die intrathorakale Hohlvene zu durchtrennen.
15. Fahren Sie fort, indem Sie die verbleibenden Bänder im hinteren Teil der Leber präparieren und die zuvor ligierte Nebennierenvene teilen. Legen Sie die herausgeschnittene Leber in kalte Kochsalzlösung auf Eis.

3. Verfahren zur Transplantation von Hilfslebern

1. Betäuben Sie die Empfängerratte mit einer 5%igen Isofluran-Inhalation in einer Induktionskammer. Notieren Sie das Gewicht der Ratte und rasieren Sie den Bauch mit einer elektrischen Schermaschine.
2. Positionieren Sie die Ratte in Rückenlage auf einer beheizten Operationsunterlage mit der Nase in einem Anästhesiekegel und fixieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Tragen Sie ein Augenschmiermittel auf, desinfizieren Sie den Bauch mit 75% Alkohol und senken Sie den Isofluran auf 2%.
3. Machen Sie mit einer Schere einen Längsschnitt in der Mittellinie der Haut und der Muskeln vom Schambein bis zum Xiphoid und installieren Sie dann Retraktoren auf beiden Seiten der Bauchdecke.
4. Ziehen Sie die Eingeweide mit feuchten Wattestäbchen auf die rechte Seite des Bauches zurück und bedecken Sie sie mit angefeuchteter Gaze. Tragen Sie eine weitere feuchte Gaze auf, um Magen, Milz und Leber zu bedecken, und legen Sie die linke Niere und die Nierengefäße frei.
5. Trennen Sie mit einer 27-G-Hydrodissektionsnadel und einer Zange mit stumpfer Spitze die linke Nierenvene von der Nierenarterie und entfernen Sie vorsichtig Fett und Bindegewebe aus beiden Gefäßen.
6. Isolieren Sie die Gonaden- und Nebennierenvenen und verwenden Sie 6-0-Seide, um sie proximal zur Nierenvene vorübergehend zu ligieren. Mit einer bipolaren Pinzette werden alle Mikroseitenäste, die die Nierenvene und die Arterie zwischen der Aorta/VC und der Niere isolieren, verätzt.
7. Mobilisieren und ligieren Sie den Harnleiter mit einer 6-0-Seidennaht am unteren Pol. Markieren Sie die Nierenvene und die Arterie mit einem chirurgischen Färbestift, um die Gefäße während der Anastomose auszurichten und sicherzustellen, dass keine Verdrehungen auftreten.
8. Klemmen Sie die Nierenarterie und die Nierenvene mit einer Mikrogefäßklemme so nah wie möglich an der Aorta und VC. Durchschneiden Sie die Nierenarterie mit einer Federschere kurz hinter der Gefäßgabelung und teilen Sie die Nierenvene etwa auf halbem Weg zwischen VC und Niere. Mobilisieren Sie die linke Niere aus dem umgebenden Bindegewebe und entfernen Sie diese.
9. Spülen Sie beide Gefäße mit heparinisierter Kochsalzlösung mit einer 27-G-Hydrodissektionsnadel, um das restliche Blut zu entfernen.
10. Schneiden Sie mit einer Federschere eine kleine Öffnung des Fischmauls in die Gabel der Nierenarteriengabelung, um eine trichterförmige Öffnung zu erhalten, und setzen Sie einen 8 mm Stent, der aus einem 26 G-Katheter geschnitten wurde (Abbildung 2B). Befestigen Sie den Stent mit einer 6-0-Seidennaht, wobei Sie ein Ende der Naht für die spätere Verwendung lang lassen.
11. Führen Sie die Spenderleber ein und positionieren Sie sie mit dem PV, dem IHVC und dem Gallengang in Richtung der linken Nierenvene und Arterie des Empfängers. Platzieren Sie mit einer 9-0-Nylonnaht zwei Stay-Nähte auf gegenüberliegenden Seiten der IHVC-Nierenvenenverbindung.
12. Vergleichen Sie die Breite der Gefäße und machen Sie mit einer Federschere einen kleinen Schnitt aus dem Fischmaul in das Gesicht der Nierenvene, bis es eine ähnliche Breite wie die IHVC des Spenders hat (Abbildung 2C).
13. Anastomosieren Sie mit einer 9-0-Nylonnaht das Leber-IHVC von Ende zu Ende mit der Nierenvene mit 9 oder 10 verlaufenden Nähten an der Vorder- und Rückwand des Gefäßes. Alternativ können Sie eine Manschettenmethode verwenden, um diese Anastomose^{zu vervollständigen 3,4}.
14. Vergewissern Sie sich, dass sich die Position der Nierenarterie unter dem IHVC befindet (Abbildung 2D), und führen Sie den zuvor in der Nierenarterie platzierten Stent in die Leberpfortader ein und befestigen Sie ihn mit einer 6-0-Seidennaht, wobei Sie ein Ende der Naht lang lassen, um mit dem gegenüberliegenden Faden an der Arterie zu verbinden. Ziehe die Enden zusammen, damit sie nicht vom Stent rutschen.
15. Entfernen Sie zuerst die Mikroklemme an der Nierenvene, dann die Mikroklemme an der Nierenarterie.
16. Während der Reperfusion der Leber wird mit Mulle und Wattestäbchen leichter Druck auf die Anastomosenregion ausgeübt, bis eine offene Anastomose erreicht ist (Abbildung 2D). Entfernen Sie die temporären Ligaturen, die zuvor an den Nebennieren- und Gonadenvenen platziert wurden.
17. Mobilisieren Sie vorsichtig etwa 10 mm am Ende des linken Harnleiters aus dem umgebenden Bindegewebe und lassen Sie eine beträchtliche Menge an Fettgewebe anhaften. Machen Sie mit einer Federschere einen kleinen Schnitt in die Wand des Harnleiters proximal der zuvor platzierten 5-0-Ligatur.
18. Führen Sie den zuvor am Gallengang befestigten Polyimid-Stent in den kleinen Schnitt in der Harnleiterwand ein. Befestigen Sie es mit einer 6-0-Seidennaht und binden Sie ein Ende mit dem langen Faden auf der Gallengangsseite des Stents zusammen, indem Sie beide Enden fest zusammenziehen.
19. Bringen Sie den Darm wieder in seine natürliche Position zurück (Abbildung 2E), spülen Sie mit 2-3 ml Kochsalzlösung und verschließen Sie den Bauch in zwei Schichten mit 3-0 Seidennähten.
20. Injizieren Sie 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan, setzen Sie den Empfänger in einen sauberen, beheizten Käfig und überwachen Sie die Genesung 1-2 Stunden lang, bevor Sie das Tier in die Haltungseinrichtung zurückbringen.

4. Nachsorge nach der Operation

1. Ab Tag 2 nach der Operation wird allogenen Transplantatempfängern täglich subkutan Heparin (1 I.E./g) injiziert.
2. Ab dem 2. Tag nach der Operation injizieren Sie syngenen Transplantatempfängern jeden zweiten Tag subkutan Heparin (1 I.E./2 g).

Ergebnisse

Gegenwärtig wurden 29 Rattenpaare verwendet, um das HALT-PVA-Protokoll zu etablieren, 17 syngene Transplantate und 12 allogene Transplantate. Die syngenisch transplantierten Lebern überlebten bis zu ihrem vorgesehenen 8- oder 30-Tage-Endpunkt mit einer Erfolgsrate von 70 %, während allogene transplantierte Lebern mit einer Erfolgsquote von 50 % bis zu ihren vorgesehenen 3- oder 8-Tage-Endpunkten überlebten. Zu den Misserfolgen gehören Ratten, die aufgrund chirurgischer Komplikatione...

Diskussion

Die Lebertransplantation ist die einzige Behandlungsoption für Patienten mit Lebererkrankungen im Endstadium, wobei in den USA jährlich fast 9.000 LTxs durchgeführt werden¹³. Leider wird bei bis zu 25 % der LTx-Empfänger eine immunologische Abstoßung beobachtet, die sich nachteilig auf das transplantierte Organ und den Patienten auswirkt^14,15. Um die Ergebnisse nach LTx zu verbessern, ist die Entwickl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	C013D
5-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-50
6-0 Silk ties	Fine Science Tools	18020-60
7-0 Silk ties	Teleflex	103-s
9-0 Polyamide Suture	AROSurgical	T05A09N10-13	Black
Bipolar Cautery	Codman & Shurtleff Inc.	P.H. 234
Buprenorphine HCL	Hospira	409201232
Forceps, Adson-Brown	Fine Science Tools	11627-12	12.5 cm
Forceps, Angled Dumont	Fine Science Tools	11253-25	Medical #5/45 11 cm
Forceps, Suture Tying	Fine Science Tools	18025-10	10 cm
Heparin Sodium Injection, USB	Fresenius Kabi	504015	10,000 USP units per 10 mL
Hydrodissection Cannula	Ambler Surgical	1021E	27 G
Isoflurane	Dechra Vet. Products	17033-091-25
I.V. Catheter	Kendall	2619PUR	26 G x 3/4"
Magnetic Retraction System	Fine Science Tools	18200-50
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-05	6 mm
Micro Clamps	Fine Science Tools	18055-06	4 mm
Micro Clamp Applicator	Fine Science Tools	18057-14	14 cm
Micro Needle Holder	S&T	C-14	14 cm
Microscope	Zeiss	Universal S3	Dual head
Ophthalmic Ointment	Puralube	14590500
Polyimidi Tubing	Cole Parmer	95820-04	OD 0.0215", ID 0.0195", wall 0.0010"
Saline	Baxter	281324	0.9% Sodium Chloride
Surgical Spring Scissors	S&T	SDC-15	Blunt 14 cm
Surgical Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Vannas 14 cm