Aislamiento de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical con alto rendimiento y bajo daño

Resumen

Este estudio presenta un procedimiento único de disección roma para preservar la integridad de la jalea de Wharton (WJ), lo que resulta en WJ menos dañado y una mayor cantidad y viabilidad de las células madre mesenquimales (MSC) recolectadas. El método demuestra un rendimiento y una capacidad proliferativa superiores en comparación con los métodos convencionales de disección aguda.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) son una población de células multipotentes con notables propiedades regenerativas e inmunomoduladoras. La jalea de Wharton (WJ) del cordón umbilical (CU) ha ganado un interés creciente en el campo biomédico como una fuente excepcional de MSCs. Sin embargo, han surgido desafíos como la oferta limitada y la falta de estandarización de los métodos existentes. Este artículo presenta un método novedoso para mejorar el rendimiento de MSC mediante la disección de WJ intacta del cordón umbilical. El método emplea la disección roma para eliminar la capa epitelial, manteniendo la integridad de todo el WJ y dando como resultado una mayor cantidad y viabilidad de las MSC cosechadas. Este enfoque reduce significativamente el desperdicio de WJ en comparación con los métodos convencionales de disección aguda. Para garantizar la pureza de las WJ-MSC y minimizar la influencia celular externa, se llevó a cabo un procedimiento que utilizaba la tensión interna para despegar el endotelio después de voltear la CU. Además, la placa de Petri se invirtió durante un corto período de tiempo durante el cultivo del explante para mejorar la unión y el crecimiento de las células. El análisis comparativo demostró la superioridad del método propuesto, mostrando un mayor rendimiento de WJ y WJ-MSCs con mejor viabilidad que los métodos tradicionales. La morfología y el patrón de expresión similares de los marcadores de superficie celular en ambos métodos confirman su caracterización y pureza para diversas aplicaciones. Este método proporciona un enfoque de alto rendimiento y alta viabilidad para el aislamiento de WJ-MSC, demostrando un gran potencial para la aplicación clínica de MSCs.

Introducción

Desde el primer aislamiento de células madre mesenquimales (MSC) a partir de jalea de Wharton (WJ) en 1991, estas células madre multipotentes han atraído una gran atención por parte de los investigadores debido a sus propiedades regenerativas y su capacidad de diferenciación multilinaje¹. Las MSC se pueden aislar de varias fuentes, como la médula ósea, la sangre periférica, la pulpa dental, el tejido adiposo, el feto (aborto humano) y los tejidos relacionados con el nacimiento². El cordón umbilical (CU) se ha convertido en un reservorio prometedor debido a su naturaleza no invasiva, abundante rendimiento celular y capacidad de diferenciación, exhibiendo una alta tasa de proliferación, potencial de diferenciación y propiedades de modulación inmune³. Las MSC fetales exhiben fuertes propiedades madre e inmunológicas, lo que las convierte en el foco principal de los ensayos clínicos y la investigación básica realizada en las últimas dos décadas ^2,4,5. Las MSC derivadas de la CU tienen un potencial terapéutico superior en comparación con otras fuentes de MSC, como la médula ósea o el tejido adiposo ^6,7.

La CU está compuesta por epitelio amniótico, tres vasos (dos arterias y una vena) y la sustancia gelatinosa conocida como WJ³. Curiosamente, la CU constituye una vasculatura simple, que consta solo del endotelio y el mesotelio, pero no de la túnica adventicia; el WJ no contiene linfa ni nervios⁸. La UC presenta una estructura única ideal para la separación segmentaria. Las UC-MSC se encuentran principalmente en el WJ. Las MSC podrían aislarse de diferentes compartimentos del WJ, incluyendo el amnios, el subamnios (el amnios y el subamnios también designados como región de revestimiento del cordón) y el área perivascular del WJ⁸. Cada región del WJ tiene su propia estructura, características inmunohistoquímicas y función ^3,6.

Las MSCs aisladas del WJ de la UC son ampliamente consideradas como de utilidad clínica superior en comparación con las de otras regiones³. Las WJ-MSC han sido ampliamente estudiadas en entornos preclínicos y clínicos para el tratamiento de diversas enfermedades debido a su potencial de diferenciación multilínea, propiedades inmunomoduladoras, efectos paracrinos, efectos antiinflamatorios y propiedades inmunoprivilegiadas ^2,3. Se ha demostrado que las WJ-MSC son prometedoras en el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluida la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), el rechazo del injerto, la enfermedad de Crohn, las enfermedades autoinmunes y las enfermedades cardiovasculares 9,10,11,12,13,14. A medida que la demanda clínica de WJ-MSC continúa aumentando, la escasez de suministro de cordones umbilicales es actualmente un impedimento para sus aplicaciones generalizadas.

El rendimiento de las WJ-MSCs depende del método utilizado para la extracción celular¹⁵. Si bien las WJ-MSC se pueden aislar mediante cultivo de explantes o digestión enzimática, este último método tiene un tiempo de propagación más largo que puede aumentar el riesgo de daño celular y disminuir la viabilidad celular¹⁶. Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que el método de cultivo de explantes aumenta el rendimiento y la viabilidad de las células, y que los factores paracrinos liberados de los tejidos de los explantes también ayudan a promover la proliferación celular^17,18.

Este estudio aplicó un enfoque de disección único para obtener WJ completo, produciendo MSC con mayor capacidad proliferativa, viabilidad y cantidad, al tiempo que minimiza el daño a la WJ. Este método innovador ofrece una estrategia optimizada para aislar los WJ-MSC, abordando las necesidades críticas en las aplicaciones de MSC.

Protocolo

Las muestras se obtuvieron de los donantes sanos y consentidos del Hospital de Atención Materna e Infantil del Distrito de Shenzhen Longgang, Guangdong, China. El uso de muestras humanas para el estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Shenzhen, la Universidad de Medicina China de Beijing (SZLDH2020LSYM-095) y el Comité de Ética Médica del Hospital de Atención Médica Infantil y de Maternidad del Distrito de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recolección de cordón umbilical humano

1. Obtener muestras de cordón umbilical humano del hospital cooperativo en condiciones estériles.
   NOTA: Elija un donante menor de 35 años, preferiblemente un primípara, sin antecedentes de hepatitis, enfermedades de transmisión sexual o trastornos genéticos. Los resultados del examen de admisión para el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C y el citomegalovirus deben ser negativos. Elija la cesárea como modo de parto.
2. Seleccione una pieza recta e intacta de UC de aproximadamente 10-15 cm de longitud.
3. Cierre ambos extremos con pinzas hemostáticas y látese con nudos quirúrgicos en el extremo interno entre las pinzas justo después del parto de un recién nacido a término por cesárea. (CU recolectada como se muestra en la Figura 1, paso 1).
   NOTA: La operación de la cesárea asegura que la recolección sea estéril. Utilice nudos quirúrgicos de sutura de tamaño 0 o 2-0 para una mejor resistencia a la tracción.
4. Corte el cordón umbilical atado entre las pinzas y los nudos con unas tijeras quirúrgicas (Figura 1, paso 1).
5. Enjuáguelo con solución salina para eliminar cualquier coágulo de sangre contaminante en la superficie y transfiéralo rápidamente a un tubo de plástico estéril de 50 ml que contenga 20 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
   NOTA: No se utilizó ningún antibiótico durante la transferencia.
6. Selle el tubo. Colóquelo en hielo en una caja de poliestireno y guárdelo a 4 °C antes de transportarlo al laboratorio.
   NOTA: Diseccione el cordón dentro de las 4 horas posteriores a la recolección.

2. Aislamiento de la gelatina de Wharton del cordón umbilical

1. Procesa el cordón umbilical siguiendo los siguientes pasos:
   1. Prepare una bandeja esterilizada con instrumentos quirúrgicos, platos de 90 mm envasados asépticamente, pipetas de 1000 μL, PBS estéril, solución de etanol al 75% y medio de cultivo de MSC humano libre de xeno.
      NOTA: Las pinzas dentadas y las pinzas antimosquitos permiten tratar el cordón deslizante de manera eficiente.
   2. Descontamine la superficie y la zona de trabajo requerida antes de colocar los artículos dentro del gabinete de bioseguridad.
      NOTA: Deje que el aire de la zona de trabajo se purgue durante unos minutos antes de comenzar a trabajar.
   3. Desinfecte la superficie del tubo y retire la muestra en una placa de Petri en el gabinete de bioseguridad. Sumerja la muestra con los nudos en etanol al 75% durante 30 s y luego enjuáguela varias veces con PBS estéril en una nueva placa de Petri.
      NOTA: El cordón debe ligarse antes de sumergirlo en etanol al 75%, y el tiempo de inmersión debe limitarse a 30 s a 1 min para desinfectar completamente el cordón sin dañarlo.
   4. Corta los nudos y corta el cordón entre dos nudos transversalmente en trozos cortos de unos 2 cm de longitud con unas tijeras quirúrgicas y pinzas.
      NOTA: Los extremos del cordón con nudos deben desecharse. La longitud de la UC no debe ser ni demasiado larga ni demasiado corta; Ambas condiciones pueden aumentar la dificultad de la operación.
   5. Perfundir la vena (vaso más grande) con PBS utilizando pipetas de 1000 μL hasta que el líquido que sale del otro extremo del cordón se vuelva completamente transparente¹⁹.
2. Disecciona el cordón umbilical.
   1. Transfiera una de las piezas ya cortadas a una nueva placa de Petri.
      NOTA: Dos arterias y una vena deben estar expuestas visiblemente en la sección transversal⁸ (Figura 2B).
   2. Agregue la cantidad adecuada de PBS para mantener el cable húmedo durante toda la operación.
   3. Agarre el cordón con pinzas y extraiga las arterias a lo largo de su eje principal con la ayuda de pinzas para mosquitos.
      NOTA: Trate de tirar desde el otro extremo del cordón si la arteria ha sido arrancada, ya que la pared de la arteria tiene una gran elasticidad.
   4. Fije el cordón horizontalmente con el lado más grueso hacia arriba insertando una hoja de las pinzas en la vena umbilical y luego apretándolamente, asegurándose de que las pinzas se sujeten en el lado más grueso.
   5. Realice una incisión lineal en la capa de epitelio amniótico de un extremo al otro a lo largo del borde de la otra hoja de las pinzas con un bisturí (Figura 3).
      NOTA: Conserve la integridad de la gelatina de Wharton cortando la menor cantidad posible de WJ.
   6. Comience en una esquina del espacio de corte. Levante la esquina del epitelio amniótico con pinzas dentadas y continúe cortando horizontalmente un poco más con tijeras corneales a lo largo de la superficie interna del epitelio.
      1. Separe la gelatina de Wharton y el epitelio amniótico con pinzas y expanda gradualmente a todo el círculo de un extremo de la CU. Despegue la capa epitelial a lo largo (Figura 3).
         NOTA: La jalea de Wharton es un tejido conectivo mucoso encerrado por el denso epitelio amniótico⁸. Toda la operación debe ser suave, pero las pinzas para mosquitos podrían usarse para la disección roma si uno encuentra dificultades durante el pelado.
   7. Inserte ambas hojas de las pinzas dentro de la vena, sujete una porción de WJ y luego gírela al revés para exponer el epitelio de la vena umbilical (Figura 3).
   8. Despegue el epitelio de la vena fácilmente, ya que la tensión interna crea una separación entre el epitelio de la vena y el WJ perivascular (Figura 3).
3. Diseccionar la CU utilizando el método convencional de comparación²⁰.
   1. Elija otra muestra ya cortada de casi el mismo peso que el cable anterior y transfiérala a una nueva placa de Petri.
   2. Cortar longitudinalmente a lo largo de la vena umbilical con unas tijeras y extender la UC para exponer los vasos y la WJ.
   3. Extirpe la vena umbilical y las dos arterias, y extraiga el WJ de la capa endotelial con tijeras y bisturí.

3. Aislamiento y cultivo de las UC-MSC

1. Coloque el WJ recolectado en una placa de Petri de 90 mm preetiquetada y córtela en trozos de 1-3 mm con tijeras y pinzas.
2. Invierta el plato con la tapa en la parte inferior y colóquelo en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 30 min para fortalecer la unión entre las piezas y la superficie de plástico.
3. Dé la vuelta al plato y agregue suavemente una cantidad adecuada de medio de cultivo MSC humano para un cultivo posterior.
   NOTA: Utilice la velocidad más baja para asegurarse de que las piezas aún estén unidas.
4. Cambie el medio de cultivo MSC humano cada 3 días. Intercambie dos tercios del medio y observe la apariencia de crecimiento de células fibrosas cada 2 días durante los primeros 7 días, cambie el medio completo y obsérvelo diariamente a partir de entonces.
   NOTA: Evite mover la placa de Petri durante los primeros 7 días. El crecimiento distinguido de las células similares a los fibroblastos se observó en aproximadamente 4 días.
5. Subcultura hasta que la confluencia alcance el 80%.
   NOTA: Este paso tarda entre 7 y 10 días.
   1. Precalentar el PBS, tripsina al 0,25% y el medio de cultivo MSC humano libre de xeno a 37 °C en un baño de agua.
   2. Enjuague con PBS después de aspirar el sobrenadante con pipetas y separe las células con tripsina precalentada al 0,25% hasta que las células puedan desprenderse golpeando la placa de Petri.
   3. Inactive la tripsina mezclando un medio de cultivo MSC precalentado en una proporción de 4:1, recoja la suspensión celular y centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
      NOTA: Estas celdas se consideran pasaje 0 (P0).
   4. Deseche el sobrenadante con una pipeta, vuelva a suspender las células en el medio de cultivo MSC humano e inocule en nuevas placas de Petri a una densidad de siembra de 1x10⁴ células/^cm2 para su propagación.
6. Usando un hemocitómetro, cuente el número total de células de los dos métodos después de la amplificación en el primer, segundo y tercer paso. Determine la morfología celular bajo el microscopio en el primer, tercer y quinto pasaje.
   NOTA: La morfología de estas células debe ser similar a la de las células P0.
7. Utilice las celdas del quinto pasaje para la citometría de flujo y otros experimentos.

4. Expresión de marcadores de superficie celular por citometría de flujo

1. Separe las células del pasaje 5 (P5) con tripsina al 0,25%, lave las células con tampón de tinción celular y centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender los gránulos con tampón de tinción celular a 100 μL cada uno.
2. Etiquete cada tubo y añada las cantidades adecuadas de anticuerpos, que se conjugaron con aloficocianina (APC), isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE siguiendo las instrucciones del fabricante²¹. Incubar durante 15-20 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
3. Centrifugar las células teñidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C, aspirar el sobrenadante con una pipeta y lavar una vez con tampón de tinción celular.
4. Repetir la centrifugación y resuspensión de las células con 300 μL del tampón de tinción celular.
5. Pase las células a través del citómetro de flujo y analice las células teñidas con anticuerpos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Determinación de la curva de crecimiento celular mediante el método de recuento celular

1. Prepare una suspensión unicelular de células P5 utilizando dos métodos: diluyéndolas en un medio de cultivo MSC humano.
2. Siembre 8.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos, con un total de 21 pocillos de cada método sembrados.
   NOTA: Mezcle las células suavemente soplando y succionando con pipetas antes de sembrar.
3. Coseche las células de tres pocillos después de 24 h de siembra. Realice el recuento de células con un hemocitómetro para calcular el valor medio.
   NOTA: Agite el plato antes del conteo de células. La duración de la agitación se puede prolongar para evitar la formación de agregados celulares.
4. Repita el recuento de células cada 24 h durante un total de 7 días. Traza una curva de crecimiento utilizando el tiempo (d) en el eje X y el recuento de células (x10⁴/mL) en el eje Y.

Resultados

En la Figura 1 se resumen los procedimientos de recolección y cultivo de UC-MSCs, así como su posterior análisis. La UC se diseccionó cuidadosamente en varias secciones utilizando el método único; el diagrama de operación específico de los procedimientos principales se ilustra en la Figura 2. El crecimiento de las células de los cultivos de explantes se monitoreó y registró de manera rutinaria. Se observaron células adherentes en forma de huso aproxi...

Discusión

Las MSC representan un área dinámica de investigación con profundas implicaciones para la medicina regenerativa²². Sus propiedades únicas los convierten en un punto focal para la investigación científica y tienen el potencial de revolucionar el tratamiento de una amplia gama de enfermedades y lesiones⁷. Las WJ-MSCs son un subconjunto distinto de las MSCs, que pueden obtenerse del tejido conectivo gelatinoso dentro de la CU situado entre el epitelio intervascular y amn...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD44 Antibody	Biolegend	338806
24-well cell culture plates	Thermo Scientific	142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	Biolegend	344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400122
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50
Automatic Cell Counter	Countstar	FL-CD
BAMBANKER Cryopreservation Solution	Wako	302-14681
Cell Staining Buffer	Biolegend	420201
Centrifugal Machine	Eppendorf	5424R
Clean Bench	Shanghai ZhiCheng	C1112B
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
D-PBS	Solarbio	D1040
Electro- thermostatic Blast Oven	Shanghai JingHong	DHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody	Biolegend	323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	Biolegend	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400110
Flow Cytometry	Beckman	CytoFLEX
hemocytometer	Superior Marienfeld	640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)	Biolegend	421002
Inverted Biological Microscope	ZEISS	Axio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage Tank	Thermo Scientific	CY50935-70
Normal saline (NS)	Meilunbio	MA0083
PBS	Solarbio	P1032
PE anti-human CD11b Antibody	Biolegend	393112
PE anti-human CD19 Antibody	Biolegend	392506
PE anti-human CD34 Antibody	Biolegend	343606
PE anti-human CD45 Antibody	Biolegend	368510
PE anti-human HLA-DR Antibody	Biolegend	307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400214
Precision Electronic Balance	Satorius	PRACTUM313-1CN
Snowflake Ice Machine	ZIEGRA	ZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tube	Greniner	227270
Thermostatic Water Bath	Shanghai YiHeng	HWS12
Trypsin 1:250	Solarbio	T8150
UltraGRO-Advanced	Helios	HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification System	Milli-Q	Milli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture Medium	FUKOKU	T2011301