Isolamento di cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale con rese elevate e basso danno

Riepilogo

Questo studio presenta un'esclusiva procedura di dissezione smussata per preservare l'integrità della gelatina di Wharton (WJ), con conseguente WJ meno danneggiata e una maggiore quantità e vitalità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) raccolte. Il metodo dimostra una resa e una capacità proliferativa superiori rispetto ai metodi convenzionali di dissezione tagliente.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una popolazione di cellule multipotenti con notevoli proprietà rigenerative e immunomodulatorie. La gelatina di Wharton (WJ) dal cordone ombelicale (UC) ha guadagnato un crescente interesse in campo biomedico come un'eccezionale fonte di MSC. Tuttavia, sono sorte sfide come l'offerta limitata e la mancanza di standardizzazione nei metodi esistenti. Questo articolo presenta un nuovo metodo per aumentare la resa di MSC sezionando WJ intatto dal cordone ombelicale. Il metodo impiega la dissezione smussata per rimuovere lo strato epiteliale, mantenendo l'integrità dell'intero WJ e determinando un aumento della quantità e della vitalità delle MSC raccolte. Questo approccio riduce significativamente gli sprechi di WJ rispetto ai metodi convenzionali di dissezione tagliente. Per garantire la purezza delle WJ-MSC e ridurre al minimo l'influenza cellulare esterna, è stata condotta una procedura che utilizza la tensione interna per staccare l'endotelio dopo aver capovolto la colite ulcerosa. Inoltre, la capsula di Petri è stata capovolta per un breve periodo durante la coltura di espiantazione per migliorare l'attaccamento e la crescita cellulare. L'analisi comparativa ha dimostrato la superiorità del metodo proposto, mostrando una resa più elevata di WJ e WJ-MSC con una migliore vitalità rispetto ai metodi tradizionali. La morfologia e il modello di espressione simili dei marcatori di superficie cellulare in entrambi i metodi confermano la loro caratterizzazione e purezza per varie applicazioni. Questo metodo fornisce un approccio ad alto rendimento e ad alta vitalità per l'isolamento di WJ-MSC, dimostrando un grande potenziale per l'applicazione clinica delle MSC.

Introduzione

Dal primo isolamento di cellule staminali mesenchimali (MSC) dalla gelatina di Wharton (WJ) nel 1991, queste cellule staminali multipotenti hanno guadagnato un'attenzione significativa da parte dei ricercatori grazie alle loro proprietà rigenerative^{e alla capacità} di differenziazione multilineage. Le MSC possono essere isolate da varie fonti, tra cui il midollo osseo, il sangue periferico, la polpa dentale, il tessuto adiposo, il feto (aborto umano) e i tessuti correlati alla nascita². Il cordone ombelicale (UC) è emerso come un serbatoio promettente grazie alla sua natura non invasiva, all'abbondante resa cellulare e alla capacità di differenziazione, mostrando un alto tasso di proliferazione, potenziale di differenziazione e proprietà di modulazione immunitaria³. Le MSC fetali mostrano una forte staminalità e proprietà immunitarie, che le rendono l'obiettivo principale degli studi clinici e della ricerca di base condotti negli ultimi due decenni ^2,4,5. Le MSC derivate dalla CU hanno un potenziale terapeutico superiore rispetto ad altre fonti di MSC, come il midollo osseo o il tessuto adiposo ^6,7.

La CU è composta da epitelio amniotico, tre vasi (due arterie e una vena) e la sostanza gelatinosa nota come WJ³. Curiosamente, la CU costituisce una semplice vascolarizzazione, costituita solo dall'endotelio e dal mesotelio, ma non dalla tunica avventizia; il WJ non contiene linfa o nervi⁸. L'UC presenta una struttura unica ideale per la separazione segmentale. Le UC-MSC si trovano principalmente nel WJ. Le MSC potrebbero essere isolate da diversi compartimenti del WJ, tra cui l'amnio, il subamnio (l'amnio e il subamnio designati anche come regione di rivestimento del cordone) e l'area perivascolare del WJ⁸. Ogni regione del WJ ha la propria struttura, caratteristiche immunoistochimiche e funzione ^3,6.

Le MSC isolate dal WJ della UC sono ampiamente considerate aventi un'utilità clinica superiore rispetto a quelle di altre regioni³. Le WJ-MSC sono state ampiamente studiate in contesti preclinici e clinici per il trattamento di varie malattie grazie al loro potenziale di differenziazione multilinea, alle proprietà immunomodulatorie, agli effetti paracrini, agli effetti antinfiammatori e alle proprietà immuno-privilegiate ^2,3. Le WJ-MSC hanno dimostrato di essere promettenti nel trattamento di una serie di malattie, tra cui la malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD), il rigetto del trapianto, il morbo di Crohn, le malattie autoimmuni e le malattie cardiovascolari 9,10,11,12,13,14. Poiché la domanda clinica di WJ-MSC continua ad aumentare, la carenza di offerta di cordoni ombelicali è attualmente un ostacolo alla loro diffusione delle applicazioni.

La resa delle WJ-MSC dipende dal metodo utilizzato per l'estrazione cellulare¹⁵. Mentre le WJ-MSC possono essere isolate attraverso la coltura di espianti o la digestione enzimatica, quest'ultimo metodo ha un tempo di propagazione più lungo che può aumentare il rischio di danno cellulare e diminuire la vitalità cellulare¹⁶. Tuttavia, numerosi studi hanno dimostrato che il metodo della coltura di espiantazione aumenta la resa e la vitalità delle cellule e che anche i fattori paracrini rilasciati dai tessuti di espiantazione aiutano a promuovere la proliferazione cellulare^17,18.

Questo studio ha applicato un approccio di dissezione unico per ottenere WJ interi, producendo MSC con maggiore capacità proliferativa, vitalità e quantità, riducendo al minimo i danni al WJ. Questo metodo innovativo offre una strategia semplificata per l'isolamento delle WJ-MSC, rispondendo alle esigenze critiche nelle applicazioni MSC.

Protocollo

I campioni sono stati ottenuti da donatori sani e consenzienti dell'ospedale per la maternità e l'assistenza sanitaria infantile del distretto di Shenzhen Longgang, Guangdong, Cina. L'uso di campioni umani per lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale di Shenzhen, dall'Università di Medicina Cinese di Pechino (SZLDH2020LSYM-095) e dal Comitato Etico Medico dell'Ospedale per la Maternità e l'Assistenza Sanitaria Infantile del Distretto di Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida approvate. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta del cordone ombelicale umano

1. Ottenere campioni di cordone ombelicale umano dall'ospedale cooperativo in condizioni sterili.
   NOTA: Scegli un donatore di età inferiore ai 35 anni, preferibilmente una primipara, senza storia di epatite, malattie sessualmente trasmissibili o disturbi genetici. I risultati dell'esame di ammissione per il virus dell'epatite B, il virus dell'epatite C e il citomegalovirus devono essere negativi. Scegli il taglio cesareo come modalità di parto.
2. Seleziona un pezzo dritto e intatto di UC di circa 10-15 cm di lunghezza.
3. Chiudere entrambe le estremità con una pinza emostatica e legare con nodi chirurgici all'estremità interna tra le pinze subito dopo il parto di un neonato a termine con taglio cesareo. (UC raccolto come mostrato nella Figura 1, passaggio 1).
   NOTA: L'operazione del taglio cesareo garantisce che la raccolta sia sterile. Utilizzare nodi chirurgici di sutura di dimensione 0 o 2-0 per una migliore resistenza alla trazione.
4. Tagliare il cordone ombelicale legato tra la pinza e i nodi usando le forbici chirurgiche (Figura 1, passaggio 1).
5. Sciacquarlo con una soluzione salina per rimuovere eventuali coaguli di sangue contaminanti sulla superficie e trasferirlo prontamente in una provetta di plastica sterile da 50 ml contenente 20 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
   NOTA: Durante il trasferimento non è stato utilizzato alcun antibiotico.
6. Sigillare il tubo. Metterlo sul ghiaccio in una scatola di polistirolo e conservarlo a 4 °C prima di trasportarlo in laboratorio.
   NOTA: Sezionare il cavo entro 4 ore dalla raccolta.

2. Isolamento della gelatina di Wharton dal cordone ombelicale

1. Elaborare il cordone ombelicale seguendo i passaggi seguenti:
   1. Preparare un vassoio sterilizzato con strumenti chirurgici, piastre da 90 mm confezionate in modo asettico, pipette da 1000 μl, PBS sterile, soluzione di etanolo al 75% e terreno di coltura MSC umano privo di xeno.
      NOTA: Le pinze dentate e i morsetti antizanzare consentono di trattare in modo efficiente il cavo strisciante.
   2. Decontaminare la superficie e la zona di lavoro necessari prima di posizionare gli articoli all'interno della cappa di biosicurezza.
      NOTA: Lasciare che l'aria della zona di lavoro sfiati per alcuni minuti prima di iniziare il lavoro.
   3. Disinfettare la superficie della provetta e rimuovere il campione in una capsula di Petri nella cabina di biosicurezza. Immergere il campione con i nodi in etanolo al 75% per 30 s e poi risciacquarlo più volte con PBS sterile in una nuova capsula di Petri.
      NOTA: Il cavo deve essere legato prima di immergerlo in etanolo al 75% e il tempo di immersione deve essere limitato da 30 s a 1 minuto per disinfettare completamente il cavo senza danni.
   4. Tagliare i nodi e tagliare il cordoncino tra due nodi trasversalmente in pezzi corti di circa 2 cm di lunghezza con forbici chirurgiche e pinze.
      NOTA: Le estremità del cavo con nodi devono essere smaltite. La lunghezza dell'UC non dovrebbe essere né troppo lunga né troppo corta; Entrambe le condizioni possono aumentare la difficoltà dell'operazione.
   5. Perfondere la vena (recipiente più grande) con PBS utilizzando pipette da 1000 μl fino a quando il fluido che esce dall'altra estremità del cordone diventa completamente trasparente¹⁹.
2. Sezionare il cordone ombelicale.
   1. Trasferire uno dei pezzi già tagliati in una nuova capsula di Petri.
      NOTA: Due arterie e una vena devono essere esposte visibilmente sulla sezione trasversale⁸ (Figura 2B).
   2. Aggiungere la quantità appropriata di PBS per mantenere il cavo bagnato durante l'operazione.
   3. Afferrare il cavo con una pinza ed estrarre le arterie lungo il suo asse maggiore con l'aiuto di pinze per zanzare.
      NOTA: Provare a tirare dall'altra estremità del cavo se l'arteria è stata strappata, poiché la parete dell'arteria ha una grande elasticità.
   4. Fissare il cordino orizzontalmente con il lato più spesso rivolto verso l'alto inserendo una lama della pinza nella vena ombelicale e poi serrando saldamente, assicurandosi che la pinza si blocchi sul lato più spesso.
   5. Praticare un'incisione lineare sullo strato di epitelio amniotico da un'estremità all'altra lungo il bordo dell'altra lama della pinza utilizzando un bisturi (Figura 3).
      NOTA: Preserva l'integrità della gelatina di Wharton tagliando il meno WJ possibile.
   6. Inizia da un angolo della fessura di taglio. Sollevare l'angolo dell'epitelio amniotico con pinze dentate e continuare a tagliare orizzontalmente un po' di più con le forbici corneali lungo la superficie interna dell'epitelio.
      1. Separare la gelatina di Wharton e l'epitelio amniotico con le pinze ed espandere gradualmente l'intero cerchio di un'estremità della colite ulcerosa. Staccare lo strato epiteliale nel senso della lunghezza (Figura 3).
         NOTA: La gelatina di Wharton è un tessuto connettivo mucoso racchiuso dall'epitelio amniotico denso⁸. L'intera operazione dovrebbe essere regolare, ma le pinze per zanzare potrebbero essere utilizzate per la dissezione smussata se si incontrano difficoltà durante il peeling.
   7. Inserire entrambe le lame della pinza all'interno della vena, bloccare una parte di WJ e quindi capovolgerla per esporre l'epitelio della vena ombelicale (Figura 3).
   8. Staccare facilmente l'epitelio della vena, poiché la tensione interna crea una separazione tra l'epitelio della vena e il WJ perivascolare (Figura 3).
3. Sezionare la UC utilizzando il metodo convenzionale per il confronto²⁰.
   1. Scegli un altro campione già tagliato di quasi lo stesso peso del cordone precedente e trasferiscilo in una nuova capsula di Petri.
   2. Tagliare longitudinalmente lungo la vena ombelicale con le forbici e allargare la UC per esporre i vasi e WJ.
   3. Rimuovere la vena ombelicale e due arterie e rimuovere il WJ dallo strato endoteliale con forbici e bisturi.

3. Isolamento e cultura delle UC-MSC

1. Metti il WJ raccolto in una piastra di Petri da 90 mm pre-etichettata e taglialo in pezzi di 1-3 mm con forbici e pinze.
2. Capovolgere la capsula con il tappo sul fondo e metterla in un'incubatrice al 5% di CO₂ a 37 °C per 30 minuti per rafforzare l'attaccamento tra i pezzi e la superficie in plastica.
3. Capovolgere il piatto e aggiungere delicatamente una quantità appropriata di terreno di coltura MSC umano per un'ulteriore coltura.
   NOTA: Utilizzare la velocità più bassa per assicurarsi che i pezzi siano ancora attaccati.
4. Cambiare il terreno di coltura MSC umano ogni 3 giorni. Scambiare due terzi del terreno e osservare la comparsa di crescita di cellule fibrose ogni 2 giorni nei primi 7 giorni, cambiare l'intero terreno e osservarlo su base giornaliera in seguito.
   NOTA: Evitare di spostare la capsula di Petri per i primi 7 giorni. La distinta crescita di cellule simili a fibroblasti è stata osservata in circa 4 giorni.
5. La sottocultura fino alla confluenza raggiunge l'80%.
   NOTA: Questo passaggio richiede 7-10 giorni.
   1. Preriscaldare il terreno di coltura di PBS, tripsina allo 0,25% e MSC umano privo di xeno a 37 °C in un bagno d'acqua.
   2. Sciacquare con PBS dopo aver aspirato il surnatante con le pipette e staccare le cellule con tripsina preriscaldata allo 0,25% fino a quando le cellule possono essere rimosse picchiettando la capsula di Petri.
   3. Inattivare la tripsina mescolando il terreno di coltura MSC preriscaldato in un rapporto di 4:1, raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
      NOTA: Queste celle sono considerate passaggio 0 (P0).
   4. Scartare il surnatante con una pipetta, risospendere le cellule nel terreno di coltura di MSC umano e inoculare in nuove piastre di Petri a una densità di semina di 1x10⁴ cellule/cm² per la propagazione.
6. Utilizzando un emocitometro, contare il numero totale di cellule dei due metodi dopo l'amplificazione al primo, secondo e terzo passaggio. Determinare la morfologia cellulare al microscopio nel primo, terzo e quinto passaggio.
   NOTA: La morfologia di queste cellule dovrebbe essere simile alle cellule P0.
7. Utilizzare le cellule al quinto passaggio per la citometria a flusso e altri esperimenti.

4. Espressione di marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso

1. Staccare 5 celle di passaggio (P5) con tripsina allo 0,25%, lavare le cellule con un tampone di colorazione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere i pellet con il tampone di colorazione delle celle a 100 μl ciascuno.
2. Etichettare ogni provetta e aggiungere le quantità appropriate di anticorpi, che sono stati coniugati con alloficocianina (APC), isotiocianato di fluoresceina (FITC) o ficoeritrina (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE seguendo le istruzioni del produttore²¹. Incubare per 15-20 minuti al buio a temperatura ambiente.
3. Centrifugare le cellule colorate a 300 x g per 5 minuti a 4 °C, aspirare il surnatante con una pipetta e lavare una volta con un tampone di colorazione cellulare.
4. Ripetere la centrifugazione e la risospensione delle cellule con 300 μl del tampone di colorazione cellulare.
5. Far passare le cellule attraverso il citometro a flusso e analizzare le cellule colorate con anticorpi secondo le istruzioni del produttore.

5. Determinazione della curva di crescita cellulare con il metodo del conteggio cellulare

1. Preparare una sospensione unicellulare di cellule P5 utilizzando due metodi, diluendole in un terreno di coltura di MSC umano.
2. Semina 8.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti, con un totale di 21 pozzetti di ciascun metodo da seminare.
   NOTA: Mescolare delicatamente le cellule soffiando e aspirando con pipette prima della semina.
3. Raccogliere le cellule da tre pozzetti dopo 24 ore di semina. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro per calcolare il valore medio.
   NOTA: Agitare la piastra prima del conteggio delle cellule. La durata dell'agitazione può essere prolungata per prevenire la formazione di aggregati cellulari.
4. Ripetere il conteggio delle celle ogni 24 ore per una durata totale di 7 giorni. Tracciare una curva di crescita utilizzando il tempo (d) sull'asse X e la conta delle cellule (x10⁴/mL) sull'asse Y.

Risultati

Le procedure per la raccolta e la coltura delle UC-MSC, nonché la loro successiva analisi, sono riassunte nella Figura 1. L'UC è stata accuratamente sezionata in diverse sezioni utilizzando il metodo unico; lo schema di funzionamento specifico delle principali procedure è illustrato in Figura 2. La crescita delle cellule dalle colture di espianti è stata monitorata e registrata di routine. Le cellule aderenti a forma di fuso sono state osservate circa 4 gior...

Discussione

Le MSC rappresentano un'area di ricerca dinamica con profonde implicazioni per la medicina rigenerativa²². Le loro proprietà uniche li rendono un punto focale per l'indagine scientifica e hanno il potenziale per rivoluzionare il trattamento di un'ampia gamma di malattie e lesioni⁷. Le WJ-MSC sono un sottogruppo distinto di MSC, che possono essere ottenute dal tessuto connettivo gelatinoso all'interno della CU situato tra l'epitelio intervascolare e amniotico

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD44 Antibody	Biolegend	338806
24-well cell culture plates	Thermo Scientific	142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	Biolegend	344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400122
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50
Automatic Cell Counter	Countstar	FL-CD
BAMBANKER Cryopreservation Solution	Wako	302-14681
Cell Staining Buffer	Biolegend	420201
Centrifugal Machine	Eppendorf	5424R
Clean Bench	Shanghai ZhiCheng	C1112B
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
D-PBS	Solarbio	D1040
Electro- thermostatic Blast Oven	Shanghai JingHong	DHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody	Biolegend	323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	Biolegend	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400110
Flow Cytometry	Beckman	CytoFLEX
hemocytometer	Superior Marienfeld	640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)	Biolegend	421002
Inverted Biological Microscope	ZEISS	Axio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage Tank	Thermo Scientific	CY50935-70
Normal saline (NS)	Meilunbio	MA0083
PBS	Solarbio	P1032
PE anti-human CD11b Antibody	Biolegend	393112
PE anti-human CD19 Antibody	Biolegend	392506
PE anti-human CD34 Antibody	Biolegend	343606
PE anti-human CD45 Antibody	Biolegend	368510
PE anti-human HLA-DR Antibody	Biolegend	307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400214
Precision Electronic Balance	Satorius	PRACTUM313-1CN
Snowflake Ice Machine	ZIEGRA	ZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tube	Greniner	227270
Thermostatic Water Bath	Shanghai YiHeng	HWS12
Trypsin 1:250	Solarbio	T8150
UltraGRO-Advanced	Helios	HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification System	Milli-Q	Milli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture Medium	FUKOKU	T2011301