Umbilikal Kordon Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerin Yüksek Verim ve Düşük Hasarla İzolasyonu

Özet

Bu çalışma, Wharton jölesinin (WJ) bütünlüğünü korumak için benzersiz bir künt diseksiyon prosedürü sunar, bu da daha az hasarlı WJ ve hasat edilen mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) daha fazla miktarda ve canlılığı ile sonuçlanır. Yöntem, konvansiyonel keskin diseksiyon yöntemlerine kıyasla üstün verim ve proliferatif yetenek göstermektedir.

Özet

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), dikkate değer rejeneratif ve immünomodülatör özelliklere sahip multipotent hücrelerin bir popülasyonudur. Göbek kordonundan (UC) elde edilen Wharton jölesi (WJ), olağanüstü bir MSC kaynağı olarak biyomedikal alanda artan bir ilgi görmüştür. Bununla birlikte, sınırlı tedarik ve mevcut yöntemlerde standardizasyon eksikliği gibi zorluklar ortaya çıkmıştır. Bu makale, göbek kordonundan sağlam WJ'yi diseke ederek MSC verimini artırmak için yeni bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, epitel tabakasını çıkarmak için künt diseksiyon kullanır, tüm WJ'nin bütünlüğünü korur ve hasat edilen MSC'lerin miktarının ve canlılığının artmasına neden olur. Bu yaklaşım, geleneksel keskin diseksiyon yöntemlerine kıyasla WJ israfını önemli ölçüde azaltır. WJ-MSC'lerin saflığını sağlamak ve dış hücresel etkiyi en aza indirmek için, UC'yi çevirdikten sonra endotelyumu soymak için iç gerilimi kullanan bir prosedür gerçekleştirildi. Ek olarak, Petri kabı, bağlanmayı ve hücre büyümesini iyileştirmek için eksplant kültürü sırasında kısa bir süre için ters çevrildi. Karşılaştırmalı analiz, önerilen yöntemin üstünlüğünü gösterdi ve geleneksel yöntemlere göre daha iyi uygulanabilirliğe sahip daha yüksek bir WJ ve WJ-MSC verimi gösterdi. Her iki yöntemde de hücre yüzeyi belirteçlerinin benzer morfolojisi ve ekspresyon modeli, çeşitli uygulamalar için karakterizasyonlarını ve saflıklarını doğrular. Bu yöntem, WJ-MSC izolasyonu için yüksek verimli ve yüksek uygulanabilirlik yaklaşımı sağlar ve MSC'lerin klinik uygulaması için büyük bir potansiyel gösterir.

Giriş

Mezenkimal Kök Hücrelerin (MSC'ler) 1991 yılında Wharton jölesinden (WJ) ilk izolasyonundan bu yana, bu multipotent kök hücreler, rejeneratif özellikleri ve çok soylu farklılaşma kapasiteleri nedeniyle araştırmacılardan büyük ilgi görmüştür¹. MSC'ler kemik iliği, periferik kan, diş pulpası, yağ dokusu, fetal (insan kürtajı) ve doğumla ilgili dokular dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan izole edilebilir². Göbek kordonu (ÜK), non-invaziv doğası, bol hücre verimi ve farklılaşma kapasitesi, yüksek oranda proliferasyon, farklılaşma potansiyeli ve bağışıklık modülasyon özellikleri sergilemesi nedeniyle umut verici bir rezervuar olarak ortaya çıkmıştır³. Fetal MSC'ler güçlü gövde ve bağışıklık özellikleri sergiler, bu da onları son yirmi yılda yürütülen klinik çalışmaların ve temel araştırmaların birincil odak noktası haline getirir ^2,4,5. UC'den türetilmiş MSC'ler, kemik iliği veya yağ dokusu gibi diğer MSC kaynaklarına kıyasla üstün terapötik potansiyele sahiptir ^6,7.

UC, amniyotik epitel, üç damar (iki arter ve bir ven) ve WJ³ olarak bilinen jelatinimsi maddeden oluşur. Şaşırtıcı bir şekilde, UC, yalnızca endotel ve mezotelyumdan oluşan, ancak tunika adventitia'dan oluşmayan basit bir damar sistemi oluşturur; WJ lenf veya sinir içermez⁸. UC, segmental ayırma için ideal olan benzersiz bir yapı sunar. UC-MSC'ler öncelikle WJ'de bulunur. MSC'ler, amniyon, subamniyon (amniyon ve subamnyon aynı zamanda kordon astar bölgesi olarak da adlandırılır) ve WJ^8'in perivasküler alanı dahil olmak üzere WJ'nin farklı bölmelerinden izole edilebilir. WJ'nin her bölgesinin kendi yapısı, immünohistokimyasal özellikleri ve işlevi^{vardır 3,6}.

UC'nin WJ'sinden izole edilen MSC'lerin, diğer bölgelerden gelenlere kıyasla üstün klinik faydaya sahip olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir³. WJ-MSC'ler, çok hatlı farklılaşma potansiyelleri, immünomodülatör özellikleri, parakrin etkileri, anti-inflamatuar etkileri ve bağışıklık ayrıcalıklı özellikleri nedeniyle çeşitli hastalıkların tedavisi için klinik öncesi ve klinik ortamlarda kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ^2,3. WJ-MSC'lerin graft-versus-host hastalığı (GvHD), greft reddi, Crohn hastalığı, otoimmün hastalıklar ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere bir dizi hastalığın tedavisinde umut vaat ettiği kanıtlanmıştır 9,10,11,12,13,14. WJ-MSC'lere yönelik klinik talep artmaya devam ettikçe, göbek kordonlarının arzının yetersizliği şu anda yaygın uygulamalarının önünde bir engel teşkil etmektedir.

WJ-MSC'lerin verimi, hücre ekstraksiyonu için kullanılan yönteme^{bağlıdır 15}. WJ-MSC'ler eksplant kültürü veya enzim sindirimi yoluyla izole edilebilirken, ikinci yöntem, hücre hasarı riskini artırabilecek ve hücre canlılığını azaltabilecek daha uzun bir yayılma süresine sahiptir¹⁶. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, eksplant kültür yönteminin hücre verimini ve canlılığını artırdığını ve eksplant dokularından salınan parakrin faktörlerin de hücre proliferasyonunu desteklemeye yardımcı olduğunu göstermiştir^17,18.

Bu çalışma, tüm WJ'yi elde etmek için benzersiz bir diseksiyon yaklaşımı uyguladı ve WJ'ye verilen zararı en aza indirirken, gelişmiş proliferatif kapasite, canlılık ve miktara sahip MSC'ler verdi. Bu yenilikçi yöntem, MSC uygulamalarındaki kritik ihtiyaçları ele alarak WJ-MSC'leri izole etmek için kolaylaştırılmış bir strateji sunar.

Protokol

Örnekler, Çin'in Guangdong kentindeki Shenzhen Longgang Bölgesi Doğum ve Çocuk Sağlığı Hastanesi'nden rıza gösteren, sağlıklı bağışçılardan alındı. Çalışma için insan örneklerinin kullanımı, Shenzhen Hastanesi Etik Kurulu, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi (SZLDH2020LSYM-095) ve Shenzhen Longgang Bölgesi Doğum ve Çocuk Sağlığı Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi (LGFYYXLLS-2020-005) tarafından onaylandı. Tüm deneyler onaylanmış yönergelere göre yapılmıştır. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. İnsan göbek kordonunun toplanması

1. Kooperatif hastanesinden steril koşullar altında insan göbek kordonu örnekleri alın.
   NOT: 35 yaşın altında, tercihen bir primipara, hepatit, cinsel yolla bulaşan hastalıklar veya genetik bozukluk öyküsü olmayan bir donör seçin. Hepatit B virüsü, hepatit C virüsü ve sitomegalovirüs için başvuru muayene sonuçlarının negatif olması gerekir. Doğum şekli olarak sezaryen doğumu seçin.
2. Yaklaşık 10-15 cm uzunluğunda düz ve sağlam bir UC parçası seçin.
3. Her iki ucu da hemostatik forseps ile kapatın ve sezaryen ile tam süreli bir yenidoğanın doğumundan hemen sonra forsepsler arasındaki iç uçta cerrahi düğümlerle bağlayın. ( Şekil 1, adım 1'de gösterildiği gibi toplanan UC).
   NOT: Sezaryen ameliyatı, koleksiyonun steril olmasını sağlar. Daha iyi gerilme mukavemeti için 0 veya 2-0 sütür boyutunda cerrahi düğümler kullanın.
4. Forseps ve düğümler arasındaki bağlı göbek kordonunu cerrahi makas kullanarak kesin (Şekil 1, adım 1).
5. Yüzeydeki kirletici kan pıhtılarını gidermek için tuzlu su çözeltisi ile durulayın ve derhal 20 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril 50 mL plastik tüpe aktarın.
   NOT: Transfer sırasında herhangi bir antibiyotik kullanılmamıştır.
6. Tüpü kapatın. Polistiren bir kutuda buzun üzerine koyun ve laboratuvara taşımadan önce 4 °C'de saklayın.
   NOT: Kabloyu aldıktan sonra 4 saat içinde inceleyin.

2. Wharton jölesinin göbek kordonundan izolasyonu

1. Aşağıdaki adımları izleyerek göbek kordonunu işleyin:
   1. Cerrahi aletler, aseptik olarak paketlenmiş 90 mm'lik tabaklar, 1000 μL pipetler, steril PBS, %75 etanol çözeltisi ve kseno içermeyen insan MSC kültür ortamı içeren sterilize bir tepsi hazırlayın.
      NOT: Dişli forseps ve sivrisinek kelepçeleri, kayan kordonun verimli bir şekilde ele alınmasına izin verir.
   2. Biyogüvenlik kabinine yerleştirmeden önce gerekli öğeleri ve çalışma alanını yüzey dekontamine edin.
      NOT: Çalışmaya başlamadan önce çalışma bölgesi havasının birkaç dakika boşalmasına izin verin.
   3. Tüpün yüzeyini dezenfekte edin ve numuneyi biyogüvenlik kabinindeki bir Petri kabına çıkarın. Numuneyi düğümlü olarak 30 saniye boyunca %75 etanole daldırın ve ardından yeni bir Petri kabında steril PBS ile birkaç kez durulayın.
      NOT: %75 etanole daldırılmadan önce kablo bağlanmalı ve kablonun zarar görmeden tamamen dezenfekte edilmesi için daldırma süresi 30 s ila 1 dakika ile sınırlandırılmalıdır.
   4. Düğümleri kesin ve iki düğüm arasındaki kordonu cerrahi makas ve forseps ile enlemesine yaklaşık 2 cm uzunluğunda kısa parçalar halinde kesin.
      NOT: Kablonun düğümlü uçları atılmalıdır. UC'nin uzunluğu çok uzun veya çok kısa olmamalıdır; Her iki durum da operasyonun zorluğunu artırabilir.
   5. Kordonun diğer ucundan çıkan sıvı tamamen şeffaf hale gelene kadar 1000 μL'lik pipetler kullanarak damarı (daha büyük damar) PBS ile perfüze edin¹⁹.
2. Göbek kordonunu inceleyin.
   1. Önceden kesilmiş parçalardan birini yeni bir Petri kabına aktarın.
      NOT: Kesit^8'de iki arter ve bir ven görünür şekilde açığa çıkarılmalıdır (Şekil 2B).
   2. İşlem boyunca kabloyu ıslak tutmak için uygun miktarda PBS ekleyin.
   3. Kordonu forseps ile kavrayın ve sivrisinek kıskaçları yardımıyla ana ekseni boyunca arterleri dışarı çekin.
      NOT: Arter yırtılmışsa, arter duvarı büyük bir esnekliğe sahip olduğundan, kordonun diğer ucundan çekmeye çalışın.
   4. Forsepsin bir bıçağını göbek damarına sokarak ve ardından sıkıca sıkıştırarak kordonu daha kalın tarafı yukarı bakacak şekilde yatay olarak sabitleyin, forsepsin daha kalın tarafa kenetlendiğinden emin olun.
   5. Bir neşter kullanarak forsepsin diğer bıçağının kenarı boyunca amniyotik epitel tabakası üzerinde bir uçtan diğer uca doğrusal bir kesi yapın (Şekil 3).
      NOT: Mümkün olduğunca az WJ keserek Wharton jölesinin bütünlüğünü koruyun.
   6. Kesme boşluğunun bir köşesinden başlayın. Amniyotik epitelin köşesini dişli kelepçelerle kaldırın ve epitelin iç yüzeyi boyunca kornea makasıyla yatay olarak biraz daha kesmeye devam edin.
      1. Wharton'un jölesini ve amniyotik epitelini kelepçelerle ayırın ve yavaş yavaş UC'nin bir ucunun tüm çemberine genişletin. Epitel tabakasını uzunlamasına soyun (Şekil 3).
         NOT: Wharton jölesi, yoğun amniyotik epitel⁸ ile çevrili bir mukoza bağ dokusudur. Tüm işlem düzgün olmalıdır, ancak soyulma sırasında zorluklarla karşılaşılırsa künt diseksiyon için sivrisinek kelepçeleri kullanılabilir.
   7. Forsepsin her iki bıçağını da damarın içine yerleştirin, WJ'nin bir kısmını sıkıştırın ve ardından göbek damarının epitelini ortaya çıkarmak için ters çevirin (Şekil 3).
   8. İç gerilim damar epiteli ile perivasküler WJ arasında bir ayrım oluşturduğundan, damarın epitelini kolayca soyun (Şekil 3).
3. Karşılaştırma için geleneksel yöntemi kullanarak UC'yi inceleyin²⁰.
   1. Önceki kordonla neredeyse aynı ağırlıkta önceden kesilmiş başka bir numune seçin ve yeni bir Petri kabına aktarın.
   2. Göbek damarı boyunca makasla uzunlamasına kesin ve damarları ve WJ'yi ortaya çıkarmak için UC'yi yayın.
   3. Göbek damarını ve iki arteri çıkarın ve WJ'yi makas ve neşter ile endotel tabakasından çıkarın.

3. UC-MSC'lerin izolasyonu ve kültürü

1. Toplanan WJ'yi önceden etiketlenmiş 90 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve makas ve forseps ile 1-3 mm'lik parçalar halinde kesin.
2. Altta kapak olacak şekilde çanağı ters çevirin ve parçalar ile plastik yüzey arasındaki bağlantıyı güçlendirmek için 37 °C'de 30 dakika boyunca %5 CO₂ inkübatöre yerleştirin.
3. Çanağı ters çevirin ve daha fazla kültür için nazikçe uygun miktarda insan MSC kültür ortamı ekleyin.
   NOT: Parçaların hala takılı olduğundan emin olmak için en düşük hızı kullanın.
4. İnsan MSC kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin. Ortamın üçte ikisini değiştirin ve ilk 7 günde bir her 2 günde bir fibröz hücrelerin büyümesinin görünümünü gözlemleyin, tam ortamı değiştirin ve daha sonra günlük olarak gözlemleyin.
   NOT: İlk 7 gün boyunca Petri kabını hareket ettirmekten kaçının. Fibroblast benzeri hücrelerin belirgin büyümesi yaklaşık 4 gün içinde gözlendi.
5. Birleşme% 80'e ulaşana kadar alt kültür.
   NOT: Bu adım 7-10 gün sürer.
   1. PBS,% 0.25 tripsin ve kseno içermeyen insan MSC kültür ortamını bir su banyosunda 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
   2. Süpernatanı pipetlerle aspire ettikten sonra PBS ile durulayın ve hücreler Petri kabına dokunarak yerinden çıkana kadar hücreleri önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin ile ayırın.
   3. Önceden ısıtılmış MSC kültür ortamını 4:1 oranında karıştırarak tripsini inaktive edin, hücre süspansiyonunu toplayın ve 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Bu hücreler geçiş 0 (P0) olarak kabul edilir.
   4. Süpernatantı bir pipetle atın, hücreleri insan MSC kültür ortamında yeniden süspanse edin ve çoğaltma için 1x10⁴ hücre /^cm2 tohumlama yoğunluğunda yeni Petri kaplarına aşılayın.
6. Bir hemositometre kullanarak, birinci, ikinci ve üçüncü geçişte amplifikasyondan sonra iki yöntemin toplam hücre sayısını sayın. Birinci, üçüncü ve beşinci pasajlarda mikroskop altında hücre morfolojisini belirleyin.
   NOT: Bu hücrelerin morfolojisi P0 hücrelerine benzer olmalıdır.
7. Akış sitometrisi ve diğer deneyler için beşinci geçitteki hücreleri kullanın.

4. Akış sitometrisi ile hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonu

1. Geçiş 5 (P5) hücrelerini% 0.25 tripsin ile ayırın, hücreleri hücre boyama tamponu ile yıkayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Peletleri hücre boyama tamponu ile her biri 100 μL'ye kadar yeniden süspanse edin.
2. Her tüpü etiketleyin ve Allofikosiyanin (APC), floresein izotiyosiyanat (FITC) veya fikoeritrin (PE) ile konjuge edilmiş uygun miktarlarda antikor ekleyin: CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE üreticinin talimatlarını izleyerek²¹. Karanlıkta oda sıcaklığında 15-20 dakika inkübe edin.
3. Lekeli hücreleri 300 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı bir pipetle aspire edin ve hücre boyama tamponu ile bir kez yıkayın.
4. Hücrelerin santrifüjlenmesini ve yeniden süspansiyonunu 300 μL hücre boyama tamponu ile tekrarlayın.
5. Hücreleri akış sitometresinden geçirin ve antikor lekeli hücreleri üreticinin talimatlarına göre analiz edin.

5. Hücre sayımı yöntemi ile hücre büyüme eğrisinin belirlenmesi

1. Bir insan MSC kültür ortamında seyrelterek iki yöntem kullanarak tek hücreli bir P5 hücresi süspansiyonu hazırlayın.
2. 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 8.000 hücre tohumlayın ve her yöntemden toplam 21 kuyu tohumlanır.
   NOT: Tohumlamadan önce hücreleri pipetlerle üfleyerek ve emerek nazikçe karıştırın.
3. 24 saatlik tohumlamadan sonra hücreleri üç kuyudan hasat edin. Ortalama değeri hesaplamak için bir hemositometre kullanarak hücre sayımı yapın.
   NOT: Hücre sayımından önce plakayı sallayın. Hücre agregatlarının oluşumunu önlemek için çalkalama süresi uzatılabilir.
4. Toplam 7 gün boyunca her 24 saatte bir hücre sayımını tekrarlayın. X ekseninde zaman (d) ve Y ekseninde hücre sayısı (x10⁴/mL) kullanarak bir büyüme eğrisi çizin.

Sonuçlar

UC-MSC'lerin toplanması ve kültürlenmesine ilişkin prosedürler ve bunların müteakip analizleri Şekil 1'de özetlenmiştir. UC, benzersiz yöntem kullanılarak düzgün bir şekilde birkaç bölüme ayrıldı; ana prosedürlerin spesifik çalışma şeması Şekil 2'de gösterilmektedir. Eksplant kültürlerinden elde edilen hücrelerin büyümesi rutin olarak izlendi ve kaydedildi. Yapışık iğ şeklindeki hücreler, eksplantların kültürlenmesinden ...

Tartışmalar

MSC'ler, rejeneratif tıp için derin etkileri olan dinamik bir araştırma alanını temsil etmektedir²². Eşsiz özellikleri, onları bilimsel araştırmalar için bir odak noktası haline getirir ve çok çeşitli hastalık ve yaralanmaların tedavisinde devrim yaratma potansiyeline sahiptir⁷. WJ-MSC'ler, intervasküler ve amniyotik epitel²³ arasında yer alan UC içindeki jelatinimsi bağ dokusundan elde edilebilen MSC'lerin farklı bir alt küme...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD44 Antibody	Biolegend	338806
24-well cell culture plates	Thermo Scientific	142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	Biolegend	344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400122
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50
Automatic Cell Counter	Countstar	FL-CD
BAMBANKER Cryopreservation Solution	Wako	302-14681
Cell Staining Buffer	Biolegend	420201
Centrifugal Machine	Eppendorf	5424R
Clean Bench	Shanghai ZhiCheng	C1112B
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
D-PBS	Solarbio	D1040
Electro- thermostatic Blast Oven	Shanghai JingHong	DHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody	Biolegend	323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	Biolegend	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400110
Flow Cytometry	Beckman	CytoFLEX
hemocytometer	Superior Marienfeld	640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)	Biolegend	421002
Inverted Biological Microscope	ZEISS	Axio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage Tank	Thermo Scientific	CY50935-70
Normal saline (NS)	Meilunbio	MA0083
PBS	Solarbio	P1032
PE anti-human CD11b Antibody	Biolegend	393112
PE anti-human CD19 Antibody	Biolegend	392506
PE anti-human CD34 Antibody	Biolegend	343606
PE anti-human CD45 Antibody	Biolegend	368510
PE anti-human HLA-DR Antibody	Biolegend	307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400214
Precision Electronic Balance	Satorius	PRACTUM313-1CN
Snowflake Ice Machine	ZIEGRA	ZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tube	Greniner	227270
Thermostatic Water Bath	Shanghai YiHeng	HWS12
Trypsin 1:250	Solarbio	T8150
UltraGRO-Advanced	Helios	HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification System	Milli-Q	Milli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture Medium	FUKOKU	T2011301