Выделение мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины, с высоким выходом и низким уровнем повреждения

Резюме

В этом исследовании представлена уникальная процедура тупого препарирования для сохранения целостности желе Уортона (WJ), что приводит к меньшему повреждению WJ и большему количеству и жизнеспособности собранных мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Метод демонстрирует превосходный выход и пролиферативную способность по сравнению с обычными методами острого рассечения.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой популяцию мультипотентных клеток с замечательными регенеративными и иммуномодулирующими свойствами. Желе Уортона (WJ) из пуповины (ЯК) вызывает все больший интерес в биомедицинской области как выдающийся источник МСК. Тем не менее, возникли такие проблемы, как ограниченное предложение и отсутствие стандартизации в существующих методах. В данной статье представлен новый метод повышения выхода МСК путем отсечения неповрежденного МСК от пуповины. Метод использует тупое рассечение для удаления эпителиального слоя, сохраняя целостность всего МСК и приводя к увеличению количества и жизнеспособности собранных МСК. Такой подход значительно снижает отходы WJ по сравнению с обычными методами острого рассечения. Чтобы обеспечить чистоту WJ-MSC и свести к минимуму внешнее клеточное воздействие, была проведена процедура с использованием внутреннего натяжения для отслаивания эндотелия после переворачивания ЯК. Кроме того, чашка Петри была перевернута на короткое время во время культивирования эксплантов для улучшения прикрепления и роста клеток. Сравнительный анализ продемонстрировал превосходство предложенного метода, показав более высокий выход WJ и WJ-MSC с лучшей жизнеспособностью по сравнению с традиционными методами. Сходная морфология и характер экспрессии маркеров клеточной поверхности в обоих методах подтверждают их характерность и чистоту для различных применений. Этот метод обеспечивает высокопродуктивный и высокожизнеспособный подход к выделению WJ-MSC, демонстрируя большой потенциал для клинического применения МСК.

Введение

С момента первого выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из желе Уортона (WJ) в 1991 году, эти мультипотентные стволовые клетки привлекли значительное внимание исследователей благодаря своим регенеративным свойствам^{и способности к} многолинейной дифференцировке. МСК могут быть выделены из различных источников, включая костный мозг, периферическую кровь, пульпу зубов, жировую ткань, ткани плода (аборт человека) и ткани, связанные с рождением². Пуповина (ЯК) стала многообещающим резервуаром благодаря своей неинвазивной природе, обильному выходу клеток и способности к дифференцировке, демонстрируя высокую скорость пролиферации, потенциал дифференцировки и свойства иммунной модуляции³. МСК плода обладают сильными стволовыми и иммунными свойствами, что делает их предметом клинических испытаний и фундаментальных исследований, проводимых в течение последних двух десятилетий ^2,4,5. МСК, полученные из ЯК, обладают превосходным терапевтическим потенциалом по сравнению с другими источниками МСК, такими как костный мозг или жировая ткань ^6,7.

ЯК состоит из амниотического эпителия, трех сосудов (двух артерий и одной вены) и студенистого вещества, известного как WJ³. Интересно, что ЯК представляет собой простую сосудистую сеть, состоящую только из эндотелия и мезотелия, но не из adventitia оболочки; WJ не содержит лимфы или нервов⁸. UC имеет уникальную структуру, идеально подходящую для сегментного разделения. UC-MSC в основном расположены в WJ. МСК могут быть выделены из различных компартментов WJ, включая амнион, субамнион (амнион и субамнион также обозначаются как область выстилки пуповины) и периваскулярную область WJ⁸. Каждый участок WJ имеет свою структуру, иммуногистохимические характеристики и функцию ^3,6.

МСК, выделенные из WJ ЯК, широко рассматриваются как обладающие более высокой клинической полезностью по сравнению с МСК из других регионов³. WJ-МСК широко изучались в доклинических и клинических условиях для лечения различных заболеваний благодаря их многолинейному дифференцировочному потенциалу, иммуномодулирующим свойствам, паракринным эффектам, противовоспалительным эффектам и иммунопривилегированным^{свойствам 2,3}. Было доказано, что WJ-MSC многообещающе подходят для лечения целого ряда заболеваний, включая реакцию «трансплантат против хозяина» (РТПХ), отторжение трансплантата, болезнь Крона, аутоиммунные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания 9,10,11,12,13,14. Поскольку клинический спрос на МСК-пуповины продолжает расти, дефицит предложения пуповины в настоящее время является препятствием для их широкого применения.

Выход WJ-МСК зависит от метода, используемого для клеточной экстракции¹⁵. В то время как WJ-МСК могут быть выделены с помощью культуры эксплантов или ферментного расщепления, последний метод имеет более длительное время распространения, что может увеличить риск повреждения клеток и снизить жизнеспособность клеток¹⁶. Тем не менее, многочисленные исследования показали, что метод культивирования эксплантов увеличивает выход и жизнеспособность клеток, и что паракринные факторы, высвобождаемые из тканей экспланта, также^{способствуют пролиферации клеток.}

В этом исследовании был применен уникальный подход к препарированию для получения целых WJ, в результате чего были получены МСК с повышенной пролиферативной способностью, жизнеспособностью и количеством, при этом минимизируя повреждение WJ. Этот инновационный метод предлагает оптимизированную стратегию изоляции WJ-MSC, удовлетворяя критические потребности в приложениях MSC.

протокол

Образцы были получены от здоровых доноров из Шэньчжэньской районной больницы матери и ребенка Лунган, провинция Гуандун, Китай. Использование человеческих образцов для исследования было одобрено Комитетом по этике больницы Шэньчжэня Пекинского университета китайской медицины (SZLDH2020LSYM-095) и Комитетом по медицинской этике Шэньчжэньской районной больницы матери и ребенка Лунган (LGFYYXLLS-2020-005). Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными методическими рекомендациями. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Забор пуповины человека

1. Получить образцы пуповины человека из больницы кооператива в стерильных условиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте донора в возрасте до 35 лет, предпочтительно первородящего, без гепатита, заболеваний, передающихся половым путем, или генетических нарушений. Результаты обследования при поступлении на вирус гепатита В, вирус гепатита С и цитомегаловирус должны быть отрицательными. Выберите кесарево сечение в качестве способа доставки.
2. Выберите прямой и неповрежденный кусок UC длиной примерно 10-15 см.
3. Закройте оба конца кровоостанавливающими щипцами и перевяжите хирургическими узлами на внутреннем конце между щипцами сразу после рождения доношенного новорожденного путем кесарева сечения. (собран ЯК, как показано на рисунке 1, шаг 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Операция кесарева сечения обеспечивает стерильность сбора. Используйте хирургические узлы размера 0 или 2-0 швов для лучшей прочности на разрыв.
4. Перережьте перевязанную пуповину между щипцами и узлами с помощью хирургических ножниц (рисунок 1, шаг 1).
5. Промойте его солевым раствором, чтобы удалить любые загрязняющие сгустки крови на поверхности, и немедленно переложите в стерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время переноса антибиотик не использовался.
6. Закройте трубку. Поместите его на лед в полистирольную коробку и храните при температуре 4 °C перед транспортировкой в лабораторию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассеките шнур в течение 4 часов после сбора.

2. Выделение студня Уортона из пуповины

1. Обработайте пуповину, выполнив следующие действия:
   1. Подготовьте стерилизованный лоток с хирургическими инструментами, асептически упакованные посуды 90 мм, пипетки объемом 1000 мкл, стерильный PBS, 75% раствор этанола и питательную среду для человека MSC, не содержащую ксено.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зубчатые щипцы и противомоскитные зажимы позволяют эффективно обрабатывать скользкий шнур.
   2. Обеззаражьте необходимые предметы и рабочую зону перед помещением предметов в шкаф биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте воздуху в рабочей зоне продуться в течение нескольких минут перед началом работы.
   3. Продезинфицируйте поверхность пробирки и переместите образец в чашку Петри в шкафу биобезопасности. Погрузите образец с узлами в 75% этанол на 30 с, а затем многократно промойте его стерильным PBS в новой чашке Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед погружением в 75% этанол шнур должен быть перевязан, а время погружения должно быть ограничено от 30 с до 1 минуты для полной дезинфекции шнура без повреждений.
   4. Отрежьте узлы и хирургическими ножницами и щипцами разрежьте шнур между двумя узлами поперечно на короткие кусочки длиной около 2 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концы шнура с узлами следует утилизировать. Длина UC не должна быть слишком длинной или слишком короткой; Оба условия могут увеличить сложность операции.
   5. Перфузируйте вену (более крупный сосуд) с помощью PBS с помощью пипеток объемом 1000 мкл до тех пор, пока жидкость, выходящая с другого конца каната, не станет полностью прозрачной¹⁹.
2. Рассеките пуповину.
   1. Переложите один из уже нарезанных кусочков в новую чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две артерии и одна вена должны быть видимы на поперечном сечении⁸ (Рисунок 2B).
   2. Добавьте соответствующее количество PBS, чтобы шнур оставался влажным на протяжении всей операции.
   3. Обхватите спинной мозг щипцами и вытяните артерии вдоль его главной оси с помощью противомоскитных зажимов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь тянуть с другого конца спинного мозга, если артерия была оторвана, так как стенка артерии обладает большой эластичностью.
   4. Зафиксируйте пуповину горизонтально более толстой стороной вверх, вставив одно лезвие щипцов в пупочную вену, а затем плотно зажав, обеспечив зажим щипцов на более толстой стороне.
   5. Сделайте линейный разрез на слое околоплодных вод от одного конца до другого по краю другого лезвия щипцов с помощью скальпеля (рисунок 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте целостность желе Уортона, обрезая как можно меньше WJ.
   6. Начните с одного угла режущего зазора. Приподнимите угол околоплодного эпителия зубчатыми зажимами и продолжайте резать горизонтально немного дальше роговичными ножницами по внутренней поверхности эпителия.
      1. Отделите желе Уортона и амниотический эпителий с помощью зажимов и постепенно расширяйте на весь круг одного конца ЯК. Снимите эпителиальный слой вдоль (рисунок 3).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Студень Уортона представляет собой слизистую соединительную ткань, окруженную плотным амниотическим^{эпителием8}. Вся операция должна быть гладкой, но при возникновении трудностей во время пилинга можно использовать противомоскитные зажимы для тупого вскрытия.
   7. Вставьте оба лезвия щипцов внутрь вены, зажмите порцию WJ, а затем выверните ее наизнанку, чтобы обнажить эпителий пупочной вены (рисунок 3).
   8. Отшелушивать эпителий вены легко, так как внутреннее напряжение создает разделение между эпителием вены и периваскулярным WJ (рис. 3).
3. Препарируйте ЯК с помощью традиционного метода сравнения²⁰.
   1. Выберите другой уже срезанный образец почти того же веса, что и предыдущий шнур и перенесите его в новую чашку Петри.
   2. Разрежьте вдоль пупочной вены продольно ножницами и раздвиньте ЯК, чтобы обнажить сосуды и ЖК.
   3. Удалите пупочную вену и две артерии, а также отрежьте WJ от эндотелиального слоя ножницами и скальпелем.

3. Выделение и культивирование ЯК-МСК

1. Поместите собранный WJ в заранее помеченную чашку Петри диаметром 90 мм и разрежьте ее на кусочки по 1-3 мм с помощью ножниц и щипцов.
2. Переверните чашку с крышкой на дне и поместите ее в инкубатор с 5%_CO2 при температуре 37 °C на 30 минут, чтобы укрепить крепление между частями и пластиковой поверхностью.
3. Переверните чашку и аккуратно добавьте соответствующее количество питательной среды для МСК для дальнейшего культивирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте самую низкую скорость, чтобы убедиться, что детали все еще прикреплены.
4. Меняйте питательную среду для человека каждые 3 дня. Замените две трети среды и наблюдайте за появлением вырастания фиброзных клеток каждые 2 дня в течение первых 7 дней, меняйте полную среду и наблюдайте за ней ежедневно в дальнейшем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перемещения чашки Петри в течение первых 7 дней. Выраженный рост фибробластоподобных клеток наблюдался примерно через 4 дня.
5. Субкультура до слияния достигает 80%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает 7-10 дней.
   1. Предварительно нагрейте PBS, 0,25% трипсина и культуру MSC человека, не содержащую ксеносов, до 37 °C на водяной бане.
   2. После отсасывания надосадочной жидкости с помощью пипеток промойте PBS и отделите клетки предварительно нагретым 0,25% трипсином до тех пор, пока клетки не смогут быть смещены постукиванием по чашке Петри.
   3. Инактивировать трипсин путем смешивания предварительно нагретой питательной среды МСК в соотношении 4:1, собрать клеточную суспензию и центрифугировать при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки считаются проходом 0 (P0).
   4. Надосадочную жидкость отбросить пипеткой, ресуспендировать клетки в культуральную среду МСК человека и инокулировать в новые чашки Петри с плотностью затравки 1х10⁴ клеток/^{см2 для размножения} .
6. С помощью гемоцитометра подсчитайте общее количество клеток двух методов после амплификации при первом, втором и третьем пассаже. Определите морфологию клетки под микроскопом в первом, третьем и пятом пассажах.
   Примечание: Морфология этих клеток должна быть схожа с клетками P0.
7. Используйте клетки на пятом проходе для проточной цитометрии и других экспериментов.

4. Экспрессия маркеров клеточной поверхности методом проточной цитометрии

1. Отделите 5 (P5) клеток с 0,25% трипсина, промойте клетки буфером для окрашивания клеток и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. Ресуспендируйте гранулы с буфером для окрашивания клеток до 100 мкл каждая.
2. Пометьте каждую пробирку и добавьте соответствующее количество антител, которые были конъюгированы с аллофикоцианином (APC), флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) или фикоэритрином (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE в соответствии с инструкциями производителя²¹. Выдерживать 15-20 мин в темноте при комнатной температуре.
3. Центрифугируйте окрашенные клетки при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C, отасканируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки и промойте один раз буфером для окрашивания клеток.
4. Повторите центрифугирование и ресуспендирование клеток с 300 мкл буфера для окрашивания клеток.
5. Пропустите клетки через проточный цитометр и проанализируйте окрашенные антителами клетки в соответствии с инструкциями производителя.

5. Определение кривой роста клеток методом подсчета клеток

1. Получить одноклеточную суспензию клеток Р5 двумя способами путем их разведения в культуральной среде МСК человека.
2. Засейте 8 000 клеток в лунку в 24-луночной пластине, всего засеивается 21 лунка каждого метода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед посевом аккуратно перемешайте ячейки, обдувая и отсасывая пипетками.
3. Соберите ячеек из трех лунок через 24 ч посева. Проведите подсчет клеток с помощью гемоцитометра, чтобы вычислить среднее значение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните планшет перед подсчетом клеток. Продолжительность встряхивания может быть увеличена, чтобы предотвратить образование клеточных агрегатов.
4. Повторяйте подсчет клеток каждые 24 часа в общей сложности в течение 7 дней. Постройте кривую роста с использованием времени (d) по оси X и количества клеток (x10⁴/мл) по оси Y.

Результаты

Процедуры сбора и культивирования UC-MSC, а также их последующий анализ обобщены на рисунке 1. UC был аккуратно разделен на несколько секций с помощью уникального метода; конкретная схема работы основных процедур проиллюстрирована на рисунке 2. Рост клеток и...

Обсуждение

МСК представляют собой динамичную область исследований с глубокими последствиями для регенеративной медицины²². Их уникальные свойства делают их центром научных исследований и обладают потенциалом для революции в лечении широкого спектра заболеваний и травм⁷

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD44 Antibody	Biolegend	338806
24-well cell culture plates	Thermo Scientific	142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	Biolegend	344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400122
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50
Automatic Cell Counter	Countstar	FL-CD
BAMBANKER Cryopreservation Solution	Wako	302-14681
Cell Staining Buffer	Biolegend	420201
Centrifugal Machine	Eppendorf	5424R
Clean Bench	Shanghai ZhiCheng	C1112B
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
D-PBS	Solarbio	D1040
Electro- thermostatic Blast Oven	Shanghai JingHong	DHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody	Biolegend	323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	Biolegend	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400110
Flow Cytometry	Beckman	CytoFLEX
hemocytometer	Superior Marienfeld	640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)	Biolegend	421002
Inverted Biological Microscope	ZEISS	Axio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage Tank	Thermo Scientific	CY50935-70
Normal saline (NS)	Meilunbio	MA0083
PBS	Solarbio	P1032
PE anti-human CD11b Antibody	Biolegend	393112
PE anti-human CD19 Antibody	Biolegend	392506
PE anti-human CD34 Antibody	Biolegend	343606
PE anti-human CD45 Antibody	Biolegend	368510
PE anti-human HLA-DR Antibody	Biolegend	307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400214
Precision Electronic Balance	Satorius	PRACTUM313-1CN
Snowflake Ice Machine	ZIEGRA	ZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tube	Greniner	227270
Thermostatic Water Bath	Shanghai YiHeng	HWS12
Trypsin 1:250	Solarbio	T8150
UltraGRO-Advanced	Helios	HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification System	Milli-Q	Milli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture Medium	FUKOKU	T2011301