Separación de las capas de folículo granuloso preovulatorio aviar y células de teca para aplicaciones posteriores

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para separar la yema, las células de la granulosa y las células de teca en folículos preovulatorios aviares. Este manejo de precisión permite investigaciones críticas sobre el papel de estas capas en la función reproductiva, lo que ayuda a comprender el desarrollo folicular, la regulación hormonal y la investigación de enfermedades para mejorar el rendimiento agrícola y los conocimientos biomédicos.

Resumen

Las gallinas ponedoras (gallinas ponedoras de huevos) y las reproductoras de pollos de engorde (reproductores de pollos) son cruciales para el suministro mundial de alimentos como fuente confiable de proteínas. También son un modelo animal emergente para el estudio de las enfermedades reproductivas humanas. A medida que se desarrolla el campo de la investigación avícola, la salud y la función del ovario de las gallinas ponedoras y los ovarios reproductores de pollos de engorde serán un punto de estudio importante para los investigadores agrícolas y biomédicos. Uno de los desafíos que presenta este interés emergente es la necesidad de técnicas replicables que todos los investigadores puedan emplear en la recolección de muestras ováricas. En particular, se debe establecer un proceso visual detallado para definir la separación adecuada de las capas especializadas de células de granulosa y teca de los folículos de gallina para lograr el acuerdo y la consistencia entre los investigadores.

Este estudio describe la extracción de folículos preovulatorios y tejido ovárico en gallinas leghorn blancas en edad reproductiva primaria. La separación de estos folículos se realiza en condiciones frías y líquidas para congelar la yema para facilitar la manipulación y evitar que el propio peso del folículo desgarre las capas celulares durante el proceso de separación. Una vez completada la separación, las capas celulares deseadas se pueden digerir aún más para los enfoques de cultivo de tejidos o se pueden criopreservar para análisis genómicos y proteómicos.

Introducción

Las gallinas productoras de huevos son un componente clave de la cadena mundial de suministro de alimentos y son un modelo animal en evolución para el estudio de la fertilidad y el cáncer de ovario. El pollo tiene una larga historia de uso en laboratorio, desde estudios in ovo de vacunas contra la influenza¹ hasta el estudio del crecimiento de tumores cancerosos², y es un animal clave para el conocimiento del desarrollo gonadal ^3,4,5. Comprender el papel del sistema reproductivo de una gallina, en particular, la naturaleza cíclica del desarrollo folicular ovárico y los tipos de células involucradas, es un área de gran interés y aplicación potencial. Los enfoques multiómicos para interrogar el ovario de la gallina tienen aplicaciones para aumentar el rendimiento agrícola a través del análisis de la productividad y dilucidar los factores para la salud humana a través de la gallina como modelo para las enfermedades reproductivas.

El ovario aviar tiene etapas foliculares de desarrollo muy distintas compuestas por (1) pequeños folículos primordiales y primarios (>1 mm), (2) folículos de prereclutamiento de tamaño variable (de color blanco a amarillo pálido, 2-8 mm) y (3) folículos preovulatorios grandes llenos de yema (amarillos) (Figura 1)^5,6,7. Un ovario aviar sexualmente maduro está compuesto por una corteza externa que alberga los folículos ováricos y la médula interna compuesta por músculo liso, nervios y vasculatura⁸. Todo el ciclo de desarrollo folicular tiene lugar en la corteza. Sin embargo, no es hasta aproximadamente los cinco meses de edad que solo el ovario izquierdo muestra una jerarquía de desarrollo completa de folículos preovulatorios (es decir, amarillos), y la gallina experimentará su primera ovulación y oviposición (puesta de huevos). Los folículos preovulatorios establecen una jerarquía macroscópicamente visible de aproximadamente 5 a 6 folículos que van desde el más grande y próximo a ovular (folículo F1) hasta el folículo menos desarrollado y más pequeño (F5 o F6). Los folículos preovulatorios se distinguen fácilmente de los folículos pre-reclutamiento más pequeños debido a su mayor tamaño, su vasta inervación y su yema de color amarillo intenso.

Todos los folículos contienen tipos de células especializadas que apoyan diversas funciones en la señalización, el crecimiento y el desarrollo del folículo a medida que avanza a través de diferentes etapas antes de la ovulación: estas son las células de la granulosa, las células de la teca y los ovocitos (gametos femeninos) (Figura 2A). En particular, las capas de células de la granulosa crean la pared interna del folículo, y las células de la teca forman la otra pared que rodea al ovocito. A medida que un folículo avanza a través de la jerarquía preovulatoria, las capas de células de la teca y la granulosa comienzan a adelgazarse, particularmente a lo largo de un punto directamente frente al tallo del folículo preovulatorio. El tallo es el punto de unión del folículo al ovario (Figura 2B). Esta línea de las capas de la granulosa y la teca opuestas al tallo se denomina estigma (Figura 2C). Carece por completo de vasculatura y será el punto de ruptura folicular durante la ovulación de un folículo F1. También es visible el disco germinal, o la capa blanca y esponjosa de células de soporte que rodean al ovocito (Figura 2B).

Tanto las células de la granulosa como las de la teca son componentes clave del desarrollo del folículo, ya que rodean y apoyan al ovocito a través de una compleja señalización hormonal. La capa celular de la granulosa apoya las vías esteroidogénicas a través de la señalización de AMP cíclico (cAMP) para provocar la producción de progesterona ^9,10,11. Las células de la teca, por otro lado, producen temporalmente estradiol, que es muy diferente al de los mamíferos, cuyas células de la teca producen andrógenos y progesterona 12,13,14. Junto con la señalización externa, las células de la granulosa y la teca son impulsores cruciales en la maduración y oviposición de los folículos. La técnica de separación de las capas de granulosa y teca fue reportada originalmente por Gilbert et al. en 1977¹⁵. Lograr una separación completa de las capas de granulosa y teca y asegurarse de que no quede material granuloso puede presentar dificultades con el método de Gilbert. Además, la ausencia de una guía visual clara para completar la separación puede hacer que la tarea sea difícil de realizar. Este estudio tiene como objetivo describir la extracción y separación de las capas de granulosa, teca y ovocitos de los folículos preovulatorios, ofreciendo adaptaciones y entregando una representación visual clara mediante el uso de imágenes y videos (Figura 3). La visualización de esta técnica permitirá a los científicos que estudian los folículos ováricos aviares capturar de forma reproducible las capas de granulosa y teca para enfoques multiómicos agrícolas y biomédicos.

Protocolo

Todos los animales utilizados en este estudio fueron mantenidos y sacrificados según el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Delaware (Protocolo 110R de la IACUC).

1. Preparación

1. Esterilización
   1. Tazones de vidrio de 5 oz en autoclave en autoclave por desplazamiento por gravedad (121 °C durante 20 min) cubiertos con papel de aluminio con cinta de autoclave encima para mantener e indicar la esterilidad.
      NOTA: Se necesitará un tazón para cada folículo en el que se realiza la separación.
   2. Herramientas de disección en autoclave mediante autoclave por desplazamiento por gravedad (121 °C durante 20 min), incluidas tijeras, pinzas curvas y pinzas rectas en bolsas de esterilización.
2. Configuración de la zona de separación
   1. Configure el área de separación de folículos como se ve en la Figura 4. Llene los recipientes de retención con hielo justo antes de la separación de los folículos y reponga según sea necesario durante todo el proceso de separación de los folículos.
3. Soluciones
   1. Diluir a 10x concentración de PBS a 1x material de trabajo y colocar en el refrigerador a +4 °C el día anterior a la disección.
   2. Diluya el isopropanol hasta una concentración de material de trabajo del 70% en la botella de spray.

2. Disección

1. Sacrificar a un ave hembra sexualmente madura.
   1. Elija un ave hembra sexualmente madura (debe estar poniendo huevos actualmente) y eutanasiar a¹⁶ mediante un método aprobado (Pautas AVMA) según el protocolo de cuidado y uso institucional, como la luxación cervical.
   2. Para la captura del folículo F1 más grande, eutanasiar al animal dentro de las primeras 4 horas de inicio de la luz durante el día. Palpar la parte inferior del abdomen antes de la eutanasia para confirmar la presencia de un óvulo de cáscara dura en el útero; Esto asegura que la oviposición y, por lo tanto, la próxima ovulación aún no se haya producido.
2. Acceder al ovario.
   1. Rocíe la carcasa externa y las plumas con isopropanol al 70%. Esto humedece las plumas y limpia el punto de incisión.
   2. Con unas tijeras de disección y una mano enguantada, pellizque y corte una sola incisión horizontal (transversal) en la línea media de aproximadamente 7,5 cm (3 pulgadas) de largo. Apriete las capas de piel, músculo y grasa antes de la incisión para evitar la punción de los órganos.
   3. Amplíe la incisión lateralmente en el lado derecho del ave y sondee con los dedos enguantados para empujar los órganos viscerales fuera del camino de las tijeras. Continúe hasta que 2-3 de las costillas del animal se hayan cortado en el lado derecho.
   4. Ensancha la incisión hacia el lado izquierdo del ave como se hace a la derecha. Proceda con mayor precaución ya que los folículos preovulatorios del ovario se encuentran aquí, sobresalen de la superficie del ovario y pueden romperse fácilmente. Use una presión suave con los dedos para mantener los folículos preovulatorios alejados de las tijeras, ya que se cortan 2-3 costillas en el lado izquierdo del ave.
   5. Coloque una mano en la parte inferior del abdomen del ave y la otra firmemente en la parte inferior del esternón, y retraiga manualmente el pecho del ave hacia arriba para permitir un mayor acceso a la cavidad celómica del ave.
   6. Sosteniendo cada uno de los muslos del ave cerca de la articulación del corvejón, empújelos manualmente hacia atrás para dislocar ambas articulaciones de la cadera simultáneamente. Ahora hay un acceso completo al ovario tanto visual como espacialmente.
3. Extirpar los folículos preovulatorios.
   1. Realice todos los pasos con la vista visual de rutina. Si una persona tiene problemas para visualizar en cualquier etapa, use un microscopio de disección.
   2. Usando solo los dedos enguantados, ahueque suavemente cada folículo preovulatorio amarillo visible y extráigalo del ovario. Solo pellizque el tallo durante la extracción para ayudar a cortar el tallo. No pellizque el folículo en sí, ya que podría romperse.
   3. Coloque cada folículo en el recipiente estéril con PBS helado.
   4. Deje los folículos preovulatorios en hielo durante al menos 5 minutos para permitir la congelación de la yema. La yema tibia se adherirá a las capas de células foliculares circundantes, lo que dificultará la realización de las técnicas de separación posteriores.

3. Separación en el laboratorio

1. Tome un folículo aislado del recipiente estéril y vuelva a colocar el recipiente con los folículos restantes en hielo. Estudiar el folículo antes de la manipulación, tomando nota de la ubicación de tres características: el tallo, el estigma y el disco germinal (Figura 2).
2. Comience por eliminar la serosa de la superficie folicular. Enrolle el folículo suavemente sobre una toalla de papel seca para eliminar la capa serosa, tirando suavemente de ella si es necesario.
3. Sostenga el folículo por el tallo sobre el recipiente lleno de PBS. Use la gravedad para visualizar dónde termina el tallo en la superficie del folículo y, con unas tijeras, corte solo el tallo sin perforar la superficie del folículo. Continúe con la eliminación de la serosa hasta que ya no sea visible.
4. Usando la caja de luz para iluminar y el disco germinal como referencia, reubique el estigma en el lado opuesto y sostenga suavemente el folículo con el lado del estigma visible. Sostenga el folículo directamente sobre el recipiente de PBS helado.
5. Tome el bisturí, corte suavemente a lo largo del estigma e inmediatamente deje caer el folículo en el PBS cuando la yema comience a caer. No sujetes el folículo con fuerza, ya que esto empujará la yema hacia afuera en lugar de permitir que simplemente se caiga por gravedad.
6. Con un par de pinzas de tejido rectas sin dientes, retire suavemente la capa rosada de la pared folicular de la yema en un lado de la rebanada. Complete esta extracción con pequeños movimientos de pellizco y tracción que levantan la pared del folículo lejos de la yema.
7. La separación de capas funciona mejor cuando aproximadamente 5 mm de tejido de la pared folicular se han retraído de la yema a la vez. Cuando una sección de 5 mm de la pared folicular se retrae con éxito de la yema, use pinzas en ángulo junto con las pinzas rectas para sondear a lo largo de la cubierta del folículo.
8. En algunos casos, la capa de granulosa puede estar más estrechamente asociada con la yema que la capa de teca. En esta situación, simplemente pruebe muy suavemente la superficie de la yema con cualquiera de los pares de pinzas para tratar de separar la capa similar al papel de seda de la yema. Una vez que se haya localizado la capa de granulosa, pellizque firmemente a la capa de teca y proceda a separar ambas capas de la yema como se describió anteriormente.
9. Use las pinzas curvas para cepillar ligeramente la yema lejos de las capas pellizcadas. Barre o retira el exceso de yema del tazón. No raspe la capa de granulosa; Esto causará desgarros. Los movimientos vigorosos nublarán la solución PBS y reducirán la visualización. Proceda con movimientos cuidadosos y deliberados.
10. Después de retraer cada sección de 5-10 mm de la pared folicular, haga una pausa para tomar las capas de teca y granulosa en cada juego de pinzas y asegúrese de que las dos capas se despeguen entre sí gradualmente, al igual que ambas se están pelando de la yema. Continúa este proceso alrededor de la parte exterior del folículo. Si la manipulación se vuelve difícil debido al solapamiento de la capa granulosa-teca, gire el folículo para comenzar el proceso desde el otro lado de la rebanada.
11. Durante el proceso de separación, se encontrará con el disco germinal (gameto femenino y vesícula germinal). Se trata de una zona extremadamente adherente tanto a la capa de granulosa como a la yema. Acérquese al disco germinal con cuidado, utilizando las pinzas rectas para sujetar firmemente la capa de granulosa a la capa de teca, ya que las pinzas curvas se utilizan con ligeros movimientos de cepillado para empujar el disco germinal lejos de las células de la granulosa hacia la superficie de la yema.
    1. Si desea el disco germinal como espécimen de investigación, cepille la yema en este punto con pinzas en ángulo y guárdelo como desee.
12. Continúe separando la yema de la pared folicular con las pinzas curvadas hasta que se le haya extraído toda la esfera del folículo.
13. Una vez que se haya cepillado el resto de la yema de las capas, separe la última porción de la capa de granulosa de la capa de teca. Es posible que la capa de granulosa completamente separada no esté completamente desprovista de materia vitelita, pero asegúrese de que no esté cubierta con ella. Coloque la capa de granulosa y la capa de calcio en recipientes separados con PBS a 4 °C de temperatura.
    1. Una vez que la capa de granulosa esté en un recipiente separado de la capa de teca, agite suavemente la capa de teca hacia adelante y hacia atrás en el PBS con pinzas para asegurarse de que se desprendan los restos restantes de la capa de granulosa.
       NOTA: Ciertos métodos de procesamiento posteriores a la separación pueden explicar la eliminación de residuos lipídicos por digestión o centrifugación, según el estudio deseado.
    2. Cuando practique esta técnica por primera vez, prepare y analice histológicamente las muestras separadas representativas para confirmar la separación y recolección precisas de las capas.
       1. Para hacer esto, fije porciones de tejidos separados en formol tamponado neutro usando casetes de tejido de malla o esponjas para evitar la pérdida de muestras, luego incruste en parafina, corte y tiña la sección con hematoxilina y eosina (H&E).
       2. Debido a su naturaleza delicada, manipule y coloque con cuidado la capa de granulosa en esponjas de biopsia en un casete histológico para asegurarse de que la capa celular permanezca intacta.
       3. Coloque la capa de teca directamente dentro de un casete histológico. Esto también permitirá visualizar el nivel de contaminación de la muestra por otro tejido folicular (es decir, una muestra de la capa de células de la granulosa con adherencia de la proteína de la yema o células tecales).
          NOTA: Es posible que no siempre sea posible obtener una sola capa de interés debido a la estrecha asociación de los tejidos foliculares. Sin embargo, conocer el nivel de posible contaminación puede servir de base para la interpretación de enfoques multiómicos posteriores.

Resultados

Este protocolo permite la separación de las capas de la granulosa y de las células tecales del folículo ovárico (Figura 5 y Figura 6). Estas capas se pueden preparar para el examen histológico para confirmar la separación exitosa. Estas imágenes histológicas, revisadas y capturadas por un patólogo veterinario (EMB) certificado, demuestran claramente la separación efectiva de las capas de granulosa y teca para los folí...

Discusión

Este estudio describe el procedimiento para la separación distintiva de las capas de células granulosas y tecales de los folículos preovulatorios en aves de corral. A diferencia del método existente establecido por Gilbert et al. en 1977, las adaptaciones realizadas en este método permiten un ambiente más controlado al separar manualmente la capa de células de la granulosa de la capa de teca de todos los folículos preovulatorios¹⁵. Además, permite a los i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 in. Small Glass Bowls, 5 oz	Amazon	B0BXP5PJTN	Autoclavable glass bowls of at least 3.5 in. diameter
Aluminum Foil	Costco	720	Cover autoclave bowls
Amazon Pet Training Pads, Regular, 100-Count	Amazon	B0B58WTPFS	For use as necrospy pads, any absorbant pad will work
Autoclave Tape	Fisherbrand	15-901-111
Cole-Parmer LED Fiber Optic Illuminators	Cole-Parmer	EW-41723-02
Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-123	Non-Serrated
Dissecting Microscope	Leica	S6E
Fine Precision Scissors	Fisherbrand	12-000-155	Non-Serrated
Food Container Boxes with Lid Set of 17 Clear/Green Microwave Freezer Dishwasher Safe	Amazon	B09QGZCRDB	Use any container that can hold ice AND an 3.5 in. small glass bowl
High Precision 45 Degree Curved Tapered Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-125	Non-Serrated
High Precision Straight Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	16-100-120	Non-Serrated
Isopropanol	Fisherbrand	A426P-4
McKesson Specimen Container, Sterile, Screw Cap, Leak-Resistant, 120 mL	McKesson	16-9526	4 oz. / 120 cc, graduated
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.6	ThermoFisher	J62692.K7	Will need to be made into 1x PBS
Spray Bottle	Cole-Parmer	EW-06091-01	For 70% Isopropanol
Sterile Surgical Blades #22	Cincinnati Surgical	122
Sterilization Pouches 10" x 16"	Amazon	B07MFB455C
Tapered Ultrafine Tip Forceps Fisherbrand	Fisherbrand	16-100-121	Non-Serrated
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisherbrand	22-038-221
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Chemical	SF98-4
Tissue processing/embedding cassettes with lid	Simport M490-2	Z672122