הפרדה של גרנולוזה של זקיקי קדם-ביוץ של עופות ושכבות תאי Theca ליישומים במורד הזרם

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להפרדת תאי חלמון, גרנולוזה ותאי תקה בזקיקי קדם-ביוץ של עופות. טיפול מדויק זה מאפשר חקירות קריטיות של תפקידן של שכבות אלה בתפקוד הרבייה, ומסייע להבנת התפתחות הזקיקים, ויסות הורמונלי וחקר מחלות לשיפור התפוקה החקלאית ותובנות ביו-רפואיות.

Abstract

תרנגולות שכבה (תרנגולות מטילות) ומגדלי פטם (מלאי רבייה לתרנגולות המייצרות בשר) חיוניים לאספקת המזון העולמית כמקור אמין לחלבון. הם גם מודל חי מתפתח לחקר מחלות רבייה אנושיות. ככל שתחום מחקר העופות מתפתח, הבריאות והתפקוד של תרנגולת השכבה והשחלה המגדלת יהיו נקודת מחקר חשובה עבור חוקרים חקלאיים וביו-רפואיים כאחד. אחד האתגרים שמציב עניין מתעורר זה הוא הצורך בטכניקות הניתנות לשכפול שכל החוקרים יכולים להשתמש בהן באיסוף דגימות שחלות. בפרט, יש לבסס תהליך חזותי מפורט כדי להגדיר את ההפרדה הנכונה של שכבות תאי הגרנולוזה והתקה המיוחדות מזקיקי התרנגולת כדי להשיג הסכמה ועקביות בין החוקרים.

מחקר זה מתאר מיצוי של זקיקים קדם-ביוץ ורקמת שחלה בתרנגולות לבנות בגיל הרבייה הראשון. ההפרדה של זקיקים אלה מתבצעת בתנאים קרים ונוזליים כדי לקרוס את החלמון למניפולציה קלה יותר וכדי למנוע ממשקל הזקיק עצמו לקרוע את שכבות התאים במהלך תהליך ההפרדה. לאחר השלמת ההפרדה, ניתן לעכל את שכבות התאים הרצויות לגישות תרבית רקמה או לשמר אותן בהקפאה לניתוחים גנומיים ופרוטאומיים.

Introduction

תרנגולות המייצרות ביצים הן מרכיב מרכזי בשרשרת אספקת המזון העולמית ומהוות מודל מתפתח של בעלי חיים לחקר פוריות וסרטן השחלות. לתרנגולת היסטוריה ארוכה של שימוש במעבדה, החל ממחקרי ביציות של חיסוני שפעת¹ ועד לחקר גידול גידול סרטני², והיא חיית מפתח לתובנה לגבי התפתחות בלוטות המין ^3,4,5. הבנת תפקידה של מערכת הרבייה של תרנגולת, בפרט, האופי המחזורי של התפתחות זקיקי השחלות וסוגי התאים המעורבים, היא תחום בעל עניין רב ויישום פוטנציאלי. לגישות מולטי-אומיקס לחקירת שחלת התרנגולת יש יישומים להגדלת היבול החקלאי באמצעות ניתוח פרודוקטיביות והבהרת גורמים לבריאות האדם באמצעות התרנגולת כמודל למחלות רבייה.

לשחלת העופות יש שלבי זקיקים התפתחותיים מובהקים מאוד המורכבים מ-(1) זקיקים ראשוניים וראשוניים קטנים (>1 מ"מ), (2) זקיקי טרום-גיוס בגודל משתנה (לבן עד צהוב בהיר, 2-8 מ"מ), ו-(3) זקיקי קדם-ביוץ גדולים מלאים בחלמון (צהוב) (איור 1)^5,6,7. שחלת עופות בוגרת מינית מורכבת מקליפת המוח החיצונית המאכלסת את זקיקי השחלות והמדולה הפנימית המורכבת משרירים חלקים, עצבים וכלי דם⁸. כל מחזור התפתחות הזקיקים מתרחש בקליפת המוח. עם זאת, רק בגיל חמישה חודשים בערך, רק השחלה השמאלית מדגימה היררכיה התפתחותית מלאה של זקיקים טרום ביוץ (כלומר, צהובים), והתרנגולת תעבור את הביוץ והביוץ הראשונים שלה (הטלת ביצים). הזקיקים הקדם-ביוציים יוצרים היררכיה גלויה של כ-5 עד 6 זקיקים הנעים בין הזקיק הגדול ביותר והבא לביוץ - זקיק F1 - לזקיק הקטן והמפותח פחות - F5 או F6. ניתן להבחין בקלות בין זקיקי טרום הביוץ לבין הזקיקים הקטנים יותר לפני הגיוס בשל גודלם הגדול יותר, העצבנות העצומה והחלמון הצהוב העמוק.

כל הזקיקים מכילים סוגי תאים מיוחדים התומכים בתפקידים מגוונים באיתות, גדילה והתפתחות של הזקיק כשהוא מתקדם בשלבים שונים לפני הביוץ - אלה הם תאי הגרנולוזה, תאי תקה וביציות (גמטות נקביות) (איור 2A). בפרט, שכבות תאי הגרנולוזה יוצרות את הדופן הפנימית של הזקיק, ותאי התקה יוצרים את הדופן השנייה המקיפה את הביצית. ככל שהזקיק מתקדם בהיררכיה הקדם-ביוצית, שכבות התאקה והגרנולוזה מתחילות להתדלדל, במיוחד לאורך נקודה ישירות מול הגבעול של הזקיק הקדם-ביוץ. הגבעול הוא נקודת החיבור של הזקיק לשחלה (איור 2B). הקו הזה של שכבות הגרנולוזה והתקה שמול הגבעול נקרא צלקת (איור 2C). הוא חסר לחלוטין כלי דם ויהיה הנקודה של קרע זקיקי במהלך הביוץ של זקיק F1. נראה גם דיסק הנבט, או השכבה הלבנה והרכה של תאי התמיכה שמקיפה את הביצית (איור 2B).

גם תאי גרנולוזה וגם תקה הם מרכיבי מפתח בהתפתחות הזקיקים מכיוון שהם מקיפים ותומכים בביצית באמצעות איתות הורמונלי מורכב. שכבת תאי הגרנולוזה תומכת במסלולים סטרואידוגניים באמצעות איתות AMP מחזורי (cAMP) כדי להביא לייצור פרוגסטרון ^9,10,11. תאי Theca, לעומת זאת, מייצרים באופן זמני אסטרדיול, השונה במידה רבה מאשר ביונקים שתאי Theca שלהם מייצרים אנדרוגן ופרוגסטרון 12,13,14. יחד עם איתות חיצוני, תאי הגרנולוזה והתקה הם מניעים מכריעים בהבשלת הזקיקים ובביוץ. הטכניקה של הפרדת שכבות הגרנולוזה והתקה דווחה לראשונה על ידי גילברט ואחרים בשנת 1977¹⁵. השגת הפרדה מקיפה של שכבות הגרנולוזה והתקה והבטחה שלא יישאר חומר גרנולוזה מאחור עלולה להוות קשיים בשיטת גילברט. יתר על כן, היעדר מדריך חזותי ברור להשלמת ההפרדה יכול להפוך את המשימה למאתגרת לביצוע. מחקר זה נועד לתאר את המיצוי וההפרדה של שכבות גרנולוזה, תקה וביציות מזקיקי קדם הביוץ, להציע התאמות ולספק ייצוג חזותי ברור באמצעות שימוש הן בתמונות והן בסרטונים (איור 3). הדמיה של טכניקה זו תאפשר למדענים החוקרים זקיקי שחלות של עופות ללכוד באופן שחזורי שכבות גרנולוזה ותקה עבור גישות מולטי-אומיקה חקלאיות וביו-רפואיות כאחד.

Protocol

כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה הוחזקו והורדמו על פי הפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דלאוור (IACUC Protocol 110R).

1. הכנה

1. עיקור
   1. חיטוי קערות זכוכית 5 אונקיות באמצעות חיטוי תזוזה של כוח הכבידה (121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) מכוסות בנייר אלומיניום עם סרט חיטוי מעל לשמירה וציון סטריליות.
      הערה: יהיה צורך בקערה אחת עבור כל זקיק שעליו מתבצעת ההפרדה.
   2. כלי חיטוי באמצעות חיטוי תזוזה של כוח הכבידה (121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות), כולל מספריים, מלקחיים מעוקלים ומלקחיים ישרים בשקיות עיקור.
2. הגדרת אזור ההפרדה
   1. הגדר אזור הפרדת זקיקים כפי שניתן לראות באיור 4. מלאו את מיכלי האחיזה בקרח ממש לפני הפרדת הזקיקים וחידשו לפי הצורך לאורך תהליך הפרדת הזקיקים.
3. פתרונות
   1. יש לדלל לריכוז PBS פי 10 ל-1x מלאי עבודה ולהניח במקרר +4 מעלות צלזיוס יום לפני החיתוך.
   2. יש לדלל איזופרופנול ל-70% ריכוז מלאי עבודה בבקבוק הריסוס.

2. נתיחה

1. המתת חסד של נקבת ציפור בוגרת מינית.
   1. בחר נקבת ציפור בוגרת מינית (חייבת להטיל ביצים כרגע) והמתת^{חסד 16} בשיטה מאושרת (הנחיות AVMA) בהתאם לפרוטוקול הטיפול והשימוש המוסדי, כגון פריקת צוואר הרחם.
   2. ללכידת זקיק F1 הגדול ביותר, המתת חסד של בעל החיים בתוך 4 השעות הראשונות להופעת האור למשך היום. למשש את הבטן התחתונה לפני המתת חסד כדי לאשר ביצה בעלת קליפה קשה ברחם; זה מבטיח שהביוץ ובכך הביוץ הבא עדיין לא התרחש.
2. גש לשחלה.
   1. מרססים את הפגר והנוצות החיצוניים ב-70% איזופרופנול. זה מרטיב את הנוצות ומנקה את נקודת החתך.
   2. בעזרת מספריים לדיסקציה ויד עטויה כפפה, צבטו וחתכו חתך קו אמצע אופקי (רוחבי) יחיד באורך של כ-7.5 ס"מ (3 אינץ'). צבטו את שכבות העור, השרירים והשומן כלפי מעלה לפני החתך כדי למנוע ניקוב של איברים.
   3. הרחב את החתך לרוחב בצד ימין של הציפור ובדוק בעזרת אצבעות כפפות כדי לדחוף את איברי הקרביים מדרך המספריים. ממשיכים עד ש-2-3 מצלעות החיה נחתכות בצד ימין.
   4. הרחב את החתך לכיוון הצד השמאלי של הציפור כפי שנעשה בצד ימין. המשך בזהירות נוספת מכיוון שהזקיקים הקדם-ביוציים של השחלה ממוקמים כאן, בולטים מעל פני השחלה ויכולים להיקרע בקלות. השתמש בלחץ עדין עם האצבעות כדי להרחיק את זקיקי הביוץ מהמספריים מכיוון ש-2-3 צלעות נחתכות בצד שמאל של הציפור.
   5. הניחו יד אחת על הבטן התחתונה של הציפור והשנייה בחוזקה על הצד התחתון של עצם החזה, ומשכו ידנית את חזה הציפור כלפי מעלה כדי לאפשר גישה נוספת לחלל הקולומי של הציפור.
   6. החזק כל אחת מירכי הציפור קרוב למפרק השוק, דחף אותן ידנית לאחור כדי לעקור את שני מפרקי הירך בו זמנית. כעת יש גישה מלאה לשחלה הן מבחינה ויזואלית והן מרחבית.
3. הסר זקיקים לפני הביוץ.
   1. בצע את כל השלבים על ידי ראייה חזותית שגרתית. אם אדם מתקשה לדמיין בכל שלב, השתמש במיקרוסקופ מנתח.
   2. בעזרת אצבעות עטויות כפפות בלבד, יש לכסות בעדינות כל זקיק טרום ביוץ צהוב גלוי ולהוציא אותו מהשחלה. צבט רק את הגבעול במהלך החילוץ כדי לסייע בניתוק הגבעול. אין לצבוט את הזקיק עצמו, אחרת הוא עלול להיקרע.
   3. הכניסו כל זקיק למיכל הסטרילי עם PBS קר כקרח.
   4. השאירו זקיקים לפני הביוץ על הקרח למשך 5 דקות לפחות כדי לאפשר התגבשות של החלמון. החלמון החם יידבק לשכבות התאים הזקיקים שמסביב, מה שיקשה על ביצוע טכניקות ההפרדה הבאות.

3. הפרדה במעבדה

1. קח זקיק מבודד מהמיכל הסטרילי והנח את המיכל עם הזקיקים הנותרים בחזרה על קרח. חקרו את הזקיק לפני המניפולציה, תוך שימת לב למיקום של שלושה מאפיינים: הגבעול, הצלקת ודיסק הנבט (איור 2).
2. התחל בהסרת הסרוזה מהמשטח הזקיקי. גלגלו את הזקיק בעדינות על מגבת נייר יבשה כדי להסיר את שכבת הסרוזל, ומשכו אותה בעדינות במידת הצורך.
3. החזק את הזקיק ליד הגבעול מעל הקערה המלאה ב-PBS. השתמש בכוח הכבידה כדי לדמיין היכן הגבעול מסתיים על פני הזקיק, ובעזרת מספריים, גזור רק את הגבעול מבלי לנקב את פני הזקיק. המשך בהסרת הסרוזה עד שהיא כבר לא נראית.
4. השתמש בקופסת האור כדי להאיר ובדיסק הנבט כהפניה, העבר את הצלקת בצד הנגדי והחזק בעדינות את הזקיק כשצד הצלקת גלוי. החזק את הזקיק ישירות מעל קערת ה-PBS הקר כקרח.
5. מרימים את האזמל, פורסים בעדינות לאורך הצלקת, ומיד מפילים את הזקיק לתוך ה-PBS כשהחלמון מתחיל לנשור. אל תחזיק את הזקיק בחוזקה, מכיוון שזה ידחוף את החלמון החוצה במקום לאפשר לו פשוט ליפול החוצה דרך כוח הכבידה.
6. בעזרת זוג מלקחיים ישרים ללא שיניים, מקלפים בעדינות את השכבה הוורודה של דופן הזקיקים מהחלמון בצד אחד של הפרוסה. השלם את המיצוי הזה באמצעות תנועות צביטה ומשיכה קטנות שמרימות את דופן הזקיק הרחק מהחלמון.
7. הפרדת שכבות פועלת בצורה הטובה ביותר כאשר כ-5 מ"מ של רקמת דופן זקיקים נסוגה הרחק מהחלמון בכל פעם. כאשר קטע של 5 מ"מ מדופן הזקיקים נסוג בהצלחה מהחלמון, השתמש במלקחיים זוויתיים בד בבד עם המלקחיים הישרים כדי לחקור לאורך מעטפת הזקיק.
8. במקרים מסוימים, שכבת הגרנולוזה עשויה להיות קשורה יותר לחלמון מאשר לשכבת התקה. במצב זה, פשוט בדקו בעדינות רבה על פני החלמון באמצעות אחד מזוגות המלקחיים כדי לנסות למשוך את השכבה דמוית נייר הטישו הרחק מהחלמון. לאחר איתור שכבת הגרנולוזה, צבטו אותה היטב לשכבת התקה והמשיכו במשיכת שתי השכבות מהחלמון כפי שתואר קודם לכן.
9. השתמש במלקחיים המעוקלים כדי להבריש קלות את החלמון מהשכבות הצבוטות. טאטא או הסר עודפי חלמון מהקערה. אל תגרד את שכבת הגרנולוזה; זה יגרום לקריעה. תנועות נמרצות יעכירו את פתרון PBS ויפחיתו את ההדמיה. המשך בתנועות זהירות ומכוונות.
10. לאחר שכל קטע של 5-10 מ"מ של דופן זקיקים נסוג, עצרו כדי לקחת את שכבות התקה והגרנולוזה בכל סט מלקחיים ולוודא ששתי השכבות מתקלפות זו מזו בהדרגה, בדיוק כפי ששתיהן מתקלפות מהחלמון. המשך בתהליך זה סביב החלק החיצוני של הזקיק. אם המניפולציה הופכת קשה בגלל דש שכבת הגרנולוזה-טקה, סובב את הזקיק כדי להתחיל את התהליך מהצד השני של הפרוסה.
11. בתהליך ההפרדה ייתקל בדיסק הנבט (גמט נקבה ושלפוחית נבט). זהו אזור שדבק מאוד הן בשכבת הגרנולוזה והן בחלמון. התקרב בזהירות לדיסק הנבט, השתמש במלקחיים הישרים כדי להחזיק בחוזקה את שכבת הגרנולוזה לשכבת התקה, שכן המלקחיים המעוקלים משמשים בתנועות צחצוח קלות כדי לדחוף את דיסק הנבט הרחק מתאי הגרנולוזה אל פני החלמון.
    1. אם הדיסק הנבט רצוי כדגימת מחקר, יש להבריש את החלמון בשלב זה עם מלקחיים זוויתיים ולאחסן כרצונך.
12. המשיכו להפריד את החלמון מדופן הזקיקים בעזרת המלקחיים המעוקלים עד שכל כדור הזקיק הוסר מהחלמון שלו.
13. לאחר הברשה של שארית החלמון מהשכבות, הפרד את החלק האחרון של שכבת הגרנולוזה משכבת התקה. ייתכן ששכבת הגרנולוזה המופרדת במלואה אינה נטולת חומר חלמון לחלוטין, אך ודא שהיא אינה מצופה בו. מניחים את שכבת הגרנולוזה ואת שכבת ה-thecal במיכלים נפרדים עם PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    1. לאחר ששכבת הגרנולוזה נמצאת במיכל נפרד משכבת ה-theca, ערבבו בעדינות את שכבת ה-theca קדימה ואחורה ב-PBS בעזרת מלקחיים כדי להבטיח שכל שאריות שכבת הגרנולוזה יתנתקו.
       הערה: שיטות עיבוד מסוימות לאחר ההפרדה עשויות להסביר הסרת פסולת שומנים על ידי עיכול או צנטריפוגה, בהתאם למחקר הרצוי.
    2. כאשר מתרגלים לראשונה טכניקה זו, הכינו ונתחו דגימות מופרדות מייצגות מבחינה היסטולוגית כדי לאשר הפרדת שכבות ואיסוף מדויקים.
       1. לשם כך, תקן חלקים של רקמות מופרדות בפורמלין ניטרלי באמצעות קלטות רקמות רשת או ספוגים כדי למנוע אובדן דגימה, ולאחר מכן הטמע פרפין, חתך וצבוע את הקטע בהמטוקסילין ואאוזין (H&E).
       2. בשל אופיו העדין, יש לטפל בזהירות ולהניח את שכבת הגרנולוזה על ספוגי ביופסיה בקלטת היסטולוגית כדי להבטיח שהשכבה התאית תישאר שלמה.
       3. שים את שכבת ה-theca ישירות בתוך קלטת היסטולוגית. פעולה זו תאפשר גם הדמיה של רמת זיהום הדגימה על ידי רקמה זקיקית אחרת (כלומר, דגימת שכבת תאי גרנולוזה עם היצמדות לחלבון חלמון או תאים תקליים).
          הערה: לא תמיד ניתן להשיג רק שכבה אחת של עניין בשל הקשר ההדוק של רקמות זקיקים. עם זאת, ידיעת רמת הזיהום האפשרית יכולה ליידע את הפרשנות של גישות מולטי-אומיקס עוקבות.

תוצאות

פרוטוקול זה מניב הפרדה של שכבות גרנולוזה ותאי תקל מזקיק השחלה (איור 5 ואיור 6). לאחר מכן ניתן להכין את השכבות הללו לבדיקה היסטולוגית כדי לאשר הפרדה מוצלחת. תמונות היסטולוגיות אלה, שנבדקו ונלכדו על ידי פתולוג וטרינרי מוסמך (EMB), מדגימות בבירו?...

Discussion

מחקר זה מתאר את הנוהל להפרדה מובהקת של שכבות תאים גרנולוזה ותקליות מזקיקי קדם-ביוץ בעופות. בניגוד לשיטה הקיימת שנקבעה על ידי גילברט ואחרים בשנת 1977, ההתאמות שנעשו בשיטה זו מאפשרות סביבה מבוקרת יותר בעת הפרדה ידנית של שכבת תאי הגרנולוזה משכבת התקה מכל הזקיקים הקדם-ביוציים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 in. Small Glass Bowls, 5 oz	Amazon	B0BXP5PJTN	Autoclavable glass bowls of at least 3.5 in. diameter
Aluminum Foil	Costco	720	Cover autoclave bowls
Amazon Pet Training Pads, Regular, 100-Count	Amazon	B0B58WTPFS	For use as necrospy pads, any absorbant pad will work
Autoclave Tape	Fisherbrand	15-901-111
Cole-Parmer LED Fiber Optic Illuminators	Cole-Parmer	EW-41723-02
Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-123	Non-Serrated
Dissecting Microscope	Leica	S6E
Fine Precision Scissors	Fisherbrand	12-000-155	Non-Serrated
Food Container Boxes with Lid Set of 17 Clear/Green Microwave Freezer Dishwasher Safe	Amazon	B09QGZCRDB	Use any container that can hold ice AND an 3.5 in. small glass bowl
High Precision 45 Degree Curved Tapered Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-125	Non-Serrated
High Precision Straight Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	16-100-120	Non-Serrated
Isopropanol	Fisherbrand	A426P-4
McKesson Specimen Container, Sterile, Screw Cap, Leak-Resistant, 120 mL	McKesson	16-9526	4 oz. / 120 cc, graduated
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.6	ThermoFisher	J62692.K7	Will need to be made into 1x PBS
Spray Bottle	Cole-Parmer	EW-06091-01	For 70% Isopropanol
Sterile Surgical Blades #22	Cincinnati Surgical	122
Sterilization Pouches 10" x 16"	Amazon	B07MFB455C
Tapered Ultrafine Tip Forceps Fisherbrand	Fisherbrand	16-100-121	Non-Serrated
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisherbrand	22-038-221
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Chemical	SF98-4
Tissue processing/embedding cassettes with lid	Simport M490-2	Z672122