Separação de camadas de células do folículo pré-ovulatório da granulosa e da teca aviária para aplicações a jusante

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para separar células vitelinos, células da granulosa e teca em folículos pré-ovulatórios aviários. Esse manuseio preciso permite investigações críticas sobre o papel dessas camadas na função reprodutiva, auxiliando na compreensão do desenvolvimento folicular, regulação hormonal e pesquisa de doenças para melhorar o rendimento agrícola e insights biomédicos.

Resumo

Galinhas poedeiras (galinhas poedeiras) e matrizes (reprodutores de frangos produtores de carne) são cruciais para o suprimento mundial de alimentos como uma fonte confiável de proteína. Eles também são um modelo animal emergente para o estudo de doenças reprodutivas humanas. À medida que o campo da pesquisa avícola se desenvolve, a saúde e a função do ovário de galinhas poedeiras e matrizes de corte serão um importante ponto de estudo para pesquisadores agrícolas e biomédicos. Um dos desafios apresentados por esse interesse emergente é a necessidade de técnicas replicáveis que todos os pesquisadores possam empregar na coleta de espécimes ovarianos. Em particular, um processo visual detalhado deve ser estabelecido para definir a separação adequada das camadas especializadas da granulosa e das células da teca dos folículos de galinha para obter concordância e consistência entre os pesquisadores.

Este estudo descreve a extração de folículos pré-ovulatórios e tecido ovariano em galinhas leghorn brancas em idade reprodutiva precoce. A separação desses folículos é realizada em condições frias e líquidas para congelar a gema para facilitar a manipulação e evitar que o próprio peso do folículo rasgue as camadas celulares durante o processo de separação. Uma vez concluída a separação, as camadas celulares desejadas podem ser digeridas para abordagens de cultura de tecidos ou podem ser criopreservadas para análises genômicas e proteômicas.

Introdução

As galinhas produtoras de ovos são um componente-chave da cadeia mundial de abastecimento alimentar e são um modelo animal em evolução para o estudo da fertilidade e do câncer de ovário. A galinha tem uma longa história de uso em laboratório, desde estudos in ovo de vacinas contra influenza¹ até o estudo do crescimento de tumores cancerígenos², e é um animal chave para obter informações sobre o desenvolvimento gonadal ^3,4,5. Compreender o papel do sistema reprodutivo de uma galinha, em particular, a natureza cíclica do desenvolvimento folicular ovariano e os tipos de células envolvidas, é uma área de grande interesse e potencial aplicação. Abordagens multiômicas para interrogar o ovário de galinha têm aplicações para aumentar o rendimento agrícola por meio da análise de produtividade e elucidar fatores para a saúde humana por meio da galinha como modelo para doenças reprodutivas.

O ovário aviário tem estágios foliculares de desenvolvimento muito distintos, compostos por (1) pequenos folículos primordiais e primários (>1 mm), (2) folículos pré-recrutamento de tamanho variável (branco a amarelo pálido, 2-8 mm) e (3) folículos pré-ovulatórios grandes e cheios de gema (amarelo) (Figura 1) ^{5 , 6 , 7} . Um ovário aviário sexualmente maduro é composto por um córtex externo que abriga os folículos ovarianos e a medula interna composta por músculo liso, nervos e vasculatura⁸. Todo o ciclo de desenvolvimento folicular ocorre no córtex. Não é até aproximadamente cinco meses de idade, no entanto, que apenas o ovário esquerdo demonstra uma hierarquia de desenvolvimento completa de folículos pré-ovulatórios (ou seja, amarelos), e a galinha passará por sua primeira ovulação e oviposição (postura de ovos). Os folículos pré-ovulatórios estabelecem uma hierarquia grosseiramente visível de aproximadamente 5 a 6 folículos que variam do maior e próximo ao ovular - folículo F1 - ao folículo menor e menos desenvolvido - F5 ou F6. Os folículos pré-ovulatórios são facilmente distinguíveis dos folículos menores de pré-recrutamento devido ao seu tamanho maior, vasta inervação e gema amarela profunda.

Todos os folículos contêm tipos de células especializadas que suportam papéis variados na sinalização, crescimento e desenvolvimento do folículo à medida que ele progride em diferentes estágios antes da ovulação - são as células da granulosa, células da teca e oócitos (gametas femininos) (Figura 2A). Em particular, as camadas de células da granulosa criam a parede interna do folículo, e as células da teca formam a outra parede ao redor do oócito. À medida que um folículo progride através da hierarquia pré-ovulatória, as camadas de células da teca e da granulosa começam a diminuir, particularmente ao longo de um ponto diretamente em frente ao pedúnculo do folículo pré-ovulatório. O pedúnculo é o ponto de fixação do folículo ao ovário (Figura 2B). Essa linha das camadas da granulosa e da teca oposta ao pedúnculo é chamada de estigma (Figura 2C). Ele carece totalmente de vasculatura e será o ponto de ruptura folicular durante a ovulação de um folículo F1. Também é visível o disco germinativo, ou a camada branca fofa de células de suporte que circundam o oócito (Figura 2B).

As células da granulosa e da teca são componentes-chave do desenvolvimento do folículo, pois envolvem e sustentam o oócito por meio de sinalização hormonal complexa. A camada de células da granulosa suporta vias esteroidogênicas por meio da sinalização de AMP cíclico (cAMP) para provocar a produção de progesterona ^9,10,11. As células teca, por outro lado, produzem temporariamente estradiol, que é muito diferente do que em mamíferos cujas células tecais produzem andrógeno e progesterona 12,13,14. Juntamente com a sinalização externa, as células da granulosa e da teca são fatores cruciais na maturação e oviposição do folículo. A técnica de separação das camadas da granulosa e da teca foi originalmente relatada por Gilbert et al. em 1977¹⁵. Conseguir uma separação abrangente das camadas da granulosa e da teca e garantir que nenhum material da granulosa permaneça para trás pode apresentar dificuldades com o método de Gilbert. Além disso, a ausência de um guia visual claro para completar a separação pode tornar a tarefa difícil de realizar. Este estudo tem como objetivo descrever a extração e separação das camadas da granulosa, teca e oócito dos folículos pré-ovulatórios, oferecendo adaptações e proporcionando uma representação visual clara através do uso de imagens e vídeos (Figura 3). A visualização dessa técnica permitirá que os cientistas que estudam folículos ovarianos aviários capturem de forma reprodutível as camadas da granulosa e da teca para abordagens multiômicas agrícolas e biomédicas.

Protocolo

Todos os animais utilizados neste estudo foram mantidos e sacrificados de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Delaware (Protocolo IACUC 110R).

1. Preparação

1. Esterilização
   1. Autoclave tigelas de vidro de 5 onças usando autoclavagem por deslocamento por gravidade (121 °C por 20 min) cobertas com papel alumínio com fita de autoclave no topo para manter e indicar esterilidade.
      NOTA: Será necessária uma tigela para cada folículo em que a separação está sendo realizada.
   2. Ferramentas de dissecção em autoclave usando autoclavagem por deslocamento por gravidade (121 °C por 20 min), incluindo tesouras, pinças curvas e pinças retas em bolsas de esterilização.
2. Configuração da área de separação
   1. Configure a área de separação do folículo como visto na Figura 4. Encha os recipientes de armazenamento com gelo antes da separação do folículo e reabasteça conforme necessário durante todo o processo de separação do folículo.
3. Soluções
   1. Diluir para uma concentração de PBS de 10x para 1x o material de trabalho e colocar no frigorífico de +4 °C no dia anterior à dissecação.
   2. Dilua o isopropanol até 70% da concentração do material de trabalho no frasco de spray.

2. Dissecação

1. Eutanásia de uma ave fêmea sexualmente madura.
   1. Escolha uma ave fêmea sexualmente madura (deve estar botando ovos) e eutanasiar¹⁶ por método aprovado (Diretrizes AVMA) de acordo com o protocolo de cuidado e uso institucional, como luxação cervical.
   2. Para a captura do maior folículo F1, eutanasiar o animal nas primeiras 4 h de início de luz do dia. Palpar a parte inferior do abdômen antes da eutanásia para confirmar um ovo de casca dura no útero; Isso garante que a oviposição e, portanto, a próxima ovulação ainda não ocorreu.
2. Acesse o ovário.
   1. Pulverize a carcaça externa e as penas com 70% de isopropanol. Isso umedece as penas e limpa o ponto de incisão.
   2. Usando uma tesoura de dissecção e uma mão enluvada, aperte e corte uma única incisão horizontal (transversal) na linha média com aproximadamente 7,5 cm (3 polegadas) de comprimento. Aperte a pele, os músculos e as camadas de gordura antes da incisão para evitar a perfuração de órgãos.
   3. Alargue a incisão lateralmente no lado direito da ave e sonde com os dedos enluvados para empurrar os órgãos viscerais para fora do caminho da tesoura. Continue até que 2-3 das costelas do animal tenham sido cortadas do lado direito.
   4. Alargue a incisão em direção ao lado esquerdo do pássaro, como feito à direita. Proceda com cuidado adicional, pois os folículos pré-ovulatórios do ovário estão localizados aqui, projetam-se da superfície do ovário e podem se romper facilmente. Use uma leve pressão com os dedos para manter os folículos pré-ovulatórios longe da tesoura, pois 2-3 costelas são cortadas no lado esquerdo da ave.
   5. Coloque uma mão na parte inferior do abdômen da ave e a outra firmemente na parte inferior do esterno e retraia manualmente o peito da ave para cima para permitir mais acesso à cavidade celômica da ave.
   6. Segurando cada uma das coxas da ave perto da articulação do jarrete, empurre-as manualmente para trás para deslocar as duas articulações do quadril simultaneamente. Agora há acesso completo ao ovário, tanto visual quanto espacialmente.
3. Remova os folículos pré-ovulatórios.
   1. Execute todas as etapas pela visão visual de rotina. Se um indivíduo tiver problemas para visualizar em qualquer estágio, use um microscópio de dissecação.
   2. Usando apenas os dedos enluvados, coloque suavemente cada folículo pré-ovulatório amarelo visível e extraia-o do ovário. Apenas aperte o pedúnculo durante a extração para ajudar a cortar o pedúnculo. Não aperte o folículo em si, ou ele pode se romper.
   3. Coloque cada folículo no recipiente estéril com PBS gelado.
   4. Deixe os folículos pré-ovulatórios no gelo por pelo menos 5 minutos para permitir o congelamento da gema. A gema quente aderirá às camadas de células foliculares circundantes, dificultando a execução das técnicas de separação subsequentes.

3. Separação em laboratório

1. Retire um folículo isolado do recipiente estéril e coloque o recipiente com os folículos restantes de volta no gelo. Estude o folículo antes da manipulação, observando a localização de três características: o pedúnculo, o estigma e o disco germinativo (Figura 2).
2. Comece removendo a serosa da superfície folicular. Role o folículo suavemente sobre uma toalha de papel seca para remover a camada de serosa, puxando-a com cuidado, se necessário.
3. Segure o folículo pelo pedúnculo sobre a tigela cheia de PBS. Use a gravidade para visualizar onde o pedúnculo termina na superfície do folículo e, usando uma tesoura, corte apenas o pedúnculo sem perfurar a superfície do folículo. Continue com a remoção da serosa até que ela não seja mais visível.
4. Usando a caixa de luz para iluminar e o disco germinativo como referência, reposicione o estigma no lado oposto e segure suavemente o folículo com o lado do estigma visível. Segure o folículo diretamente sobre a tigela de PBS gelado.
5. Pegue o bisturi, corte suavemente ao longo do comprimento do estigma e imediatamente coloque o folículo no PBS quando a gema começar a cair. Não segure o folículo com força, pois isso empurrará a gema para fora em vez de permitir que ela simplesmente caia por gravidade.
6. Usando uma pinça de tecido reta e não dentada, retire suavemente a camada rosa da parede folicular da gema de um lado da fatia. Complete esta extração usando pequenos movimentos de pinça e puxão que levantam a parede do folículo para longe da gema.
7. A separação de camadas funciona melhor quando aproximadamente 5 mm de tecido da parede folicular foram retraídos para longe da gema de cada vez. Quando uma seção de 5 mm da parede folicular for retraída com sucesso da gema, use uma pinça angular em conjunto com a pinça reta para sondar ao longo da casca do folículo.
8. Em alguns casos, a camada da granulosa pode estar mais intimamente associada à gema do que à camada da teca. Nessa situação, simplesmente sonde muito suavemente a superfície da gema usando um par de pinças para tentar puxar a camada semelhante a papel de seda para longe da gema. Uma vez localizada a camada da granulosa, aperte-a firmemente na camada de teca e puxe as duas camadas para longe da gema, conforme descrito anteriormente.
9. Use a pinça curva para escovar levemente a gema das camadas comprimidas. Varra ou remova o excesso de gema da tigela. Não raspe a camada da granulosa; isso causará rasgos. Movimentos vigorosos obscurecerão a solução PBS e reduzirão a visualização. Prossiga com movimentos cuidadosos e deliberados.
10. Depois que cada seção de 5 a 10 mm da parede folicular for retraída, faça uma pausa para retirar as camadas de teca e granulosa em cada conjunto de pinças e certifique-se de que as duas camadas estejam sendo removidas uma da outra gradualmente, assim como ambas estão sendo removidas da gema. Continue este processo ao redor da parte externa do folículo. Se a manipulação se tornar difícil devido ao retalho da camada granulosa-teca, vire o folículo para iniciar o processo do outro lado da fatia.
11. Durante o processo de separação, o disco germinativo (gameta feminino e vesícula germinativa) será encontrado. Esta é uma área extremamente aderente tanto à camada da granulosa quanto à gema. Aproxime-se do disco germinativo com cuidado, usando a pinça reta para segurar firmemente a camada da granulosa na camada da teca, pois a pinça curva é usada em movimentos leves de escovação para empurrar o disco germinativo para longe das células da granulosa para a superfície da gema.
    1. Se o disco germinativo for desejado como espécime de pesquisa, retire a gema neste ponto com uma pinça angular e armazene conforme desejado.
12. Continue separando a gema da parede folicular com a pinça curva até que toda a esfera do folículo tenha sua gema removida.
13. Uma vez que o restante da gema tenha sido escovado das camadas, separe a última porção da camada da granulosa da camada de teca. A camada de granulosa totalmente separada pode não ser totalmente desprovida de matéria vitelina, mas certifique-se de que não esteja revestida com ela. Coloque a camada da granulosa e a camada tecal em recipientes separados com temperatura PBS de 4 °C.
    1. Uma vez que a camada da granulosa esteja em um recipiente separado da camada da teca, agite suavemente a camada da teca para frente e para trás no PBS com uma pinça para garantir que quaisquer remanescentes da camada da granulosa se desprendam.
       NOTA: Certos métodos de processamento pós-separação podem ser responsáveis pela remoção de detritos lipídicos por digestão ou centrifugação, dependendo do estudo desejado.
    2. Ao praticar esta técnica pela primeira vez, prepare e analise histologicamente espécimes separados representativos para confirmar a separação e coleta precisas da camada.
       1. Para fazer isso, fixe porções de tecidos separados em formalina tamponada neutra usando de tecido de malha ou esponjas para evitar a perda de amostras e, em seguida, embutir em parafina, seccionar e corar a seção com hematoxilina e eosina (H & E).
       2. Devido à sua natureza delicada, manuseie e coloque cuidadosamente a camada da granulosa nas esponjas de biópsia em um histológico para garantir que a camada celular permaneça intacta.
       3. Coloque a camada de teca diretamente dentro de um histológico. Isso também permitirá a visualização do nível de contaminação da amostra por outro tecido folicular (ou seja, amostra da camada de células da granulosa com aderência da proteína da gema ou células tecais).
          NOTA: Nem sempre é possível obter apenas uma única camada de interesse devido à estreita associação de tecidos foliculares. No entanto, conhecer o nível de possível contaminação pode informar a interpretação de abordagens multiômicas subsequentes.

Resultados

Este protocolo produz a separação das camadas de células da granulosa e da tecal do folículo ovariano (Figura 5 e Figura 6). Essas camadas podem então ser preparadas para exame histológico para confirmar a separação bem-sucedida. Essas imagens histológicas, revisadas e capturadas por um patologista veterinário certificado (EMB), demonstram claramente a separação eficaz das camadas da granulosa e da teca para os folí...

Discussão

Este estudo descreve o procedimento para a separação distinta das camadas de células da granulosa e da tecal dos folículos pré-ovulatórios em aves. Diferentemente do método existente estabelecido por Gilbert et al. em 1977, as adaptações feitas nesse método permitem um ambiente mais controlado ao separar manualmente a camada de células da granulosa da camada de teca de todos os folículos pré-ovulatórios¹⁵. Além disso, permite que os pesquisadores vi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 in. Small Glass Bowls, 5 oz	Amazon	B0BXP5PJTN	Autoclavable glass bowls of at least 3.5 in. diameter
Aluminum Foil	Costco	720	Cover autoclave bowls
Amazon Pet Training Pads, Regular, 100-Count	Amazon	B0B58WTPFS	For use as necrospy pads, any absorbant pad will work
Autoclave Tape	Fisherbrand	15-901-111
Cole-Parmer LED Fiber Optic Illuminators	Cole-Parmer	EW-41723-02
Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-123	Non-Serrated
Dissecting Microscope	Leica	S6E
Fine Precision Scissors	Fisherbrand	12-000-155	Non-Serrated
Food Container Boxes with Lid Set of 17 Clear/Green Microwave Freezer Dishwasher Safe	Amazon	B09QGZCRDB	Use any container that can hold ice AND an 3.5 in. small glass bowl
High Precision 45 Degree Curved Tapered Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-125	Non-Serrated
High Precision Straight Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	16-100-120	Non-Serrated
Isopropanol	Fisherbrand	A426P-4
McKesson Specimen Container, Sterile, Screw Cap, Leak-Resistant, 120 mL	McKesson	16-9526	4 oz. / 120 cc, graduated
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.6	ThermoFisher	J62692.K7	Will need to be made into 1x PBS
Spray Bottle	Cole-Parmer	EW-06091-01	For 70% Isopropanol
Sterile Surgical Blades #22	Cincinnati Surgical	122
Sterilization Pouches 10" x 16"	Amazon	B07MFB455C
Tapered Ultrafine Tip Forceps Fisherbrand	Fisherbrand	16-100-121	Non-Serrated
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisherbrand	22-038-221
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Chemical	SF98-4
Tissue processing/embedding cassettes with lid	Simport M490-2	Z672122