Отделение гранулез преовуляторного фолликула птиц и слоев клеток теки для последующего применения

Резюме

Здесь мы опишем протокол разделения желтка, гранулезных клеток и клеток теки в преовуляторных фолликулах птиц. Такая точность обработки позволяет проводить критические исследования роли этих слоев в репродуктивной функции, способствуя пониманию развития фолликулов, гормональной регуляции и исследований заболеваний для повышения урожайности в сельском хозяйстве и биомедицинских знаний.

Аннотация

Куры-несушки (куры-несушки) и родительские бройлеры (племенное поголовье для мясных кур) имеют решающее значение для мирового продовольственного снабжения как надежный источник белка. Они также являются новой животной моделью для изучения репродуктивных заболеваний человека. По мере развития области исследований в области птицеводства, здоровье и функция яичников кур-несушек и родительских стад бройлеров будут важным предметом изучения как для сельскохозяйственных, так и для биомедицинских исследователей. Одной из проблем, связанных с этим возникающим интересом, является потребность в воспроизводимых методах, которые все исследователи могут использовать при сборе образцов яичников. В частности, должен быть установлен детальный визуальный процесс для определения правильного отделения специализированных слоев гранулезы и клеток теки от куриных фолликулов для достижения согласия и согласованности среди исследователей.

В данном исследовании описывается экстракция преовуляторных фолликулов и ткани яичников у белых кур породы леггорн в расцвете репродуктивного возраста. Разделение этих фолликулов выполняется в холодных, жидких условиях, чтобы желток застыл для облегчения манипуляций и предотвращения разрыва клеточных слоев под собственным весом фолликула во время процесса разделения. После завершения разделения желаемые клеточные слои могут быть дополнительно расщеплены для подходов к культивированию тканей или могут быть криоконсервированы для геномного и протеомного анализов.

Введение

Куры, производящие яйца, являются ключевым компонентом мировой цепочки поставок продуктов питания и представляют собой развивающуюся животную модель для изучения фертильности и рака яичников. Курица имеет долгую историю лабораторного использования, от исследований вакцин против гриппаⁱⁿ ovo 1 до изучения роста раковых опухолей², и является ключевым животным для понимания развития гонад ^3,4,5. Понимание роли репродуктивной системы курицы, в частности, цикличности развития фолликулов яичников и типов участвующих в ней клеток, представляет большой интерес и имеет потенциальное применение. Мультиомиксные подходы к исследованию яичников курицы имеют приложения для повышения урожайности сельскохозяйственных культур за счет анализа продуктивности и выяснения факторов, влияющих на здоровье человека, с помощью курицы как модели репродуктивных заболеваний.

Птичий яичник имеет очень четко выраженные фолликулярные стадии развития, состоящие из (1) маленьких первичных и первичных фолликулов (>1 мм), (2) фолликулов различного размера (от белого до бледно-желтого, 2-8 мм) и (3) больших, заполненных желтком преовуляторных фолликулов (желтых) (Рисунок 1)^5,6,7. Половозрелый яичник птицы состоит из наружной коры, в которой находятся фолликулы яичников, и внутреннего мозгового вещества, состоящего из гладких мышц, нервов и сосудистой^сети. Весь цикл развития фолликулов происходит в коре головного мозга. Однако только в возрасте примерно пяти месяцев только левый яичник демонстрирует полную иерархию развития преовуляторных (т.е. желтых) фолликулов, и курица подвергается своей первой овуляции и яйцекладке (откладыванию яиц). Преовуляторные фолликулы образуют грубо видимую иерархию примерно из 5-6 фолликулов, которые варьируются от самого большого и близкого к овуляции фолликула F1 до менее развитого, самого маленького фолликула - F5 или F6. Преовуляторные фолликулы легко отличить от меньших фолликулов предварительного набора благодаря их большему размеру, обширной иннервации и темно-желтому желтку.

Все фолликулы содержат специализированные типы клеток, которые поддерживают различные роли в передаче сигналов, росте и развитии фолликула по мере его прохождения через различные стадии перед овуляцией - это гранулезные клетки, клетки теки и ооциты (женские гаметы) (рисунок 2A). В частности, слои гранулезных клеток образуют внутреннюю стенку фолликула, а клетки теки образуют другую стенку, окружающую ооцит. По мере того, как фолликул продвигается по преовуляторной иерархии, слои клеток теки и гранулезы начинают истончаться, особенно в точке, расположенной прямо напротив стебля преовуляторного фолликула. Стебель является точкой прикрепления фолликула к яичнику (рисунок 2B). Эта линия слоев гранулезы и теки напротив стебля называется рыльцем (рис. 2C). Он полностью лишен сосудистой сети и является точкой разрыва фолликула во время овуляции фолликула F1. Также виден зародышевый диск, или пушистый белый слой опорных клеток, окружающих ооцит (рисунок 2B).

Как гранулеза, так и клетки теки являются ключевыми компонентами развития фолликулов, поскольку они окружают и поддерживают ооцит с помощью сложной гормональной сигнализации. Слой гранулезных клеток поддерживает стероидогенные пути через циклическую передачу сигналов АМФ (цАМФ) для выработки прогестерона ^9,10,11. Клетки тека, с другой стороны, временно продуцируют эстрадиол, который в значительной степени отличается от того, что происходит у млекопитающих, чьи клетки тека продуцируют андроген и прогестерон 12,13,14. Вместе с внешней сигнализацией, гранулеза и тека являются решающими факторами в созревании фолликулов и яйцекладке. Метод разделения слоев гранулезы и теки был впервые описан Гилбертом и др. в 1977-15 гг. Достижение полного разделения слоев гранулезы и теки и обеспечение отсутствия гранулезного материала может представлять трудности при использовании метода Жильбера. Кроме того, отсутствие четкого визуального руководства по завершению разделения может затруднить выполнение задачи. Это исследование направлено на описание извлечения и отделения слоев гранулезы, теки и ооцитов из преовуляторных фолликулов, предлагая адаптации и обеспечивая четкое визуальное представление с помощью изображений и видео (Рисунок 3). Визуализация этого метода позволит ученым, изучающим фолликулы яичников птиц, воспроизводимо захватывать гранулезу и слои теки как для сельскохозяйственного, так и для биомедицинского мультиомиксного подхода.

протокол

Все животные, использованные в этом исследовании, содержались и усыплялись в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Делавэра (протокол IACUC 110R).

1. Подготовка

1. Стерилизация
   1. Автоклавные стеклянные чаши на 5 унций с использованием автоклавирования гравитационного вытеснения (121 °C в течение 20 минут) покрыты алюминиевой фольгой с автоклавной лентой сверху для поддержания и индикации стерильности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого фолликула, на котором выполняется разделение, потребуется одна чаша.
   2. Инструменты для автоклавной диссекции с использованием автоклавирования гравитационного смещения (121 °C в течение 20 мин), включая ножницы, изогнутые щипцы и прямые щипцы в стерилизационных пакетах.
2. Обустройство зоны сепарации
   1. Настройте зону разделения фолликулов, как показано на рисунке 4. Наполните контейнеры льдом непосредственно перед отделением фолликулов и пополняйте их по мере необходимости на протяжении всего процесса разделения фолликулов.
3. Решения
   1. Разбавить до 10-кратной концентрации PBS до 1x рабочего состава и поместить в холодильник при температуре +4 °C за день до вскрытия.
   2. Развести изопропанол до 70% концентрации рабочего состава в пульверизаторе.

2. Вскрытие

1. Усыпить половозрелую самку птицы.
   1. Выберите половозрелую самку птицы (которая в настоящее время должна откладывать яйца) и усыпьте¹⁶ птиц утвержденным методом (Рекомендации AVMA) в соответствии с протоколом ухода и использования в учреждении, например, при вывихе шейки матки.
   2. Для захвата самого большого фолликула F1 усыпьте животное в течение первых 4 часов после наступления света в течение дня. Пальпируйте нижнюю часть живота перед эвтаназией, чтобы подтвердить наличие яйцеклетки с твердой скорлупой в матке; Это гарантирует, что яйцекладка и, таким образом, следующая овуляция еще не произошла.
2. Доступ к яичнику.
   1. Опрыскайте наружную тушу и перья 70% изопропанолом. Это увлажняет перья и очищает место разреза.
   2. Используя ножницы для вскрытия и руку в перчатке, сожмите и разрежьте один горизонтальный (поперечный) разрез по средней линии длиной примерно 7,5 см (3 дюйма). Перед разрезом прижмите кожу, мышцы и жировые пласты, чтобы избежать прокола органов.
   3. Расширьте разрез в боковом направлении с правой стороны птицы и прощупайте пальцами в перчатках, чтобы отодвинуть висцеральные органы с пути ножниц. Продолжайте до тех пор, пока 2-3 ребра животного не будут обрезаны с правой стороны.
   4. Расширьте разрез по направлению к левой стороне птицы, как это сделано справа. Действуйте с особой осторожностью, так как преовуляторные фолликулы яичника расположены здесь, выступают из поверхности яичника и могут легко разорваться. Слегка надавливайте пальцами, чтобы предовуляторные фолликулы не попадали в ножницы, так как с левой стороны птицы обрезаются 2-3 ребра.
   5. Положите одну руку на нижнюю часть живота птицы, а другую крепко на нижнюю часть грудины, и вручную втяните грудку птицы вверх, чтобы обеспечить дальнейший доступ к целомической полости птицы.
   6. Держа каждое из бедер птицы близко к скакательному суставу, вручную оттолкните их назад, чтобы вывихнуть оба тазобедренных сустава одновременно. Теперь есть полный доступ к яичнику как визуально, так и пространственно.
3. Удалить преовуляторные фолликулы.
   1. Выполняйте все действия с помощью обычного визуального зрения. Если у человека возникают проблемы с визуализацией на каком-либо этапе, используйте препарирующий микроскоп.
   2. Используя только пальцы в перчатках, аккуратно обхватите каждый видимый желтый преовуляторный фолликул и извлеките его из яичника. Во время извлечения только ущипните стебель, чтобы помочь отрезать стебель. Не стоит пережимать сам фолликул, иначе он может разорваться.
   3. Поместите каждый фолликул в стерильный контейнер с ледяным PBS.
   4. Оставьте преовуляторные фолликулы на льду не менее чем на 5 минут, чтобы желток застыл. Теплый желток будет прилипать к окружающим слоям фолликулярных клеток, что затрудняет выполнение последующих техник разделения.

3. Разделение в лаборатории

1. Возьмите изолированный фолликул из стерильного контейнера и поместите контейнер с оставшимися фолликулами обратно на лед. Изучите фолликул перед манипуляцией, обращая внимание на расположение трех особенностей: стебля, рыльца и зародышевого диска (рис. 2).
2. Начните с удаления серозы с фолликулярной поверхности. Аккуратно прокатайте фолликул по сухому бумажному полотенцу, чтобы удалить серозальный слой, при необходимости аккуратно оттягивая его.
3. Держите фолликул за стебель над миской, наполненной PBS. Используйте гравитацию, чтобы визуализировать, где стебель заканчивается на поверхности фолликула, и с помощью ножниц отрежьте только стебель, не прокалывая поверхность фолликула. Продолжайте удалять серозу до тех пор, пока она не станет видна.
4. Используя лайтбокс для подсветки и зародышевый диск в качестве ориентира, переместите рыльце на противоположную сторону и аккуратно удерживайте фолликул так, чтобы была видна сторона рыльца. Держите фолликул прямо над чашей ледяного PBS.
5. Возьмите в руки скальпель, аккуратно разрежьте по длине рыльца, и сразу же опустите фолликул в ПБС, как желток начнет выпадать. Не держите фолликул крепко, так как это вытолкнет желток наружу, а не позволит ему просто выпасть под действием силы тяжести.
6. С помощью пары прямых щипцов без зубов аккуратно отшпилите розовый слой фолликулярной стенки от желтка с одной стороны среза. Завершите это извлечение с помощью небольших сжимающих и вытягивающих движений, которые приподнимают стенку фолликула от желтка.
7. Разделение слоев работает лучше всего, когда примерно 5 мм ткани фолликулярной стенки было отведено от желтка за один раз. Когда участок фолликулярной стенки диаметром 5 мм успешно отведен от желтка, используйте угловые щипцы в тандеме с прямыми щипцами для зондирования вдоль оболочки фолликула.
8. В некоторых случаях слой гранулезы может быть более тесно связан с желтком, чем слой теки. В этой ситуации просто очень осторожно прощупайте поверхность желтка с помощью любой пары щипцов, чтобы попытаться оттянуть слой, похожий на папиросную бумагу, от желтка. После того, как слой гранулезы будет найден, надежно прижмите его к слою теки и продолжайте оттягивать оба слоя от желтка, как описано ранее.
9. С помощью изогнутых щипцов слегка смахните желток с защемленных слоев. Сметите или удалите лишний желток из миски. Не соскабливайте гранулезный слой; Это приведет к разрыву. Энергичные движения затуманивают решение PBS и снижают визуализацию. Продолжайте осторожные и обдуманные движения.
10. После того, как каждый 5-10 мм участок фолликулярной стенки втягивается, сделайте паузу, чтобы взять слои теки и гранулезы в каждом наборе щипцов, и убедитесь, что два слоя отслаиваются друг от друга постепенно, так же, как они оба отслаиваются от желтка. Продолжайте этот процесс вокруг внешней стороны фолликула. Если манипуляция становится затруднительной из-за лоскута гранулезно-текального слоя, поверните фолликул, чтобы начать процесс с другой стороны среза.
11. В процессе разделения будет встречаться зародышевый диск (женская гамета и зародышевый пузырь). Это область, которая чрезвычайно прилегает как к гранулезному слою, так и к желтку. Осторожно подойдите к зародышевому диску, используя прямые щипцы, чтобы прочно прижать слой гранулезы к текскому слою, так как изогнутые щипцы используются легкими движениями щетки, чтобы отодвинуть зародышевый диск от клеток гранулезы на поверхность желтка.
    1. Если зародышевый диск желателен в качестве образца для исследования, смахните желток в этом месте угловыми щипцами и храните по желанию.
12. Продолжайте отделять желток от стенки фолликула с помощью изогнутых щипцов до тех пор, пока не будет удален желток по всей сфере фолликула.
13. После того, как оставшаяся часть желтка будет очищена от слоев, отделите последнюю часть слоя гранулезы от слоя теки. Полностью отделенный слой гранулезы может быть не полностью лишен желтка, но убедитесь, что он не покрыт им. Поместите слой гранулезы и слой текала в отдельные емкости с температурой PBS 4 °C.
    1. Как только слой гранулезы окажется в отдельном контейнере от слоя теки, осторожно перемешивайте слой теки вперед и назад в PBS с помощью щипцов, чтобы убедиться, что все оставшиеся остатки слоя гранулезы отделятся.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые методы обработки после разделения могут учитывать удаление липидного мусора путем разложения или центрифугирования, в зависимости от желаемого исследования.
    2. При первом применении этой техники подготовьте и проанализируйте репрезентативные разделенные образцы гистологически, чтобы подтвердить точное разделение слоев и сбор.
       1. Для этого зафиксируйте части отделенных тканей в нейтральном буферном формалине с помощью сетчатых тканевых кассет или губок для предотвращения потери образца, затем зафиксируйте парафин, срежьте и окрашивайте срез гематоксилином и эозином (H&E).
       2. Из-за его деликатного характера осторожно обрабатывайте и помещайте слой гранулезы на биопсийные губки в гистологической кассете, чтобы гарантировать, что клеточный слой останется неповрежденным.
       3. Поместите слой теки непосредственно в гистологическую кассету. Это также позволит визуализировать уровень контаминации образца другой фолликулярной тканью (т.е. образцом гранулезного слоя клеток с адгезией белка желтка или текальными клетками).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Не всегда возможно получить только один интересующий слой из-за тесной связи фолликулярных тканей. Тем не менее, знание уровня возможного загрязнения может помочь в интерпретации последующих мультиомиксных подходов.

Результаты

Этот протокол приводит к отделению слоев гранулезы и текальных клеток от фолликула яичника (Рисунок 5 и Рисунок 6). Затем эти слои могут быть подготовлены для гистологического исследования для подтверждения успешного разделения. Эти ги...

Обсуждение

В этом исследовании описана процедура четкого отделения гранулезных и текальных слоев клеток от преовуляторных фолликулов у домашней птицы. В отличие от существующего метода, разработанного Gilbert et al. в 1977 году, адаптации, сделанные в этом методе, позволяют создать бол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 in. Small Glass Bowls, 5 oz	Amazon	B0BXP5PJTN	Autoclavable glass bowls of at least 3.5 in. diameter
Aluminum Foil	Costco	720	Cover autoclave bowls
Amazon Pet Training Pads, Regular, 100-Count	Amazon	B0B58WTPFS	For use as necrospy pads, any absorbant pad will work
Autoclave Tape	Fisherbrand	15-901-111
Cole-Parmer LED Fiber Optic Illuminators	Cole-Parmer	EW-41723-02
Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-123	Non-Serrated
Dissecting Microscope	Leica	S6E
Fine Precision Scissors	Fisherbrand	12-000-155	Non-Serrated
Food Container Boxes with Lid Set of 17 Clear/Green Microwave Freezer Dishwasher Safe	Amazon	B09QGZCRDB	Use any container that can hold ice AND an 3.5 in. small glass bowl
High Precision 45 Degree Curved Tapered Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-125	Non-Serrated
High Precision Straight Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	16-100-120	Non-Serrated
Isopropanol	Fisherbrand	A426P-4
McKesson Specimen Container, Sterile, Screw Cap, Leak-Resistant, 120 mL	McKesson	16-9526	4 oz. / 120 cc, graduated
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.6	ThermoFisher	J62692.K7	Will need to be made into 1x PBS
Spray Bottle	Cole-Parmer	EW-06091-01	For 70% Isopropanol
Sterile Surgical Blades #22	Cincinnati Surgical	122
Sterilization Pouches 10" x 16"	Amazon	B07MFB455C
Tapered Ultrafine Tip Forceps Fisherbrand	Fisherbrand	16-100-121	Non-Serrated
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisherbrand	22-038-221
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Chemical	SF98-4
Tissue processing/embedding cassettes with lid	Simport M490-2	Z672122