Aşağı Akış Uygulamaları için Kuş Preovulatuar Folikül Granüloza ve Teka Hücre Katmanlarının Ayrılması

Özet

Burada, kuş preovulatuar foliküllerinde yumurta sarısı, granüloza hücreleri ve teka hücrelerini ayırmak için bir protokol açıklıyoruz. Bu hassas işleme, bu katmanların üreme işlevindeki rolüne ilişkin kritik araştırmalara olanak tanıyarak, gelişmiş tarımsal verim ve biyomedikal içgörüler için foliküler gelişim, hormonal düzenleme ve hastalık araştırmalarının anlaşılmasına yardımcı olur.

Özet

Yumurtacı tavuklar (yumurtlayan tavuklar) ve etlik piliç yetiştiricileri (et üreten tavuklar için damızlık hayvanlar), güvenilir bir protein kaynağı olarak dünyanın gıda arzı için çok önemlidir. Aynı zamanda insan üreme hastalıklarının incelenmesi için ortaya çıkan bir hayvan modelidir. Kanatlı hayvan araştırmaları alanı geliştikçe, yumurtacı tavuk ve broyler damızlık yumurtalıklarının sağlığı ve işlevi hem tarımsal hem de biyomedikal araştırmacılar için önemli bir çalışma noktası olacaktır. Ortaya çıkan bu ilginin ortaya çıkardığı zorluklardan biri, tüm araştırmacıların yumurtalık örneği toplamada kullanabileceği tekrarlanabilir tekniklere duyulan ihtiyaçtır. Özellikle, araştırmacılar arasında anlaşma ve tutarlılık sağlamak için özel granüloza ve teka hücre katmanlarının tavuk foliküllerinden uygun şekilde ayrılmasını tanımlamak için ayrıntılı bir görsel süreç oluşturulmalıdır.

Bu çalışma, birinci sınıf üreme çağındaki beyaz leghorn tavuklarında yumurtlama öncesi foliküllerin ve yumurtalık dokusunun ekstraksiyonunu açıklamaktadır. Bu foliküllerin ayrılması, daha kolay manipülasyon için yumurta sarısını pıhtılaştırmak ve ayırma işlemi sırasında folikülün kendi ağırlığının hücre katmanlarını parçalamasını önlemek için soğuk, sıvı koşullar altında gerçekleştirilir. Ayırma işlemi tamamlandıktan sonra, istenen hücre katmanları doku kültürü yaklaşımları için daha fazla sindirilebilir veya genomik ve proteomik analizler için dondurularak saklanabilir.

Giriş

Yumurta üreten tavuklar, dünya gıda tedarik zincirinin önemli bir bileşenidir ve doğurganlık ve yumurtalık kanseri çalışmaları için gelişen bir hayvan modelidir. Tavuk, influenza aşılarının¹ in ovo çalışmalarından kanserli tümör büyümesi² çalışmasına kadar uzun bir laboratuvar kullanım geçmişine sahiptir ve gonadal gelişim ^3,4,5 hakkında bilgi edinmek için kilit bir hayvandır. Bir tavuğun üreme sisteminin rolünü, özellikle yumurtalık foliküler gelişiminin döngüsel doğasını ve ilgili hücre türlerini anlamak, büyük bir ilgi alanı ve potansiyel uygulama alanıdır. Tavuk yumurtalığını sorgulamak için multi-omik yaklaşımlar, verimlilik analizi yoluyla tarımsal verimi artırmak ve üreme hastalığı için bir model olarak tavuk yoluyla insan sağlığına yönelik faktörleri aydınlatmak için uygulamalara sahiptir.

Kuş yumurtalığı, (1) küçük primordial ve primer foliküller (>1 mm), (2) değişken büyüklükte işe alım öncesi foliküller (beyaz ila soluk sarı, 2-8 mm) ve (3) büyük, yumurta sarısı dolu preovulatuar foliküllerden (sarı) oluşan çok belirgin gelişimsel foliküler aşamalara sahiptir (Şekil 1)^5,6,7. Cinsel olarak olgun bir kuş yumurtalığı, yumurtalık foliküllerini barındıran bir dış korteks ve düz kas, sinirler ve damar sisteminden oluşan iç medulladan oluşur⁸. Foliküler gelişim döngüsünün tamamı kortekste gerçekleşir. Bununla birlikte, yaklaşık beş aylık olana kadar, yalnızca sol yumurtalık, yumurtlama öncesi (yani sarı) foliküllerin tam bir gelişimsel hiyerarşisini gösterir ve tavuk ilk yumurtlama ve yumurtlama (yumurta yumurtlama) sürecinden geçer. Yumurtlama öncesi foliküller, en büyük ve yumurtlamanın yanındaki F1 folikülünden daha az gelişmiş, en küçük folikül olan F5 veya F6'ya kadar değişen yaklaşık 5 ila 6 folikülden oluşan brüt olarak görünür bir hiyerarşi oluşturur. Yumurtlama öncesi foliküller, daha büyük boyutları, geniş innervasyonları ve koyu sarı sarısı nedeniyle daha küçük işe alım öncesi foliküllerden kolayca ayırt edilebilir.

Tüm foliküller, yumurtlamadan önce farklı aşamalardan geçerken folikülün sinyalleşmesi, büyümesi ve gelişmesinde çeşitli rolleri destekleyen özel hücre tipleri içerir - bunlar granüloza hücreleri, teka hücreleri ve oositlerdir (dişi gametler) (Şekil 2A). Özellikle, granüloza hücre tabakaları folikülün iç duvarını oluşturur ve teka hücreleri oositi çevreleyen diğer duvarı oluşturur. Bir folikül yumurtlama öncesi hiyerarşi boyunca ilerledikçe, teka ve granüloza hücre katmanları, özellikle yumurtlama öncesi folikülün sapının tam karşısındaki bir nokta boyunca incelmeye başlar. Sap, folikülün yumurtalığa bağlanma noktasıdır (Şekil 2B). Sapın karşısındaki granüloza ve teka tabakalarının bu çizgisine stigma adı verilir (Şekil 2C). Tamamen damar sisteminden yoksundur ve bir F1 folikülünün yumurtlaması sırasında foliküler yırtılma noktası olacaktır. Ayrıca germinal disk veya oositi çevreleyen kabarık beyaz destek hücreleri tabakası da görülebilir (Şekil 2B).

Hem granüloza hem de teka hücreleri, karmaşık hormonal sinyaller yoluyla oositi çevreledikleri ve destekledikleri için folikül gelişiminin temel bileşenleridir. Granüloza hücre tabakası, progesteron üretimini sağlamak için siklik AMP (cAMP) sinyali yoluyla steroidojenik yolları destekler ^9,10,11. Öte yandan, teka hücreleri zamansal olarak östradiol üretir, bu da teka hücreleri androjen ve progesteron üreten memelilerden büyük ölçüde farklıdır ^12,13,14. Harici sinyalleme ile birlikte ele alındığında, granüloza ve teka hücreleri folikül olgunlaşması ve yumurtlamada çok önemli itici güçlerdir. Granüloza ve teka tabakalarını ayırma tekniği ilk olarak Gilbert ve ark. 1977'de¹⁵. Granüloza ve teka tabakalarının kapsamlı bir şekilde ayrılması ve geride granüloza materyali kalmamasının sağlanması, Gilbert yöntemi ile zorluklar ortaya çıkarabilir. Ayrıca, ayırma işlemini tamamlamak için net bir görsel kılavuzun olmaması, görevin yürütülmesini zorlaştırabilir. Bu çalışma, granüloza, teka ve oosit tabakalarının preovulatuar foliküllerden ekstraksiyonunu ve ayrılmasını tanımlamayı, adaptasyonlar sunmayı ve hem görüntülerin hem de videoların kullanımı yoluyla net bir görsel temsil sunmayı amaçlamaktadır (Şekil 3). Bu tekniğin görselleştirilmesi, kuş yumurtalık foliküllerini inceleyen bilim adamlarının hem tarımsal hem de biyomedikal multi-omik yaklaşımlar için granüloza ve teka katmanlarını tekrarlanabilir bir şekilde yakalamalarına olanak sağlayacaktır.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar, Delaware Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC Protokolü 110R) tarafından onaylanan protokole göre korundu ve ötenazi yapıldı.

1. Hazırlık

1. Sterilizasyon
   1. Yerçekimi deplasmanlı otoklavlama (20 dakika boyunca 121 °C) kullanan otoklav 5 oz cam kaseler, steriliteyi korumak ve belirtmek için üstte otoklav bandı ile alüminyum folyo ile kaplanmıştır.
      NOT: Ayırma işleminin gerçekleştirildiği her folikül için bir kaseye ihtiyaç duyulacaktır.
   2. Sterilizasyon torbalarında makas, kavisli forseps ve düz forseps dahil olmak üzere yerçekimi deplasmanlı otoklavlama (20 dakika boyunca 121 °C) kullanan otoklav diseksiyon aletleri.
2. Ayırma alanının ayarlanması
   1. Şekil 4'te görüldüğü gibi folikül ayırma alanını ayarlayın. Folikül ayrılmasından hemen önce tutma kaplarını buzla doldurun ve folikül ayırma işlemi boyunca gerektiği kadar doldurun.
3. Çözümleri
   1. 10x PBS konsantrasyonuna 1x çalışma stoğuna seyreltin ve diseksiyondan bir gün önce +4 °C buzdolabına koyun.
   2. Sprey şişesinde izopropanolü% 70 çalışma stoğu konsantrasyonuna seyreltin.

2. Diseksiyon

1. Cinsel olarak olgun bir dişi kuşa ötenazi yapın.
   1. Cinsel olarak olgun bir dişi kuş seçin (şu anda yumurtluyor olmalı) ve servikal çıkık gibi kurumsal bakım ve kullanım protokolüne göre onaylanmış yöntemle (AVMA Yönergeleri)^16'ya ötenazi yapın.
   2. En büyük F1 folikülünün yakalanması için, hayvanı gün boyunca ışık başlangıcından sonraki ilk 4 saat içinde ötenazi yapın. Rahimde sert kabuklu bir yumurtayı doğrulamak için ötenaziden önce alt karın bölgesini palpe edin; Bu, yumurtlamanın ve dolayısıyla bir sonraki yumurtlamanın henüz gerçekleşmemesini sağlar.
2. Yumurtalığa erişin.
   1. Dış karkas ve tüylere% 70 izopropanol püskürtün. Bu tüyleri nemlendirir ve kesi noktasını temizler.
   2. Diseksiyon makası ve eldivenli bir el kullanarak, yaklaşık 7,5 cm (3 inç) uzunluğunda tek bir yatay (enine) orta hat kesisini sıkıştırın ve kesin. Organların delinmesini önlemek için kesiden önce cildi, kas ve yağ tabakalarını sıkıştırın.
   3. Kuşun sağ tarafındaki kesiği yanal olarak genişletin ve iç organları makasın önünden itmek için eldivenli parmaklarla araştırın. Hayvanın kaburgalarının 2-3'ü sağ tarafta kesilene kadar devam edin.
   4. Kesiği sağda olduğu gibi kuşun sol tarafına doğru genişletin. Yumurtalığın yumurtlama öncesi folikülleri burada bulunduğundan, yumurtalık yüzeyinden çıkıntı yaptığından ve kolayca yırtılabileceğinden daha dikkatli olun. Kuşun sol tarafında 2-3 kaburga kesildiği için yumurtlama öncesi folikülleri makastan uzak tutmak için parmaklarınızla hafif bir baskı uygulayın.
   5. Bir elinizi kuşun alt karnına, diğerini göğüs kemiğinin alt tarafına sıkıca yerleştirin ve kuşun sölomik boşluğuna daha fazla erişim sağlamak için kuşun göğsünü manuel olarak yukarı doğru çekin.
   6. Kuşun uyluklarının her birini diz eklemine yakın tutarak, her iki kalça eklemini aynı anda yerinden çıkarmak için manuel olarak geriye doğru itin. Artık yumurtalığa hem görsel hem de mekansal olarak tam erişim var.
3. Yumurtlama foliküllerini çıkarın.
   1. Tüm adımları rutin görsel görme ile gerçekleştirin. Bir birey herhangi bir aşamada görselleştirmede sorun yaşıyorsa, diseksiyon mikroskobu kullanın.
   2. Sadece eldivenli parmakları kullanarak, her görünür sarı preovulatuar folikülü nazikçe kaplayın ve yumurtalıktan çıkarın. Sapın kesilmesine yardımcı olmak için ekstraksiyon sırasında sadece sapı sıkıştırın. Folikülün kendisini sıkıştırmayın, aksi takdirde yırtılabilir.
   3. Her folikülü buz gibi soğuk PBS ile steril kaba yerleştirin.
   4. Yumurta sarısının pıhtılaşmasına izin vermek için yumurtlama öncesi folikülleri en az 5 dakika buz üzerinde bırakın. Sıcak yumurta sarısı, çevredeki foliküler hücre katmanlarına yapışacak ve sonraki ayırma tekniklerinin gerçekleştirilmesini zorlaştıracaktır.

3. Laboratuvarda ayırma

1. Steril kaptan izole edilmiş bir folikül alın ve kalan foliküllerle birlikte kabı tekrar buzun üzerine yerleştirin. Manipülasyondan önce folikülü inceleyin, üç özelliğin yerini not edin: sap, stigma ve germinal disk (Şekil 2).
2. Serozayı foliküler yüzeyden çıkararak başlayın. Serozal tabakayı çıkarmak için folikülü kuru bir kağıt havlu üzerinde nazikçe yuvarlayın ve gerekirse nazikçe çekin.
3. Folikülü, PBS ile doldurulmuş kasenin üzerindeki sapından tutun. Sapın folikül yüzeyinde nerede bittiğini görselleştirmek için yerçekimini kullanın ve makas kullanarak folikül yüzeyini delmeden sadece sapı kesin. Artık görünmeyene kadar serosa'nın çıkarılmasına devam edin.
4. Aydınlatmak için ışık kutusunu ve germinal diski referans olarak kullanarak, stigmayı karşı tarafa yerleştirin ve folikülü stigma tarafı görünecek şekilde nazikçe tutun. Folikülü doğrudan buz gibi soğuk PBS kasesinin üzerinde tutun.
5. Neşteri alın, stigma uzunluğu boyunca hafifçe dilimleyin ve yumurta sarısı dökülmeye başladığında folikülü hemen PBS'ye bırakın. Folikülü sıkıca tutmayın, çünkü bu, yumurta sarısını yerçekimi yoluyla düşmesine izin vermek yerine dışarı itecektir.
6. Bir çift düz dişsiz doku forseps kullanarak, foliküler duvarın pembe tabakasını dilimin bir tarafındaki yumurta sarısından nazikçe soyun. Folikül duvarını yumurta sarısından uzaklaştıran küçük kıstırma ve çekme hareketlerini kullanarak bu ekstraksiyonu tamamlayın.
7. Tabaka ayırma, bir seferde yaklaşık 5 mm foliküler duvar dokusu yumurta sarısından geri çekildiğinde en iyi sonucu verir. Foliküler duvarın 5 mm'lik bir bölümü yumurta sarısından başarılı bir şekilde geri çekildiğinde, folikül kabuğu boyunca araştırma yapmak için düz forseps ile birlikte açılı forseps kullanın.
8. Bazı durumlarda, granüloza tabakası, yumurta sarısı ile teka tabakasından daha yakından ilişkili olabilir. Bu durumda, kağıt mendil benzeri tabakayı yumurta sarısından uzaklaştırmaya çalışmak için her iki forseps çiftini kullanarak yumurta sarısının yüzeyini çok nazikçe inceleyin. Granüloza tabakası yerleştirildikten sonra, onu teka tabakasına güvenli bir şekilde sıkıştırın ve daha önce tarif edildiği gibi her iki tabakayı da yumurta sarısından çekerek devam edin.
9. Sarsarıyı sıkışmış katmanlardan hafifçe fırçalamak için kavisli forseps kullanın. Kaseden fazla sarıyı süpürün veya çıkarın. Granüloza tabakasını kazımayın; Bu yırtılmaya neden olur. Güçlü hareketler PBS çözümünü bulanıklaştıracak ve görselleştirmeyi azaltacaktır. Dikkatli ve kasıtlı hareketlerle ilerleyin.
10. Foliküler duvarın her 5-10 mm'lik bölümü geri çekildikten sonra, her bir forseps setindeki teka ve granüloza katmanlarını almak için duraklayın ve iki katmanın, her ikisi de yumurta sarısından soyulduğu gibi yavaş yavaş birbirinden soyulduğundan emin olun. Bu işleme folikülün dışında devam edin. Granülosa-teka tabakasının kanadı nedeniyle manipülasyon zorlaşırsa, işleme dilimin diğer tarafından başlamak için folikülü çevirin.
11. Ayrılma işlemi sırasında germinal disk (dişi gamet ve germinal vezikül) ile karşılaşılacaktır. Bu, hem granüloza tabakasına hem de yumurta sarısına son derece yapışkan olan bir alandır. Kavisli forsepsler, germinal diski granüloza hücrelerinden yumurta sarısı yüzeyine itmek için hafif fırçalama hareketlerinde kullanıldığından, granüloza tabakasını teka tabakasına sıkıca tutmak için düz forsepsleri kullanarak germinal diske dikkatlice yaklaşın.
    1. Germinal disk bir araştırma örneği olarak isteniyorsa, bu noktada sarıyı açılı forseps ile fırçalayın ve istediğiniz gibi saklayın.
12. Folikülün tüm küresinin sarısı çıkarılana kadar yumurta sarısını kavisli forseps ile foliküler duvardan ayırmaya devam edin.
13. Sarının geri kalanı katmanlardan fırçalandıktan sonra, granüloza tabakasının son kısmını teka tabakasından ayırın. Tamamen ayrılmış granüloza tabakası, yumurta sarısı maddesinden tamamen yoksun olmayabilir, ancak bununla kaplanmadığından emin olun. Granüloza tabakasını ve tekal tabakayı 4 °C sıcaklıkta PBS ile ayrı kaplara yerleştirin.
    1. Granüloza tabakası teka tabakasından ayrı bir kapta olduğunda, granüloza tabakasının kalan kalıntılarının ayrılmasını sağlamak için teka tabakasını PBS'de forseps ile ileri geri nazikçe çalkalayın.
       NOT: Ayırma sonrası belirli işleme yöntemleri, istenen çalışmaya bağlı olarak lipid kalıntılarının sindirim veya santrifüjleme yoluyla uzaklaştırılmasını açıklayabilir.
    2. Bu tekniği ilk kez uygularken, doğru katman ayrımını ve toplamayı doğrulamak için temsili olarak ayrılmış numuneleri histolojik olarak hazırlayın ve analiz edin.
       1. Bunu yapmak için, ayrılmış dokuların kısımlarını, numune kaybını önlemek için ağ doku kasetleri veya süngerler kullanarak nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin, ardından parafin gömün, kesit alın ve bölümü Hematoksilen ve Eozin (H & E) ile boyayın.
       2. Hassas doğası nedeniyle, hücresel tabakanın sağlam kalmasını sağlamak için granüloza tabakasını histolojik bir kasetteki biyopsi süngerlerinin üzerine dikkatlice tutun ve yerleştirin.
       3. Teka tabakasını doğrudan histolojik bir kasetin içine koyun. Bunu yapmak aynı zamanda diğer foliküler doku (yani, yumurta sarısı proteini veya tekal hücrelerin yapışması ile granüloza hücre tabakası örneği) tarafından örnek kontaminasyon seviyesinin görselleştirilmesine de izin verecektir.
          NOT: Foliküler dokuların yakın ilişkisi nedeniyle her zaman sadece tek bir ilgi katmanı elde etmek mümkün olmayabilir. Bununla birlikte, olası kontaminasyon seviyesinin bilinmesi, sonraki multi-omik yaklaşımların yorumlanmasını bilgilendirebilir.

Sonuçlar

Bu protokol over folikülünden granüloza ve tekal hücre tabakalarının ayrılmasını sağlar (Şekil 5 ve Şekil 6). Bu katmanlar daha sonra başarılı bir şekilde ayrılmayı doğrulamak için histolojik inceleme için hazırlanabilir. Kurul onaylı bir veteriner patolog (EMB) tarafından gözden geçirilen ve yakalanan bu histolojik görüntüler, hem F1 hem de F5 preovulatuar foliküller için granüloza ve teka tabaka...

Tartışmalar

Bu çalışma, kümes hayvanlarında hem granüloza hem de tekal hücre katmanlarının yumurtlama öncesi foliküllerden farklı şekilde ayrılması prosedürünü özetlemektedir. 1977 yılında Gilbert ve ark. tarafından kurulan mevcut yöntemden farklı olarak, bu yöntemde yapılan uyarlamalar, granüloza hücre tabakasını tüm preovulatuar foliküllerden teka tabakasından manuel olarak ayırırken daha kontrollü bir ortama izin verir¹⁵. Ayrıca, araşt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 in. Small Glass Bowls, 5 oz	Amazon	B0BXP5PJTN	Autoclavable glass bowls of at least 3.5 in. diameter
Aluminum Foil	Costco	720	Cover autoclave bowls
Amazon Pet Training Pads, Regular, 100-Count	Amazon	B0B58WTPFS	For use as necrospy pads, any absorbant pad will work
Autoclave Tape	Fisherbrand	15-901-111
Cole-Parmer LED Fiber Optic Illuminators	Cole-Parmer	EW-41723-02
Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-123	Non-Serrated
Dissecting Microscope	Leica	S6E
Fine Precision Scissors	Fisherbrand	12-000-155	Non-Serrated
Food Container Boxes with Lid Set of 17 Clear/Green Microwave Freezer Dishwasher Safe	Amazon	B09QGZCRDB	Use any container that can hold ice AND an 3.5 in. small glass bowl
High Precision 45 Degree Curved Tapered Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-125	Non-Serrated
High Precision Straight Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	16-100-120	Non-Serrated
Isopropanol	Fisherbrand	A426P-4
McKesson Specimen Container, Sterile, Screw Cap, Leak-Resistant, 120 mL	McKesson	16-9526	4 oz. / 120 cc, graduated
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.6	ThermoFisher	J62692.K7	Will need to be made into 1x PBS
Spray Bottle	Cole-Parmer	EW-06091-01	For 70% Isopropanol
Sterile Surgical Blades #22	Cincinnati Surgical	122
Sterilization Pouches 10" x 16"	Amazon	B07MFB455C
Tapered Ultrafine Tip Forceps Fisherbrand	Fisherbrand	16-100-121	Non-Serrated
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisherbrand	22-038-221
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Chemical	SF98-4
Tissue processing/embedding cassettes with lid	Simport M490-2	Z672122