Trennung von präovulatorischen Follikel-, Granulosa- und Thekazellschichten von Vögeln für Downstream-Anwendungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Trennung von Dotter-, Granulosazellen und Thekazellen in präovulatorischen Follikeln von Vögeln. Diese präzise Handhabung ermöglicht kritische Untersuchungen der Rolle dieser Schichten für die Fortpflanzungsfunktion und hilft beim Verständnis der Follikelentwicklung, der Hormonregulation und der Krankheitsforschung, um den landwirtschaftlichen Ertrag zu steigern und biomedizinische Erkenntnisse zu gewinnen.

Zusammenfassung

Legehennen (Legehennen) und Masthähnchenzüchter (Zuchttiere für fleischproduzierende Hühner) sind als zuverlässige Proteinquelle für die weltweite Nahrungsmittelversorgung von entscheidender Bedeutung. Sie sind auch ein aufstrebendes Tiermodell für die Erforschung menschlicher Fortpflanzungskrankheiten. Mit der Entwicklung des Gebiets der Geflügelforschung wird die Gesundheit und Funktion des Eierstocks von Legehennen und Masthähnchenzüchtern ein wichtiger Studienpunkt sowohl für landwirtschaftliche als auch für biomedizinische Forscher sein. Eine der Herausforderungen, die sich aus diesem aufkommenden Interesse ergibt, ist der Bedarf an replizierbaren Techniken, die alle Forscher bei der Entnahme von Eierstockproben einsetzen können. Insbesondere muss ein detaillierter visueller Prozess etabliert werden, um die richtige Trennung der spezialisierten Granulosa- und Thekazellschichten von den Hühnerfollikeln zu definieren, um Übereinstimmung und Konsistenz unter den Forschern zu erreichen.

Diese Studie beschreibt die Extraktion von präovulatorischen Follikeln und Eierstockgewebe bei weißen Leghornhühnern im besten gebärfähigen Alter. Die Trennung dieser Follikel erfolgt unter kalten, flüssigen Bedingungen, um das Eigelb für eine einfachere Handhabung zu erstarren und zu verhindern, dass das Eigengewicht des Follikels die Zellschichten während des Trennungsprozesses auseinanderreißt. Sobald die Trennung abgeschlossen ist, können die gewünschten Zellschichten für Gewebekulturansätze weiter verdaut oder für genomische und proteomische Analysen kryokonserviert werden.

Einleitung

Eier produzierende Hühner sind eine Schlüsselkomponente der weltweiten Lebensmittelversorgungskette und ein sich entwickelndes Tiermodell für die Erforschung von Fruchtbarkeit und Eierstockkrebs. Das Huhn hat eine lange Geschichte der Laboranwendung, von In-Ovo-Studien mit In-Ovo-Impfstoffen¹ bis hin zur Untersuchung des Wachstums von Krebstumoren², und ist ein Schlüsseltier für die Einsicht in die Entwicklung der Gonaden ^3,4,5. Das Verständnis der Rolle des Fortpflanzungssystems einer Henne, insbesondere der zyklischen Natur der follikulären Entwicklung der Eierstöcke und der beteiligten Zelltypen, ist ein Bereich von großem Interesse und potenzieller Anwendung. Multi-Omics-Ansätze zur Untersuchung des Eierstocks der Henne haben Anwendungen zur Steigerung des landwirtschaftlichen Ertrags durch Produktivitätsanalyse und zur Aufklärung von Faktoren für die menschliche Gesundheit anhand der Henne als Modell für Fortpflanzungskrankheiten.

Der aviäre Eierstock hat sehr unterschiedliche Entwicklungsfollikelstadien, die aus (1) kleinen Primordial- und Primärfollikeln (>1 mm), (2) unterschiedlich großen Prärekrutierungsfollikeln (weiß bis blassgelb, 2-8 mm) und (3) großen, mit Dotter gefüllten präovulatorischen Follikeln (gelb) bestehen (Abbildung 1)^5,6,7. Ein geschlechtsreifer Eierstock eines Vogels besteht aus einer äußeren Rinde, in der sich die Eierstockfollikel befinden, und dem inneren Mark, das aus glatter Muskulatur, Nerven und Gefäßen besteht⁸. Der gesamte Zyklus der Follikelentwicklung findet in der Hirnrinde statt. Erst im Alter von etwa fünf Monaten zeigt jedoch nur der linke Eierstock eine vollständige Entwicklungshierarchie von präovulatorischen (d. h. gelben) Follikeln, und das Huhn durchläuft seinen ersten Eisprung und seine erste Eiablage (Eiablage). Die präovulatorischen Follikel bilden eine grob sichtbare Hierarchie von etwa 5 bis 6 Follikeln, die vom größten und am nächsten eiförmigen Follikel - dem Follikel F1 - bis zum weniger entwickelten, kleinsten Follikel - F5 oder F6 - reichen. Präovulatorische Follikel sind aufgrund ihrer größeren Größe, ihrer großen Innervation und ihres tiefgelben Eigelbs leicht von den kleineren Follikeln vor der Rekrutierung zu unterscheiden.

Alle Follikel enthalten spezialisierte Zelltypen, die unterschiedliche Rollen bei der Signalübertragung, dem Wachstum und der Entwicklung des Follikels unterstützen, während er verschiedene Stadien vor dem Eisprung durchläuft - dies sind die Granulosazellen, Thekazellen und Eizellen (weibliche Gameten) (Abbildung 2A). Insbesondere bilden die Granulosazellschichten die Innenwand des Follikels, und die Thekazellen bilden die andere Wand, die die Eizelle umgibt. Wenn ein Follikel die präovulatorische Hierarchie durchläuft, beginnen die Zellschichten der Theka und der Granulosa dünner zu werden, insbesondere entlang eines Punktes direkt gegenüber dem Stiel des präovulatorischen Follikels. Der Stiel ist der Befestigungspunkt des Follikels am Eierstock (Abbildung 2B). Diese Linie der Granulosa- und Thekaschichten gegenüber dem Stiel wird als Narbe bezeichnet (Abbildung 2C). Es fehlt vollständig das Gefäßsystem und es wird der Punkt der Follikelruptur während des Eisprungs eines F1-Follikels sein. Ebenfalls sichtbar ist die Keimscheibe oder die flauschige weiße Schicht aus Stützzellen, die die Eizelle umgibt (Abbildung 2B).

Sowohl Granulosa- als auch Thekazellen sind Schlüsselkomponenten der Follikelentwicklung, da sie die Eizelle umgeben und durch komplexe hormonelle Signale unterstützen. Die Granulosazellschicht unterstützt steroidogene Signalwege über zyklische AMP (cAMP)-Signalwege, um die Progesteronproduktion zu bewirken ^9,10,11. Thekazellen hingegen produzieren zeitlich Östradiol, was sich stark von Säugetieren unterscheidet, deren Thekazellen Androgen und Progesteron produzieren 12,13,14. Zusammen mit externen Signalen sind die Granulosa- und Thekazellen entscheidende Treiber für die Follikelreifung und Eiablage. Die Technik der Trennung der Granulosa- und Thekaschicht wurde ursprünglich von Gilbert et al. im Jahr 1977 berichtet¹⁵. Eine umfassende Trennung der Granulosa- und Thekaschicht zu erreichen und sicherzustellen, dass kein Granulosamaterial zurückbleibt, kann bei der Gilbert-Methode zu Schwierigkeiten führen. Darüber hinaus kann das Fehlen einer klaren visuellen Anleitung für die Durchführung der Trennung die Durchführung der Aufgabe erschweren. Ziel dieser Studie ist es, die Extraktion und Trennung von Granulosa-, Theka- und Eizellschichten aus den präovulatorischen Follikeln zu beschreiben, Anpassungen anzubieten und eine klare visuelle Darstellung durch die Verwendung von Bildern und Videos zu liefern (Abbildung 3). Die Visualisierung dieser Technik wird es Wissenschaftlern, die Eierstockfollikel von Vögeln untersuchen, ermöglichen, Granulosa- und Thekaschichten sowohl für landwirtschaftliche als auch für biomedizinische Multi-Omics-Ansätze reproduzierbar zu erfassen.

Protokoll

Alle in dieser Studie verwendeten Tiere wurden gemäß dem vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Delaware (IACUC Protocol 110R) genehmigten Protokoll gehalten und eingeschläfert.

1. Vorbereitung

1. Sterilisation
   1. Autoklavieren Sie 5-Unzen-Glasschalen im Schwerkraftverdrängungsautoklavieren (121 °C für 20 Minuten), die mit Aluminiumfolie abgedeckt und mit Autoklavenklebeband bedeckt sind, um die Sterilität aufrechtzuerhalten und anzuzeigen.
      HINWEIS: Für jeden Follikel, an dem die Trennung durchgeführt wird, wird eine Schüssel benötigt.
   2. Autoklaven-Präparierwerkzeuge mit Schwerkraftverdrängungsautoklavieren (121 °C für 20 Minuten), einschließlich Scheren, gebogene Pinzetten und gerade Pinzetten in Sterilisationsbeuteln.
2. Einrichtung des Trennbereichs
   1. Richten Sie den Follikeltrennungsbereich ein, wie in Abbildung 4 zu sehen. Füllen Sie die Behälter kurz vor der Follikeltrennung mit Eis und füllen Sie sie während des Follikeltrennungsprozesses bei Bedarf auf.
3. Lösungen
   1. Auf 10x PBS-Konzentration auf 1x Arbeitsmaterial verdünnen und am Tag vor der Dissektion in den +4 °C Kühlschrank stellen.
   2. Verdünnen Sie das Isopropanol in der Sprühflasche auf eine Konzentration von 70 % des Arbeitsmaterials.

2. Präparieren

1. Euthanasiere einen geschlechtsreifen weiblichen Vogel.
   1. Wählen Sie einen geschlechtsreifen weiblichen Vogel (muss gerade Eier legen) und euthanasieren^{Sie 16} mit einer zugelassenen Methode (AVMA-Richtlinien) gemäß dem institutionellen Pflege- und Verwendungsprotokoll, wie z. B. Gebärmutterhalsluxation.
   2. Für die Aufnahme des größten F1-Follikels wird das Tier innerhalb der ersten 4 Stunden nach Lichtbeginn des Tages eingeschläfert. Palpieren Sie den Unterbauch vor der Euthanasie, um ein hartschaliges Ei in der Gebärmutter zu bestätigen; Dadurch wird sichergestellt, dass die Eiablage und damit der nächste Eisprung noch nicht stattgefunden hat.
2. Zugang zum Eierstock.
   1. Besprühen Sie den äußeren Kadaver und die Federn mit 70% Isopropanol. Dadurch werden die Federn angefeuchtet und die Schnittstelle gereinigt.
   2. Kneifen und schneiden Sie mit einer Präparierschere und einer behandschuhten Hand einen einzelnen horizontalen (quer) Mittellinienschnitt von etwa 7,5 cm (3 Zoll) Länge. Kneifen Sie die Haut-, Muskel- und Fettschichten vor dem Schnitt zusammen, um eine Punktion von Organen zu vermeiden.
   3. Erweitern Sie den Schnitt seitlich auf der rechten Seite des Vogels und tasten Sie mit behandschuhten Fingern ab, um die viszeralen Organe aus dem Weg der Schere zu schieben. So lange fortfahren, bis 2-3 der Rippen des Tieres auf der rechten Seite abgeschnitten sind.
   4. Erweitern Sie den Schnitt zur linken Seite des Vogels hin, wie Sie es auf der rechten Seite gemacht haben. Gehen Sie mit zusätzlicher Vorsicht vor, da sich die präovulatorischen Follikel des Eierstocks hier befinden, aus der Eierstockoberfläche herausragen und leicht reißen können. Üben Sie leichten Druck mit den Fingern aus, um die präovulatorischen Follikel von der Schere fernzuhalten, während 2-3 Rippen auf der linken Seite des Vogels geschnitten werden.
   5. Legen Sie eine Hand auf den Unterbauch des Vogels und die andere fest auf die Unterseite des Brustbeins und ziehen Sie die Brust des Vogels manuell nach oben zurück, um einen weiteren Zugang zur Zölomhöhle des Vogels zu ermöglichen.
   6. Halten Sie jeden Oberschenkel des Vogels nahe am Sprunggelenk und schieben Sie ihn manuell nach hinten, um beide Hüftgelenke gleichzeitig auszurenken. Es besteht nun ein vollständiger Zugang zum Eierstock, sowohl visuell als auch räumlich.
3. Entfernen Sie präovulatorische Follikel.
   1. Führen Sie alle Schritte mit routinemäßigem Sehvermögen aus. Wenn eine Person in irgendeinem Stadium Schwierigkeiten beim Sehen hat, verwenden Sie ein Präpariermikroskop.
   2. Schalen Sie jeden sichtbaren gelben präovulatorischen Follikel vorsichtig mit nur behandschuhten Fingern und ziehen Sie ihn aus dem Eierstock. Kneifen Sie während der Extraktion nur am Stiel, um den Stiel zu durchtrennen. Kneifen Sie nicht den Follikel selbst ein, da er sonst platzen kann.
   3. Legen Sie jeden Follikel in den sterilen Behälter mit eiskaltem PBS.
   4. Lassen Sie die präovulatorischen Follikel mindestens 5 Minuten auf Eis, damit das Eigelb erstarren kann. Das warme Eigelb haftet an den umgebenden follikulären Zellschichten, was die Durchführung der nachfolgenden Trenntechniken erschwert.

3. Trennung im Labor

1. Entnehmen Sie einen isolierten Follikel aus dem sterilen Behälter und legen Sie den Behälter mit den verbleibenden Follikeln wieder auf Eis. Untersuchen Sie den Follikel vor der Manipulation und notieren Sie sich die Position von drei Merkmalen: dem Stiel, der Narbe und der Keimscheibe (Abbildung 2).
2. Beginnen Sie damit, die Serosa von der Follikeloberfläche zu entfernen. Rollen Sie den Follikel vorsichtig über ein trockenes Papiertuch, um die Serosalschicht zu entfernen, und ziehen Sie sie bei Bedarf vorsichtig ab.
3. Halten Sie den Follikel am Stiel über die mit PBS gefüllte Schale. Verwenden Sie die Schwerkraft, um zu visualisieren, wo der Stiel an der Oberfläche des Follikels endet, und schneiden Sie mit einer Schere nur den Stiel ab, ohne die Follikeloberfläche zu durchstechen. Fahren Sie mit der Entfernung der Serosa fort, bis sie nicht mehr sichtbar ist.
4. Mit dem Leuchtkasten zur Beleuchtung und der Keimscheibe als Referenz verlagern Sie die Narbe auf die gegenüberliegende Seite und halten Sie den Follikel vorsichtig mit sichtbarer Narbenseite. Halten Sie den Follikel direkt über die Schüssel mit eiskaltem PBS.
5. Nehmen Sie das Skalpell, schneiden Sie vorsichtig entlang der Narbe und lassen Sie den Follikel sofort in das PBS fallen, wenn das Eigelb herauszufallen beginnt. Halten Sie den Follikel nicht fest, da dies das Eigelb herausdrückt, anstatt es einfach durch die Schwerkraft herausfallen zu lassen.
6. Ziehe mit einer geraden, ungezahnten Gewebezange vorsichtig die rosa Schicht der Follikelwand vom Eigelb auf einer Seite der Scheibe ab. Führen Sie diese Extraktion mit kleinen Kneif- und Zugbewegungen durch, die die Follikelwand vom Eigelb wegheben.
7. Die Schichttrennung funktioniert am besten, wenn jeweils etwa 5 mm Follikelwandgewebe vom Eigelb weggezogen wurden. Wenn ein 5 mm großer Abschnitt der Follikelwand erfolgreich aus dem Eigelb zurückgezogen wird, verwenden Sie eine abgewinkelte Pinzette in Verbindung mit der geraden Pinzette, um entlang der Follikelschale zu sondieren.
8. In einigen Fällen kann die Granulosaschicht enger mit dem Eigelb verbunden sein als die Thekaschicht. In dieser Situation bohren Sie einfach sehr vorsichtig über die Oberfläche des Eigelbs, indem Sie eine der beiden Pinzetten verwenden, um zu versuchen, die seidenpapierartige Schicht vom Eigelb wegzuziehen. Sobald sich die Granulosaschicht lokalisiert hat, kneifen Sie sie fest an die Thekaschicht und ziehen Sie beide Schichten wie zuvor beschrieben vom Eigelb weg.
9. Bürsten Sie das Eigelb mit der gebogenen Pinzette leicht von den eingeklemmten Schichten ab. Fegen Sie überschüssiges Eigelb aus der Schüssel oder entfernen Sie es. Kratzen Sie nicht an der Granulosaschicht; Dies führt zu Rissen. Starke Bewegungen trüben die PBS-Lösung und verringern die Visualisierung. Gehen Sie mit vorsichtigen und überlegten Bewegungen vor.
10. Nachdem jeder 5-10 mm große Abschnitt der Follikelwand zurückgezogen wurde, halten Sie inne, um die Theka- und Granulosaschichten in jede Pinzette zu nehmen und sicherzustellen, dass die beiden Schichten allmählich voneinander abgezogen werden, so wie sie beide vom Eigelb abgezogen werden. Setze diesen Vorgang um die Außenseite des Follikels fort. Wenn die Manipulation aufgrund des Lappens der Granulosa-Theka-Schicht schwierig wird, drehen Sie den Follikel, um den Vorgang von der anderen Seite der Scheibe aus zu beginnen.
11. Während des Trennungsprozesses wird die Keimscheibe (weibliche Gameten und Keimbläschen) angetroffen. Dies ist ein Bereich, der sowohl an der Granulosaschicht als auch am Eigelb extrem haftet. Nähern Sie sich vorsichtig der Keimscheibe und halten Sie mit der geraden Pinzette die Granulosaschicht fest an der Thekaschicht, da die gebogene Pinzette in leichten Bürstenbewegungen verwendet wird, um die Keimscheibe von den Granulosazellen weg auf die Dotteroberfläche zu drücken.
    1. Wird die Keimscheibe als Forschungsprobe gewünscht, bürsten Sie das Eigelb an dieser Stelle mit einer abgewinkelten Pinzette ab und lagern Sie es wie gewünscht.
12. Trennen Sie das Eigelb mit der gekrümmten Pinzette weiter von der Follikelwand, bis das Eigelb aus der gesamten Kugel des Follikels entfernt wurde.
13. Sobald der Rest des Eigelbs von den Schichten abgebürstet wurde, trenne den letzten Teil der Granulosaschicht von der Thekaschicht. Die vollständig abgetrennte Granulosaschicht ist möglicherweise nicht völlig frei von Dotter, aber stellen Sie sicher, dass sie nicht damit überzogen ist. Legen Sie die Granulosaschicht und die Thekalschicht in getrennte Behälter mit einer Temperatur von 4 °C PBS.
    1. Sobald sich die Granulosaschicht in einem von der Thekaschicht getrennten Behälter befindet, bewegen Sie die Thekaschicht im PBS vorsichtig mit einer Pinzette hin und her, um sicherzustellen, dass sich alle verbleibenden Reste der Granulosaschicht lösen.
       HINWEIS: Bestimmte Verarbeitungsmethoden nach der Trennung können je nach gewünschter Studie für die Entfernung von Lipidrückständen durch Aufschluss oder Zentrifugation verantwortlich sein.
    2. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal anwenden, bereiten Sie repräsentative getrennte Proben histologisch vor und analysieren Sie sie, um eine genaue Schichttrennung und -entnahme zu bestätigen.
       1. Zu diesem Zweck fixieren Sie Teile des abgetrennten Gewebes in neutral gepuffertem Formalin mit Hilfe von Netzgewebekassetten oder Schwämmen, um einen Probenverlust zu verhindern, und betten Sie den Schnitt dann in Paraffin ein, schneiden Sie ihn und färben Sie ihn mit Hämatoxylin und Eosin (H&E).
       2. Aufgrund ihrer empfindlichen Beschaffenheit sollten Sie die Granulosaschicht vorsichtig handhaben und auf Biopsieschwämme in einer histologischen Kassette legen, um sicherzustellen, dass die Zellschicht intakt bleibt.
       3. Legen Sie die Thekaschicht direkt in eine histologische Kassette. Auf diese Weise kann auch der Grad der Probenkontamination durch anderes Follikelgewebe (d. h. Granulosa-Zellschichtprobe mit Anhaftung von Dotterprotein oder Thekalzellen) sichtbar gemacht werden.
          HINWEIS: Aufgrund der engen Assoziation von Follikelgeweben ist es möglicherweise nicht immer möglich, nur eine einzige interessante Schicht zu erhalten. Die Kenntnis des Ausmaßes der möglichen Kontamination kann jedoch die Interpretation nachfolgender Multi-Omics-Ansätze beeinflussen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll führt zur Trennung der Granulosa- und Thekalzellschichten vom Ovarialfollikel (Abbildung 5 und Abbildung 6). Diese Schichten können dann für die histologische Untersuchung vorbereitet werden, um eine erfolgreiche Trennung zu bestätigen. Diese histologischen Bilder, die von einem staatlich geprüften Veterinärpathologen (EMB) überprüft und aufgenommen wurden, zeigen deutlich die effektive Trennung der Gran...

Diskussion

Diese Studie beschreibt das Verfahren zur eindeutigen Trennung von Granulosa- und Thekalzellschichten von präovulatorischen Follikeln bei Geflügel. Im Gegensatz zu der bestehenden Methode, die 1977 von Gilbert et al. etabliert wurde, ermöglichen die bei dieser Methode vorgenommenen Anpassungen eine kontrolliertere Umgebung bei der manuellen Trennung der Granulosazellschicht von der Thekaschicht von allen präovulatorischen Follikeln¹⁵. Darüber hinaus ermöglic...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 in. Small Glass Bowls, 5 oz	Amazon	B0BXP5PJTN	Autoclavable glass bowls of at least 3.5 in. diameter
Aluminum Foil	Costco	720	Cover autoclave bowls
Amazon Pet Training Pads, Regular, 100-Count	Amazon	B0B58WTPFS	For use as necrospy pads, any absorbant pad will work
Autoclave Tape	Fisherbrand	15-901-111
Cole-Parmer LED Fiber Optic Illuminators	Cole-Parmer	EW-41723-02
Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-123	Non-Serrated
Dissecting Microscope	Leica	S6E
Fine Precision Scissors	Fisherbrand	12-000-155	Non-Serrated
Food Container Boxes with Lid Set of 17 Clear/Green Microwave Freezer Dishwasher Safe	Amazon	B09QGZCRDB	Use any container that can hold ice AND an 3.5 in. small glass bowl
High Precision 45 Degree Curved Tapered Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-125	Non-Serrated
High Precision Straight Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	16-100-120	Non-Serrated
Isopropanol	Fisherbrand	A426P-4
McKesson Specimen Container, Sterile, Screw Cap, Leak-Resistant, 120 mL	McKesson	16-9526	4 oz. / 120 cc, graduated
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.6	ThermoFisher	J62692.K7	Will need to be made into 1x PBS
Spray Bottle	Cole-Parmer	EW-06091-01	For 70% Isopropanol
Sterile Surgical Blades #22	Cincinnati Surgical	122
Sterilization Pouches 10" x 16"	Amazon	B07MFB455C
Tapered Ultrafine Tip Forceps Fisherbrand	Fisherbrand	16-100-121	Non-Serrated
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisherbrand	22-038-221
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Chemical	SF98-4
Tissue processing/embedding cassettes with lid	Simport M490-2	Z672122