Séparation des couches de granulosa du follicule préovulatoire aviaire et de cellules thèques pour les applications en aval

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour séparer les cellules vitellines, les cellules de la granulosa et les cellules thèques dans les follicules préovulatoires aviaires. Cette manipulation de précision permet des études critiques sur le rôle de ces couches dans la fonction reproductive, aidant à la compréhension du développement folliculaire, de la régulation hormonale et de la recherche sur les maladies pour améliorer le rendement agricole et les connaissances biomédicales.

Résumé

Les poules pondeuses (poules pondeuses) et les reproducteurs de poulets de chair (reproducteurs de poulets de chair) sont essentiels à l’approvisionnement alimentaire mondial en tant que source fiable de protéines. Ils constituent également un modèle animal émergent pour l’étude des maladies reproductives humaines. Au fur et à mesure que le domaine de la recherche avicole se développe, la santé et la fonction de l’ovaire de la poule pondeuse et du poulet de chair reproducteur seront un point d’étude important pour les chercheurs agricoles et biomédicaux. L’un des défis posés par cet intérêt émergent est la nécessité de disposer de techniques reproductibles que tous les chercheurs peuvent utiliser pour la collecte d’échantillons ovariens. En particulier, un processus visuel détaillé doit être établi pour définir la séparation appropriée des couches de cellules de la granulosa et de la thèque des follicules de poule afin d’obtenir un accord et une cohérence entre les chercheurs.

Cette étude décrit l’extraction des follicules préovulatoires et du tissu ovaire chez des poules blanches Leghorn en âge de se reproduire. La séparation de ces follicules est effectuée dans des conditions froides et liquides afin de figer le jaune pour une manipulation plus facile et pour éviter que le poids du follicule ne déchire les couches cellulaires pendant le processus de séparation. Une fois la séparation terminée, les couches cellulaires souhaitées peuvent être digérées davantage pour les approches de culture tissulaire ou peuvent être cryoconservées pour des analyses génomiques et protéomiques.

Introduction

Les poules productrices d’œufs sont un élément clé de la chaîne d’approvisionnement alimentaire mondiale et constituent un modèle animal évolutif pour l’étude de la fertilité et du cancer de l’ovaire. Le poulet a une longue histoire d’utilisation en laboratoire, des études in ovo des vaccins antigrippaux¹ à l’étude de la croissance tumorale cancéreuse², et est un animal clé pour la compréhension du développement gonadique ^3,4,5. Comprendre le rôle du système reproducteur d’une poule, en particulier, la nature cyclique du développement folliculaire ovarien et les types de cellules impliquées, est un domaine de grand intérêt et d’application potentielle. Les approches multi-omiques pour interroger l’ovaire de la poule ont des applications pour augmenter le rendement agricole grâce à l’analyse de la productivité et à l’élucidation des facteurs de santé humaine par le biais de la poule comme modèle pour les maladies reproductives.

L’ovaire aviaire a des stades folliculaires de développement très distincts composés de (1) petits follicules primordiaux et primaires (>1 mm), (2) follicules de pré-recrutement de taille variable (blancs à jaune pâle, 2-8 mm) et (3) grands follicules préovulatoires remplis de vitellus (jaunes) (Figure 1)^5,6,7. Un ovaire aviaire sexuellement mature est composé d’un cortex externe qui abrite les follicules ovariens et de la moelle interne composée de muscles lisses, de nerfs et d’un système vasculaire⁸. L’ensemble du cycle de développement folliculaire se déroule dans le cortex. Cependant, ce n’est qu’à l’âge de cinq mois environ que seul l’ovaire gauche présente une hiérarchie de développement complète de follicules préovulatoires (c’est-à-dire jaunes), et que la poule subira sa première ovulation et ponte (ponte). Les follicules préovulatoires établissent une hiérarchie grossièrement visible d’environ 5 à 6 follicules qui vont du follicule le plus grand et le plus proche de l’ovulation - follicule F1 - au follicule le moins développé et le plus petit - F5 ou F6. Les follicules préovulatoires se distinguent facilement des follicules de pré-recrutement plus petits en raison de leur taille plus grande, de leur vaste innervation et de leur jaune foncé.

Tous les follicules contiennent des types de cellules spécialisées qui jouent des rôles variés dans la signalisation, la croissance et le développement du follicule au fur et à mesure qu’il progresse à travers les différentes étapes avant l’ovulation - il s’agit des cellules de la granulosa, des cellules thèques et des ovocytes (gamètes femelles) (Figure 2A). En particulier, les couches cellulaires de la granulosa créent la paroi interne du follicule, et les cellules de la thèque forment l’autre paroi entourant l’ovocyte. Au fur et à mesure qu’un follicule progresse dans la hiérarchie préovulatoire, les couches cellulaires de la thèque et de la granulosa commencent à s’amincir, en particulier le long d’un point directement situé en face de la tige du follicule préovulatoire. La tige est le point d’attache du follicule à l’ovaire (Figure 2B). Cette ligne des couches de la granulosa et de la thèque opposée à la tige s’appelle le stigmate (Figure 2C). Il est totalement dépourvu de système vasculaire et sera le point de rupture folliculaire lors de l’ovulation d’un follicule F1. Le disque germinal, ou la couche blanche duveteuse de cellules de soutien qui entoure l’ovocyte, est également visible (Figure 2B).

Les cellules de la granulosa et de la thèque sont des composants clés du développement du follicule, car elles entourent et soutiennent l’ovocyte grâce à une signalisation hormonale complexe. La couche cellulaire de la granulosa soutient les voies stéroïdogènes via la signalisation AMP cyclique (AMPc) pour provoquer la production de progestérone ^9,10,11. Les cellules thèques, quant à elles, produisent temporellement de l’œstradiol, ce qui est largement différent de celui des mammifères dont les cellules théques produisent des androgènes et de la progestérone 12,13,14. Associées à la signalisation externe, les cellules de la granulosa et de la thèque sont des moteurs cruciaux de la maturation des follicules et de la ponte. La technique de séparation des couches de la granulosa et de la thèque a été signalée pour la première fois par Gilbert et al. en 1977¹⁵. Obtenir une séparation complète des couches de la granulosa et de la thèque et s’assurer qu’aucun matériau de la granulosa ne reste peut présenter des difficultés avec la méthode Gilbert. De plus, l’absence d’un guide visuel clair pour effectuer la séparation peut rendre la tâche difficile à réaliser. Cette étude vise à décrire l’extraction et la séparation des couches de granulosa, de thèque et d’ovocytes des follicules préovulatoires, en offrant des adaptations et en fournissant une représentation visuelle claire à l’aide d’images et de vidéos (Figure 3). La visualisation de cette technique permettra aux scientifiques qui étudient les follicules ovariens aviaires de capturer de manière reproductible les couches de la granulosa et de la thèque pour les approches multi-omiques agricoles et biomédicales.

Protocole

Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été maintenus et euthanasiés conformément au protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Delaware (IACUC Protocol 110R).

1. Préparation

1. Stérilisation
   1. Autoclave Bols en verre de 5 oz utilisant l’autoclave par gravité (121 °C pendant 20 min) recouverts d’une feuille d’aluminium avec du ruban autoclave sur le dessus pour maintenir et indiquer la stérilité.
      REMARQUE : Un bol sera nécessaire pour chaque follicule sur lequel la séparation est effectuée.
   2. Outils de dissection en autoclave utilisant l’autoclave par déplacement par gravité (121 °C pendant 20 min), y compris des ciseaux, des pinces courbes et des pinces droites dans les poches de stérilisation.
2. Mise en place de la zone de séparation
   1. Configurez la zone de séparation des follicules comme le montre la figure 4. Remplissez les récipients de stockage avec de la glace juste avant la séparation des follicules et remplissez-les si nécessaire tout au long du processus de séparation des follicules.
3. Solutions
   1. Diluer à 10x la concentration PBS pour 1x le stock de travail et placer au réfrigérateur à +4 °C la veille de la dissection.
   2. Diluer l’isopropanol à 70 % de la concentration de la matière première dans le flacon pulvérisateur.

2. Dissection

1. Euthanasier une femelle sexuellement mature.
   1. Choisissez une femelle sexuellement mature (elle doit pondre des œufs) et euthanasiez-le¹⁶ par une méthode approuvée (directives de l’AVMA) conformément au protocole de soins et d’utilisation de l’établissement, comme la luxation cervicale.
   2. Pour la capture du plus grand follicule F1, euthanasier l’animal dans les 4 premières heures suivant l’apparition de la lumière pour la journée. Palper le bas-ventre avant l’euthanasie pour confirmer la présence d’un œuf à coquille dure dans l’utérus ; Cela permet de s’assurer que la ponte et, par conséquent, la prochaine ovulation n’ont pas encore eu lieu.
2. Accédez à l’ovaire.
   1. Vaporisez la carcasse externe et les plumes avec 70 % d’isopropanol. Cela humidifie les plumes et nettoie le point d’incision.
   2. À l’aide de ciseaux de dissection et d’une main gantée, pincez et coupez une seule incision horizontale (transversale) de la ligne médiane d’environ 7,5 cm (3 pouces) de long. Pincez la peau, les muscles et les couches de graisse avant l’incision pour éviter la perforation des organes.
   3. Élargissez l’incision latéralement sur le côté droit de l’oiseau et sondez avec des doigts gantés pour pousser les organes viscéraux hors du chemin des ciseaux. Continuez jusqu’à ce que 2-3 des côtes de l’animal aient été coupées sur le côté droit.
   4. Élargissez l’incision vers le côté gauche de l’oiseau comme fait sur le côté droit. Procédez avec une prudence accrue car les follicules préovulatoires de l’ovaire sont situés ici, dépassent de la surface de l’ovaire et peuvent facilement se rompre. Utilisez une légère pression avec les doigts pour éloigner les follicules préovulatoires des ciseaux pendant que 2-3 côtes sont coupées sur le côté gauche de l’oiseau.
   5. Placez une main sur le bas-ventre de l’oiseau et l’autre fermement sur le dessous du sternum, et rétractez manuellement la poitrine de l’oiseau vers le haut pour permettre un accès supplémentaire à la cavité cœlomique de l’oiseau.
   6. En tenant chacune des cuisses de l’oiseau près de l’articulation du jarret, poussez-les manuellement vers l’arrière pour disloquer les deux articulations de la hanche simultanément. Il y a maintenant un accès complet à l’ovaire à la fois visuellement et spatialement.
3. Retirez les follicules préovulatoires.
   1. Effectuez toutes les étapes par une vue visuelle de routine. Si une personne a du mal à visualiser à n’importe quel stade, utilisez un microscope à dissection.
   2. En utilisant uniquement des doigts gantés, coupez doucement chaque follicule préovulatoire jaune visible et extrayez-le de l’ovaire. Pincez uniquement la tige pendant l’extraction pour aider à sectionner la tige. Ne pincez pas le follicule lui-même, sinon il pourrait se rompre.
   3. Placez chaque follicule dans le récipient stérile avec du PBS glacé.
   4. Laissez les follicules préovulatoires sur de la glace pendant au moins 5 minutes pour permettre la congélation du jaune. Le jaune chaud adhérera aux couches de cellules folliculaires environnantes, ce qui rendra les techniques de séparation ultérieures difficiles à réaliser.

3. Séparation en laboratoire

1. Prenez un follicule isolé du récipient stérile et remettez le récipient avec les follicules restants sur de la glace. Étudiez le follicule avant la manipulation, en prenant note de l’emplacement de trois caractéristiques : la tige, le stigmate et le disque germinatif (Figure 2).
2. Commencez par retirer la séreuse de la surface folliculaire. Roulez doucement le follicule sur une serviette en papier sèche pour enlever la couche séreuse, en la retirant doucement si nécessaire.
3. Tenez le follicule par la tige au-dessus du bol rempli de PBS. Utilisez la gravité pour visualiser où la tige se termine à la surface du follicule et, à l’aide de ciseaux, coupez uniquement la tige sans perforer la surface du follicule. Poursuivez l’ablation de la séreuse jusqu’à ce qu’elle ne soit plus visible.
4. À l’aide de la boîte lumineuse pour éclairer et du disque germinal comme référence, déplacez le stigmate du côté opposé et tenez doucement le follicule avec le côté du stigmate visible. Tenez le follicule directement au-dessus du bol de PBS glacé.
5. Prenez le scalpel, coupez doucement le long du stigmate et déposez immédiatement le follicule dans le PBS lorsque le jaune commence à tomber. Ne tenez pas le follicule fermement, car cela pousserait le jaune vers l’extérieur au lieu de le laisser tomber simplement par gravité.
6. À l’aide d’une paire de pinces à tissu droites non dentées, retirez délicatement la couche rose de la paroi folliculaire du jaune d’un côté de la tranche. Terminez cette extraction à l’aide de petits mouvements de pincement et de traction qui soulèvent la paroi du follicule pour l’éloigner du jaune.
7. La séparation des couches fonctionne mieux lorsqu’environ 5 mm de tissu de la paroi folliculaire ont été rétractés loin du jaune à la fois. Lorsqu’une section de 5 mm de la paroi folliculaire est rétractée avec succès du vitellus, utilisez une pince coudée en tandem avec la pince droite pour sonder le long de la coquille du follicule.
8. Dans certains cas, la couche de granulosa peut être plus étroitement associée au jaune que la couche de thèque. Dans cette situation, il suffit de sonder très doucement la surface du jaune à l’aide de l’une ou l’autre paire de pinces pour essayer de retirer la couche semblable à du papier de soie du jaune. Une fois que la couche de granulosa a été localisée, pincez-la solidement à la couche de thèque et procédez au retrait des deux couches du jaune comme décrit précédemment.
9. À l’aide de la pince incurvée, brossez légèrement le jaune pour l’éloigner des couches pincées. Balayez ou retirez l’excédent de jaune du bol. Ne grattez pas la couche de granulosa ; Cela provoquera des déchirures. Des mouvements vigoureux obscurcissent la solution PBS et réduisent la visualisation. Procédez avec des mouvements prudents et délibérés.
10. Après que chaque section de 5 à 10 mm de la paroi folliculaire est rétractée, faites une pause pour prendre les couches de thèque et de granulosa dans chaque ensemble de pinces et assurez-vous que les deux couches sont décollées l’une de l’autre progressivement, tout comme elles sont toutes deux retirées du jaune. Continuez ce processus autour de l’extérieur du follicule. Si la manipulation devient difficile en raison du lambeau de la couche de granulosa-thèque, tournez le follicule pour commencer le processus de l’autre côté de la tranche.
11. Au cours du processus de séparation, le disque germinatif (gamète femelle et vésicule germinale) sera rencontré. Il s’agit d’une zone qui adhère extrêmement à la fois à la couche de granulosa et au jaune. Approchez-vous du disque germinal avec précaution, à l’aide de la pince droite pour maintenir fermement la couche de granulosa sur la couche de thèque, tandis que la pince incurvée est utilisée dans de légers mouvements de brossage pour pousser le disque germinal loin des cellules de la granulosa sur la surface du vitellus.
    1. Si le disque germinal est souhaité comme spécimen de recherche, brossez le jaune à ce stade avec une pince coudée et rangez-le comme vous le souhaitez.
12. Continuez à séparer le jaune de la paroi folliculaire avec la pince incurvée jusqu’à ce que toute la sphère du follicule ait eu son jaune retiré.
13. Une fois que le reste du jaune a été brossé des couches, séparez la dernière partie de la couche de granulosa de la couche de thèque. La couche de granulosa entièrement séparée n’est peut-être pas entièrement dépourvue de matière vitelline, mais assurez-vous qu’elle n’en est pas recouverte. Placez la couche de granulosa et la couche calique dans des récipients séparés avec une température PBS de 4 °C.
    1. Une fois que la couche de granulosa se trouve dans un récipient séparé de la couche de granulosa, agitez doucement la couche de granulosa d’avant en arrière dans le PBS avec une pince pour vous assurer que tous les restes restants de la couche de granulosa se détachent.
       REMARQUE : Certaines méthodes de traitement après la séparation peuvent tenir compte de l’élimination des débris lipidiques par digestion ou centrifugation, selon l’étude souhaitée.
    2. Lorsque vous pratiquez cette technique pour la première fois, préparez et analysez histologiquement des échantillons représentatifs séparés pour confirmer la séparation et la collecte précises des couches.
       1. Pour ce faire, fixez des parties des tissus séparés dans du formol tamponné neutre à l’aide de cassettes de tissus en maille ou d’éponges pour éviter la perte d’échantillons, puis incorporez de la paraffine, sectionnez et colorez la section avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E).
       2. En raison de sa nature délicate, manipulez et placez soigneusement la couche de granulosa sur des éponges de biopsie dans une cassette histologique pour vous assurer que la couche cellulaire reste intacte.
       3. Placez la couche de thèque directement dans une cassette histologique. Cela permettra également de visualiser le niveau de contamination de l’échantillon par d’autres tissus folliculaires (c’est-à-dire un échantillon de couche cellulaire de la granulosa avec adhérence de la protéine jaune ou des cellules thécales).
          REMARQUE : Il n’est pas toujours possible d’obtenir une seule couche d’intérêt en raison de l’association étroite des tissus folliculaires. Cependant, la connaissance du niveau de contamination possible peut éclairer l’interprétation des approches multi-omiques ultérieures.

Résultats

Ce protocole permet de séparer les couches de la granulosa et des cellules thécales du follicule ovarien (Figure 5 et Figure 6). Ces couches peuvent ensuite être préparées pour un examen histologique afin de confirmer la réussite de la séparation. Ces images histologiques, examinées et capturées par un pathologiste vétérinaire certifié (EMB), démontrent clairement la séparation efficace des couches de la granulosa ...

Discussion

Cette étude décrit la procédure de séparation distincte de la granulosa et des couches cellulaires thécales des follicules préovulatoires chez la volaille. Contrairement à la méthode existante établie par Gilbert et al. en 1977, les adaptations apportées à cette méthode permettent un environnement plus contrôlé lors de la séparation manuelle de la couche de cellules de la granulosa de la couche de thèque de tous les follicules préovulatoires¹⁵. De...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 in. Small Glass Bowls, 5 oz	Amazon	B0BXP5PJTN	Autoclavable glass bowls of at least 3.5 in. diameter
Aluminum Foil	Costco	720	Cover autoclave bowls
Amazon Pet Training Pads, Regular, 100-Count	Amazon	B0B58WTPFS	For use as necrospy pads, any absorbant pad will work
Autoclave Tape	Fisherbrand	15-901-111
Cole-Parmer LED Fiber Optic Illuminators	Cole-Parmer	EW-41723-02
Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-123	Non-Serrated
Dissecting Microscope	Leica	S6E
Fine Precision Scissors	Fisherbrand	12-000-155	Non-Serrated
Food Container Boxes with Lid Set of 17 Clear/Green Microwave Freezer Dishwasher Safe	Amazon	B09QGZCRDB	Use any container that can hold ice AND an 3.5 in. small glass bowl
High Precision 45 Degree Curved Tapered Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-125	Non-Serrated
High Precision Straight Very Fine Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	16-100-120	Non-Serrated
Isopropanol	Fisherbrand	A426P-4
McKesson Specimen Container, Sterile, Screw Cap, Leak-Resistant, 120 mL	McKesson	16-9526	4 oz. / 120 cc, graduated
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.6	ThermoFisher	J62692.K7	Will need to be made into 1x PBS
Spray Bottle	Cole-Parmer	EW-06091-01	For 70% Isopropanol
Sterile Surgical Blades #22	Cincinnati Surgical	122
Sterilization Pouches 10" x 16"	Amazon	B07MFB455C
Tapered Ultrafine Tip Forceps Fisherbrand	Fisherbrand	16-100-121	Non-Serrated
Foam Biopsy Pads, Rectangular	Fisherbrand	22-038-221
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Chemical	SF98-4
Tissue processing/embedding cassettes with lid	Simport M490-2	Z672122