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  • Resumen
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  • Protocolo
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo demuestra la técnica de aspiración orofaríngea para su uso en el modelo murino de fibrosis pulmonar con bleomicina.

Resumen

La enfermedad pulmonar intersticial (EPI) representa un amplio espectro de trastornos caracterizados por la cicatrización progresiva y a menudo irreversible del parénquima pulmonar, siendo la más común la fibrosis pulmonar idiopática (FPI). Se han desarrollado varios modelos animales de fibrosis pulmonar idiopática, siendo el modelo murino de bleomicina el más utilizado. La bleomicina es un quimioterapéutico conocido por inducir daño en el ADN en el epitelio alveolar, lo que resulta en lesión pulmonar aguda y fibrosis pulmonar en humanos. Los modelos de roedores de la FPI utilizan la administración de bleomicina a través de varios métodos, siendo el más común el intratraqueal (IT). Recientemente, se ha demostrado que la técnica de aspiración orofaríngea (OA) es tan eficaz como la IT para múltiples agentes fibrosantes, con considerablemente menos efectos secundarios y una vía de administración más fácil. Este protocolo detalla el método de administración de bleomicina en el pulmón murino y destaca ejemplos de posibles aplicaciones posteriores para la cuantificación de datos. Esta metodología ofrece una forma sencilla, rápida y segura de utilizar este modelo animal ampliamente utilizado para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la FPI.

Introducción

La enfermedad pulmonar intersticial (EPI) se refiere a un grupo heterogéneo de trastornos caracterizados por la cicatrización progresiva e irreversible del espacio alvéolo, el intersticio y las vías respiratorias distales1. La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es la forma más común de EPI y conlleva una mediana de supervivencia de aproximadamente tres años2. La fibrosis pulmonar idiopática es una afección terminal, y el trasplante de pulmón ortotópico es una terapia de rescate para pacientes seleccionados. Actualmente existen dos terapias aprobadas por la FDA para la FPI, las cuales simplemente ralentizan la tasa de progresión en lugar de estabilizar o mejorar la función pulmonar de los pacientes 3,4. Se están llevando a cabo importantes esfuerzos de investigación para dilucidar los fundamentos de la FPI e identificar nuevas dianas terapéuticas. Existen innumerables modelos animales para estudiar la patogénesis de la FPI, cada uno con sus propias ventajas y desventajas5. Si bien ningún modelo es capaz de recapitular completamente la complejidad de las enfermedades humanas, estos enfoques ofrecen una visión significativa de los mecanismos moleculares de la FPI y pueden complementar los estudios traslacionales.

El modelo murino de bleomicina sigue siendo el modelo in vivo más ampliamente utilizado y mejor caracterizado de la FPI6. La bleomicina es un agente peptídico que induce roturas de ADN monocatenario y bicatenario. Tras su descubrimiento en 1962, se descubrió que la bleomicina era eficaz en el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluidos los tumores testiculares y el linfoma, sin embargo, su uso se ha visto limitado por la neumonitis dependiente de la dosis y la fibrosis pulmonar resultante 7,8. Esta toxicidad pulmonar se recapitula en ratones. Cuando se administra en una sola dosis, después de una fase inflamatoria inicial, la fibrosis puede observarse comenzando cerca del día 5, alcanzando su punto máximo en los días 14-21 9,10,11 (Figura 1). La resolución espontánea ocurre después de aproximadamente 6 semanas, aunque se pueden lograr cambios fibróticos permanentes con dosis repetidas12. Dada la naturaleza transitoria e inflamatoria, existen algunos inconvenientes inherentes con el modelo de bleomicina13, sin embargo, ofrece un sistema rápido, robusto y reproducible para comenzar a responder algunas de las principales brechas en la comprensión de la EPI en nuestro campo y permite a los investigadores comparar los resultados de las últimas cinco décadas. Otros enfoques de instalación incluyen los modelos murinos de asbestosis y sílice, que ofrecen cursos de tiempo similares (días 14-28)6,14,15,16. Sin embargo, estos modelos generan un patrón histológico más consistente con la neumoconiosis que con la FPI y requieren el uso de partículas en el aire, lo que requiere un manejo cuidadoso. Alternativamente, existen modelos animales que utilizan la expresión de transgenes impulsados por el epitelio, como la toxina diftérica y el TGF-β1. Estos recapitulan la lesión de células epiteliales alveolares no inflamatorias de tipo 2 observada en la FPI, sin embargo, toman un poco más de tiempo (21-30d) y requieren el uso de animales especializados que deben retrocruzarse con cualquier modelo transgénico existente de interés. Por último, se ha demostrado que la sobreexpresión de citocinas mediada por adenovirales, incluidos TGF-β1, IL-β1 y TNF-α, induce fibrosis pulmonar en roedores, generalmente en el día14 17,18,19. Estos modelos de sobreexpresión de citocinas permiten una administración intranasal conveniente, aunque requieren una purificación y manipulación cuidadosas.

Existen múltiples abordajes para la administración de bleomicina, incluyendo vía intratraqueal (IT), intranasal, intraperitoneal, subcutánea e intravenosa6. El tratamiento IT es el más común, tradicionalmente la intubación endotraqueal o la traqueostomía quirúrgica20, ambos requieren sedación profunda, finura técnica y se asocian con morbimortalidad perioperatoria. Recientemente, la técnica de aspiración orofaríngea (OA) ha demostrado ser tan eficaz como la IT, con considerablemente menos efectos secundarios y una vía de administración más fácil 14,21,22,23,24,25,26. Aquí, presentamos un protocolo visual detallado para el método de OA de administración de bleomicina en el pulmón murino y destacamos varias aplicaciones potenciales posteriores para la cuantificación de datos.

Protocolo

Los estudios en animales descritos en estos experimentos se llevaron a cabo bajo los protocolos (ARC-2021-025, ARC-2010-039) aprobados por el Comité de Investigación Animal (ARC) de UCLA y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Se mantuvo el cumplimiento total de todas las regulaciones y políticas estatales y federales con respecto al uso de animales de laboratorio. Los animales fueron alojados en el Centro de Cuidado Animal de UCLA y atendidos por el personal calificado de la División de Medicina de Laboratorio y Animal (DLAM) de UCLA en condiciones libres de patógenos. Los ratones silvestres C57BL/6 se obtuvieron comercialmente y se les permitió aclimatarse durante al menos 14 días. Para estos estudios se utilizaron ratones macho de 8 a 12 semanas de edad, con un peso corporal medio de 20 a 25 g. También se pueden utilizar ratones hembra, aunque es importante que los animales coincidan por sexo y edad en todos los grupos y condiciones experimentales27. Los detalles comerciales de los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Administración orofaríngea de bleomicina

  1. Preparación de bleomicina
    NOTA: Utilice bleomicina de grado farmacéutico para garantizar la consistencia y la reproducibilidad entre los animales y los experimentos. Dosis de bleomicina en unidades de fármaco por kg de animal (U/kg), no miligramos (mg) por kg.
    1. Disuelva el polvo de bleomicina en PBS estéril de grado farmacéutico hasta una concentración de 10 U/mL. La bleomicina debe prepararse bajo una cubierta química utilizando las precauciones quimioterapéuticas adecuadas. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
    2. Preparar la concentración de trabajo final. La dosis se basa en el peso (0,5-3 U/kg) y se realizan los ajustes necesarios en función de la bleomicina utilizada y del propósito del experimento (por ejemplo, supervivencia o dosis letal).
    3. Ajuste el volumen final de administración según sea necesario. Para estos estudios, diluya la bleomicina a 0,375 U/mL, lo que equivale a 50 μL para un ratón de 25 g, lo que da como resultado una concentración de trabajo final de 0,75 U/kg.

2. Inducción de la anestesia

  1. Prepare el cóctel de anestesia diluyendo ketamina y xilacina en PBS a concentraciones de trabajo de 10 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente. Realice este paso en condiciones estériles utilizando reactivos de grado farmacéutico y de acuerdo con los protocolos aprobados institucionalmente.
  2. Administrar 10 μL del cóctel por gramo de peso corporal del animal (concentración de trabajo: ketamina 100 mg/kg, xilacina 10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal utilizando una aguja de 27,5 G y una jeringa de 1 mL.
    1. Asegúrese de que el ratón esté correctamente anestesiado y no responda a estímulos nocivos, como el pellizco en los dedos de los pies. Los efectos deberían verse en 5 minutos. Si aún responde, administre ketamina/xilacina adicional en incrementos de 20 μL hasta alcanzar el nivel deseado de anestesia. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad ocular mientras está bajo anestesia.
      NOTA: Se prefiere la ketamina sobre otros anestésicos y sedantes inyectados debido a su perfil de efectos secundarios favorables. Tiene efectos mínimos sobre la hemodinámica, incluida la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria. El isoflurano inhalado se puede utilizar como agente anestésico alternativo. En estos estudios, se prefiere la ketamina/xilacina porque produce una sedación prolongada y una tos o reflujo mínimos de bleomicina después de la administración.

3. Administración orofaríngea

  1. Una vez debidamente sedado, suspenda el ratón en la plataforma de procedimiento en un ángulo de 60°-80° colgándolo por sus incisivos frontales para abrir eficazmente la orofaringe (Figura 2A).
  2. Ocluye las fosas nasales con una pinza microvascular lisa, obligando al ratón a respirar a través de su orofaringe.
  3. Retraiga la lengua fuera de la orofaringe con fórceps.
  4. Con una pipeta escalonada con punta de leur-stub, coloque suavemente el volumen deseado de bleomicina, o control salino, en la parte posterior de la orofaringe. Asegúrese de que una burbuja de líquido sea muy visible (Figura 2B).
  5. Continúe sosteniendo la lengua en su lugar hasta que el animal aspire la solución. Esto debe ser visible y, a menudo, audible.
    NOTA: Si el animal aspira rápidamente la solución, la visualización en la parte posterior de la orofaringe puede ser transitoria, en pocos segundos. De todos modos, si tiene éxito, el animal demostrará un cambio abrupto y transitorio en su patrón de respiración, tomando respiraciones rápidas y poco profundas. Puede producirse un burbujeo del líquido, lo que indica que el líquido ha entrado con éxito en el tracto respiratorio inferior. También puede causar tos ocasional. Por lo general, se trata de un volumen insignificante de la solución de bleomicina y no debería afectar a los resultados experimentales, permitiendo que el animal permanezca incluido en el estudio. Evite la dosificación repetitiva, ya que aumenta el riesgo de asfixia y altera la dosis final basada en el peso.
  6. Una vez confirmada la aspiración, retire con cuidado la pinza nasal.
  7. Observe al animal en posición de suspensión durante 15-30 s para asegurarse de que no haya reflujo de la solución de bleomicina, luego devuélvalo a su jaula.
    NOTA: Se recomienda un volumen máximo de 50 μL para minimizar el riesgo de asfixia. Dependiendo de la dosis deseada de bleomicina y del peso del ratón, ajuste la concentración de la solución de bleomicina según sea necesario. Cuando practiques esta técnica, usa un tinte a base de agua como el azul de Evans para confirmar que la solución se administra en el tracto respiratorio inferior, en lugar de en el estómago.

4. Recuperación de animales

  1. Después del tratamiento, coloque al animal de lado en su jaula con una almohadilla térmica debajo para mantener la termoneutralidad.
  2. Monitorea a los ratones hasta que estén completamente conscientes. Esto suele tardar entre 1 y 2 horas, dependiendo de la dosis de ketamina utilizada y del metabolismo del animal. Pellizque suavemente los dedos de los pies y mantenga a los animales eutérmicos para facilitar el despertar.
  3. Monitoree clínicamente a los ratones a diario para detectar cambios en el peso corporal, el aseo, el nivel de actividad y el estado respiratorio. Al igual que otros métodos de administración de bleomicina, los animales pueden experimentar una pérdida de peso significativa durante el curso de 14 a 21 días, que es un marcador clave de la eficacia del modelo.
  4. Según los protocolos de ARC e IACUC, se sacrifica a los animales si la pérdida de peso supera el 20% del peso inicial del animal. La prevalencia y la gravedad de la pérdida de peso dependen de la dosis de bleomicina utilizada y de la demografía de los ratones (véase más arriba).

5. Recolección de tejidos, procesamiento y análisis de puntos finales

  1. Dependiendo de la pregunta experimental y el momento deseado, se debe sacrificar a los ratones siguiendo los protocolos de la IACUC y extraer sus pulmones28 en el momento adecuado. Los efectos de la bleomicina suelen ser visualmente evidentes en comparación con el control, lo que indica una administración satisfactoria. En estos estudios, los ratones fueron sacrificados en los días 7, 14 y 21.
  2. Para la histología, diseccionar los pulmones en bloque y fijarlos en PFA al 4% durante 24 h. Proceda con la inclusión de parafina, el corte, la hematoxilina y la eosina (H&E) y/o la tinción tricrómica de Masson como se describió anteriormente 28,29,30.
  3. Para la medición del colágeno, homogeneice el pulmón derecho y utilice un kit disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales) para medir el contenido de hidroxiprolina como se describió anteriormente31.
  4. Para la citometría de flujo, se digiere el pulmón derecho utilizando el disociador de tejidos y una solución enzimática para obtener una suspensión unicelular. Realizar la tinción y el análisis por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente 32,33,34.

Resultados

El protocolo descrito aquí resume la vía de administración de la aspiración orofaríngea en el modelo murino de bleomicina. En estos experimentos, los animales fueron tratados con bleomicina (0,75 U/kg de peso corporal) o PBS para el control simulado. En los días 7, 14 y 21, los ratones fueron sacrificados, se les explantaron los pulmones y se fijó el tejido, comose describió anteriormente. La fibrosis se evaluó mediante tinción histológica de hematoxili...

Discusión

Se proporciona un protocolo de vídeo detallado sobre la técnica de aspiración orofaríngea para la administración de bleomicina para su uso en el modelo murino de fibrosis pulmonar. Además, destacamos las posibles aplicaciones posteriores para cuantificar los cambios fibróticos y de inflamación inducidos por la bleomicina OA.

Si bien ningún animal recapitula completamente la complejidad de la enfermedad humana, el modelo de ratón de bleomicina se ha u...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Beca de Capacitación en Investigación Institucional (T32) del Premio del Servicio Nacional de Investigación Ruth L. Kirchstein (NRSA) de los NIH otorgada a RW (2T32HL072752-16). Los autores también desean agradecer el apoyo del Centro de Salud Pulmonar de la Fundación Saul y Joyce Brandman.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD45, Brlliant Violet 605BioLegend103155
anti-mouse CD64, AlexaFluor 647BioLegend139322
anti-mouse Ly6G, AlexaFluor 700BioLegend127622
anti-mouse MerTK, PE/Cy7BioLegend151522
anti-mouse SiglecF, PEBD Biosciences552126
BD Luer-Stub AdaptorsFisher Scientific13-681-21
BleomycinMcKesson1129996From NorthStar Rx 16714088601
Endotracheal Mouse Intubation KitKent ScientificETI-MSE
Fixable Live/Dead VioletThermoL34955
FlowJo v10 SoftwareFlowJo
gentleMACS DissociatorMiltenyi130-093-235
Hydroxyproline Assay KitSigmaMAK463
Liberase TMRoche5401127001
Moria Vessel ClampFine Science Tools18350-11
Mouse Endotracheal Intubation KitKentETI-MSE
Stepper PipetteDymaxTI15469
Wildtype C57BL/6 mice Jackson LaboratoriesJAX, stain #000664

Referencias

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