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요약

이 프로토콜은 폐 섬유증의 블레오마이신 쥐 모델에 사용하기 위한 구인두 흡인 기술을 보여줍니다.

초록

간질성 폐질환(Interstitial Lung Disease, ILD)은 폐 실질의 진행성적이고 종종 돌이킬 수 없는 흉터를 특징으로 하는 광범위한 장애를 나타내며, 가장 흔한 질환은 특발성 폐섬유증(IPF)입니다. IPF의 여러 동물 모델이 개발되었으며, 블레오마이신 쥐 모델이 가장 널리 사용됩니다. 블레오마이신(Bleomycin)은 폐포 상피에서 DNA 손상을 유발하여 인간에게 급성 폐 손상 및 폐 섬유증을 유발하는 것으로 알려진 화학 요법제입니다. IPF의 설치류 모델은 다양한 방법을 통해 블레오마이신 투여를 사용하며, 가장 일반적인 방법은 기관내(IT)입니다. 최근에는 구인두 흡인(OA) 기법이 여러 섬유화제에 대해 IT와 동등하게 효과적이며, 부작용이 현저히 적고 전달 경로가 더 쉬워지는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 쥐의 폐로 블레오마이신을 전달하는 OA 방법을 자세히 설명하고 데이터 정량화를 위한 잠재적인 다운스트림 응용 프로그램의 예를 강조합니다. 이 방법론은 IPF의 기저에 있는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 널리 사용되는 이 동물 모델을 활용할 수 있는 간단하고 빠르며 안전한 방법을 제공합니다.

서문

간질성 폐질환(Interstitial Lung Disease, ILD)은 폐포 공간(alveoli space), 간질(interstitium) 및 원위기도(distal airways)의 진행성 및 비가역적 흉터를 특징으로 하는 이질적인 질환군을 말합니다1. 특발성 폐섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 ILD의 가장 흔한 형태이며 평균 생존 기간은 약 3년이다2. IPF는 궁극적으로 말기 질환이며, 정형소 폐 이식은 일부 환자를 위한 구제 요법입니다. 현재 FDA가 승인한 IPF 치료법은 두 가지가 있으며, 둘 다 환자의 폐 기능을 안정화하거나 개선하기보다는 진행 속도를 늦출 뿐입니다 3,4. IPF의 토대를 밝히고 새로운 치료 표적을 식별하기 위한 상당한 연구 노력이 진행 중입니다. IPF 발병기전을 연구하기 위해 무수히 많은 동물 모델이 존재하며, 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다5. 어떤 모델도 인간 질병의 복잡성을 완전히 요약할 수는 없지만, 이러한 접근 방식은 IPF의 분자 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 중개 연구를 보완할 수 있습니다.

블레오마이신 쥐 모델은 가장 널리 사용되며 IPF6의 생체 내 모델로 잘 특성화되어 있습니다. 블레오마이신(Bleomycin)은 단일 및 이중 가닥 DNA 절단을 유도하는 펩타이드 제제입니다. 1962년에 그것의 발견 후에, bleomycin는 고환 종양과 림프종을 포함하여 다수 암을 대우하기에 효과적인 것으로 밝혀졌지만, 그 사용은 복용량 의존하는 폐렴 및 유래한 폐 섬유증에 의해 제한되었다 7,8. 이 폐 독성은 쥐에서 다시 나타납니다. 초기 염증 단계 후 1회 투여하면 섬유증이 5일째 되는 날부터 나타나며 14-21일째에 최고조에 달한다 9,10,11(그림 1). 약 6주 후에 자발적으로 해결되지만, 반복적인 투여로 영구적인 섬유화 변화를 이룰 수 있다12. 일시적이고 염증적인 특성을 감안할 때 블레오마이신 모델13에는 몇 가지 고유한 단점이 있지만, ILD에 대한 우리 분야의 이해에 대한 주요 격차를 해소하기 시작하는 빠르고 강력하며 재현 가능한 시스템을 제공하고 연구자가 지난 50년 동안의 결과를 비교할 수 있도록 합니다. 다른 설치 접근 방식으로는 석면폐증 및 실리카 쥐 모델이 있으며, 이는 유사한 시간 코스 (14-28 일) 6,14,15,16을 제공합니다. 그러나 이러한 모델은 IPF보다 진폐증과 더 일치하는 조직학적 패턴을 생성하며 공기 중 미립자를 사용해야 하므로 신중한 취급이 필요합니다. 대안적으로, 디프테리아 독소 및 TGF-β1과 같은 상피 주도 전이유전자 발현을 활용하는 동물 모델이 존재합니다. 이는 IPF에서 볼 수 있는 비염증성 폐포 유형 2 상피 세포 손상을 요약하지만, 약간 더 오래 걸리고(21-30d) 기존의 관심 형질전환 모델로 역교차해야 하는 특수 동물의 사용이 필요합니다. 마지막으로, TGF-β1, IL-β1 및 TNF-α를 포함한 사이토카인의 아데노바이러스 매개 과발현은 설치류에서 일반적으로 14일째까지 폐섬유증을 유발하는 것으로 나타났습니다 17,18,19. 이러한 사이토카인 과발현 모델은 편리한 비강 내 전달을 가능하게 하지만 신중한 정제 및 취급이 필요합니다.

블레오마이신의 전달을 위해서는 기관내(intratracheal, IT), 비강내(intranasal), 복강내(intraperiango), 피하(subclocineous), 정맥주사(intravenous routes) 등 다양한 접근법이 존재한다6. IT 전달은 가장 일반적인 방법으로, 전통적으로 기관내 삽관 또는 외과적 기관절개술20을 포함하며, 둘 다 깊은 진정제와 기술적 기교가 필요하며 수술 전후 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 최근에는 구인두 흡인(OA) 기법이 IT와 동등하게 효과적이며, 부작용이 현저히 적고 분만 경로가 더 쉬운 것으로 나타났습니다 14,21,22,23,24,25,26. 여기에서는 블레오마이신을 쥐 폐로 전달하는 OA 방법에 대한 자세한 시각적 프로토콜을 제시하고 데이터 정량화를 위한 다양한 잠재적 다운스트림 응용 분야를 강조합니다.

프로토콜

이 실험에 설명된 동물 연구는 UCLA 동물 연구 위원회(ARC)와 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 프로토콜(ARC-2021-025, ARC-2010-039)에 따라 수행되었습니다. 실험실 동물 사용에 관한 모든 주 및 연방 규정 및 정책을 완전히 준수했습니다. 동물들은 UCLA의 동물 보호 시설에 수용되었으며 병원체가 없는 조건에서 UCLA 실험실 및 동물 의학부(DLAM)의 숙련된 직원이 보살핌을 받았습니다. 야생형 C57BL/6 마우스는 상업적으로 얻어졌으며 최소 14일 동안 적응시켰습니다. 이 연구에는 8-12주 된 수컷 쥐가 사용되었으며 평균 체중은 20-25g이었습니다. 암컷 마우스도 사용할 수 있지만, 실험 그룹과 조건에 따라 동물의 성별 및 연령을 일치시키는 것이 중요하다27. 이 연구에 사용된 동물, 시약 및 장비의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. bleomycin의 구인두 투여

  1. 블레오마이신의 제조
    참고: 제약 등급의 블레오마이신을 사용하여 동물과 실험 간의 일관성과 재현성을 보장합니다. 블레오마이신의 투여량은 kg당 밀리그램(mg)이 아닌 동물 kg당 약물 단위(U/kg)입니다.
    1. 블레오마이신 분말을 멸균된 제약 등급 PBS에 10 U/mL의 스톡 농도로 용해시킵니다. 블레오마이신은 적절한 화학 요법 예방 조치를 사용하여 화학 물질 후드 아래에서 준비해야 합니다. 부분 표본을 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
    2. 최종 작업 농도를 준비합니다. 용량은 체중(0.5-3 U/kg)을 기준으로 하며, 사용된 블레오마이신과 실험 목적(예: 생존 또는 치사 투여)에 따라 필요에 따라 조정됩니다.
    3. 필요에 따라 최종 투여량을 조정합니다. 이러한 연구의 경우 블레오마이신을 0.375 U/mL로 희석하며, 이는 25g 마우스의 경우 50 μL에 해당하므로 최종 작업 농도는 0.75 U/kg입니다.

2. 마취 유도

  1. PBS의 케타민과 자일라진을 각각 10mg/mL 및 1mg/mL의 작업 농도로 희석하여 마취 칵테일을 준비합니다. 멸균 상태에서 제약 등급 시약을 사용하고 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 이 단계를 수행합니다.
  2. 27.5G 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 복강 내 주사를 통해 동물의 체중 1g당 칵테일 10μL(작업 농도: 케타민 100mg/kg, 자일라진 10mg/kg)를 투여합니다.
    1. 마우스가 적절하게 마취되어 있고 발가락 꼬집음과 같은 유해한 자극에 반응하지 않는지 확인하십시오. 효과는 5분 이내에 나타나야 합니다. 여전히 반응이 있는 경우, 원하는 마취 수준에 도달할 때까지 20μL 단위로 케타민/자일라진을 추가로 투여합니다. 마취 상태에서 안구 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 바르십시오.
      참고: 케타민은 유리한 부작용 프로필로 인해 다른 주입된 마취제 및 진정제보다 선호됩니다. 심박수와 호흡수를 포함한 혈류역학에 미치는 영향은 최소화됩니다. 흡입 이소플루란은 대체 마취제로 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서는 케타민/자일라진이 선호되는데, 그 이유는 케타민/자일라진이 투여 후 진정 상태가 지속되고 기침 또는 역류가 최소화되기 때문입니다.

3. 구인두 투여

  1. 적절하게 진정되면 구인두를 효과적으로 열 수 있도록 앞니에 마우스를 매달아 60°-80° 각도로 시술 플랫폼에 마우스를 매달아 놓습니다(그림 2A).
  2. 부드러운 미세혈관 클램프로 비강을 막아 쥐가 구인두를 통해 숨을 쉬도록 합니다.
  3. 집게를 사용하여 구인두에서 혀를 빼냅니다.
  4. 스텁 류어 스텁 팁이 있는 스테퍼 피펫을 사용하여 원하는 양의 블레오마이신 또는 식염수 조절제를 구인두 뒤쪽에 부드럽게 놓습니다. 액체 거품이 전체적으로 보이는지 확인합니다(그림 2B).
  5. 동물이 용액을 흡입할 때까지 혀를 제자리에 계속 유지합니다. 이것은 눈에 띄고 종종 청각적으로 명백해야 합니다.
    참고: 동물이 용액을 빠르게 흡입하면 구인두 뒤쪽의 시각화가 몇 초 이내에 일시적일 수 있습니다. 어쨌든, 만약 성공한다면, 그 동물은 빠르고 얕은 숨을 쉬면서 호흡 패턴에 갑작스럽고 일시적인 변화를 보일 것이다. 액체의 거품이 발생할 수 있으며, 이는 액체가 하기도로 성공적으로 들어갔음을 나타냅니다. 가끔 기침이 나올 수도 있습니다. 이것은 일반적으로 블레오마이신 용액의 무시할 수 있는 부피이며 실험 결과에 영향을 미치지 않아야 하므로 동물이 연구에 계속 포함될 수 있습니다. 반복적인 투여는 질식 위험을 증가시키고 최종 체중 기반 투여를 변경하므로 피하십시오.
  6. 흡인이 확인되면 코 클립을 조심스럽게 제거합니다.
  7. 블레오마이신 용액의 역류가 없는지 확인하기 위해 15-30초 동안 매달린 자세로 동물을 관찰한 다음 우리로 되돌립니다.
    참고: 질식 위험을 최소화하기 위해 최대 50μL의 부피를 권장합니다. 원하는 블레오마이신 용량과 마우스의 무게에 따라 필요에 따라 블레오마이신 용액의 농도를 조정합니다. 이 기법을 연습할 때는 에반스 블루(Evans blue)와 같은 수성 염료를 사용하여 용액이 위가 아닌 하기도로 투여되는지 확인한다14.

4. 동물 회복

  1. 치료 후에는 동물을 케이지에 옆으로 눕히고 그 아래에 가열 패드를 놓아 열 중성을 유지합니다.
  2. 생쥐가 완전히 의식을 가질 때까지 모니터링합니다. 이것은 일반적으로 사용된 케타민의 용량과 동물의 신진대사에 따라 1-2시간이 걸립니다. 발가락을 부드럽게 꼬집고 동물이 더 잘 깨어날 수 있도록 유온류를 유지하십시오.
  3. 매일 생쥐를 대상으로 체중, 그루밍, 활동 수준 및 호흡 상태의 변화를 임상적으로 모니터링합니다. 블레오마이신의 다른 전달 방법과 유사하게, 동물은 14-21일 동안 상당한 체중 감소를 경험할 수 있으며, 이는 모델의 효과를 나타내는 핵심 지표입니다.
  4. ARC 및 IACUC 프로토콜에 따라 체중 감소가 동물의 시작 체중의 20%를 초과하는 경우 동물을 안락사시킵니다. 체중 감소의 유병률과 심각성은 사용된 블레오마이신의 용량과 마우스의 인구 통계에 따라 다릅니다(위 참조).

5. 조직 수확, 가공 및 종말점 분석

  1. 실험 질문과 원하는 시점에 따라 IACUC 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시키고 적절한 시간에 폐28 을 적출합니다. bleomycin의 효과는 종종 대조군에 비해 시각적으로 매우 명백하여 성공적인 투여를 나타냅니다. 이 연구에서 쥐는 7일, 14일, 21일에 희생되었습니다.
  2. 조직학의 경우 폐를 일괄적으로 해부하고 4시간 동안 24% PFA로 고정합니다. 앞서 설명한 바와 같이 파라핀 임베딩, 절편화, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및/또는 Masson의 트리크롬 염색을 진행한다 28,29,30.
  3. 콜라겐 측정의 경우, 오른쪽 폐를 균질화하고 시판되는 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 앞서 설명한 바와 같이 하이드록시프롤린 함량을 측정합니다31.
  4. 유세포 분석의 경우, 조직 해리기와 효소 용액을 사용하여 오른쪽 폐를 분해하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 앞서 설명한 바와 같이 유세포 분석 염색 및 분석을 수행합니다 32,33,34.

결과

여기에 설명된 프로토콜은 bleomycin murine 모델에서 구인두 흡인 투여 경로를 요약합니다. 이 실험에서 동물은 가짜 대조군을 위해 블레오마이신(0.75U/체중 kg) 또는 PBS로 처리되었습니다. 7일, 14일, 21일째에 생쥐를 안락사시키고, 폐를 이식하고, 조직을 고정시켰다(앞서 설명한 바와 같이)35. 섬유증은 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 조직학적 염색을 사용하여 평...

토론

폐 섬유증의 쥐 모델에 사용하기 위해 블레오마이신을 투여하기 위한 구인두 흡인 기술에 대한 자세한 비디오 프로토콜이 제공됩니다. 또한, OA 블레오마이신에 의해 유도된 섬유화 및 염증 변화를 정량화하기 위해 잠재적인 다운스트림 응용 분야를 강조합니다.

인간 질병의 복잡성을 완전히 요약한 동물은 없지만, 블레오마이신 마우스 모델은 지난 ...

공개

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 RW(2T32HL072752-16)에 수여된 NIH Ruth L. Kirchstein National Research Service Award(NRSA) Institutional Research Training Grant(T32)의 지원을 받았습니다. 저자는 또한 Saul and Joyce Brandman Foundation Lung Health Center의 지원에 감사를 표합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD45, Brlliant Violet 605BioLegend103155
anti-mouse CD64, AlexaFluor 647BioLegend139322
anti-mouse Ly6G, AlexaFluor 700BioLegend127622
anti-mouse MerTK, PE/Cy7BioLegend151522
anti-mouse SiglecF, PEBD Biosciences552126
BD Luer-Stub AdaptorsFisher Scientific13-681-21
BleomycinMcKesson1129996From NorthStar Rx 16714088601
Endotracheal Mouse Intubation KitKent ScientificETI-MSE
Fixable Live/Dead VioletThermoL34955
FlowJo v10 SoftwareFlowJo
gentleMACS DissociatorMiltenyi130-093-235
Hydroxyproline Assay KitSigmaMAK463
Liberase TMRoche5401127001
Moria Vessel ClampFine Science Tools18350-11
Mouse Endotracheal Intubation KitKentETI-MSE
Stepper PipetteDymaxTI15469
Wildtype C57BL/6 mice Jackson LaboratoriesJAX, stain #000664

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