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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole démontre la technique d’aspiration oropharyngée pour une utilisation dans le modèle murin de bléomycine de la fibrose pulmonaire.

Résumé

La pneumopathie interstitielle (MPI) représente un large spectre de troubles caractérisés par la cicatrisation progressive et souvent irréversible du parenchyme pulmonaire, la plus fréquente étant la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI). Plusieurs modèles animaux de FPI ont été développés, le modèle murin de bléomycine étant le plus largement utilisé. La bléomycine est une chimiothérapie connue pour induire des dommages à l’ADN dans l’épithélium alvéolaire, entraînant des lésions pulmonaires aiguës et une fibrose pulmonaire chez l’homme. Les modèles de FPI chez les rongeurs utilisent l’administration de bléomycine par diverses méthodes, la plus courante étant l’intratrachéale (IT). Récemment, la technique d’aspiration oropharyngée (OA) s’est avérée aussi efficace que l’IT pour plusieurs agents fibrosants, avec beaucoup moins d’effets secondaires et une voie d’administration plus facile. Ce protocole détaille la méthode d’administration de la bléomycine dans le poumon murin et met en évidence des exemples d’applications potentielles en aval pour la quantification des données. Cette méthodologie offre un moyen simple, rapide et sûr d’utiliser ce modèle animal largement utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la FPI.

Introduction

La pneumopathie interstitielle (MPI) fait référence à un groupe hétérogène de troubles caractérisés par une cicatrisation progressive et irréversible de l’espace alvéolaire, de l’interstitium et des voies respiratoires distales1. La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est la forme la plus courante de MPI et entraîne une survie médiane d’environ trois ans2. La FPI est une maladie en phase terminale, la transplantation pulmonaire orthotopique étant une thérapie de rattrapage pour certains patients. Il existe actuellement deux thérapies approuvées par la FDA pour la FPI, qui ne font que ralentir le taux de progression plutôt que de stabiliser ou d’améliorer la fonction pulmonaire des patients 3,4. D’importants efforts de recherche sont en cours pour élucider les fondements de la FPI et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Il existe une myriade de modèles animaux pour étudier la pathogenèse de la FPI, chacun ayant ses propres avantages et inconvénients5. Bien qu’aucun modèle ne soit en mesure de récapituler entièrement la complexité des maladies humaines, ces approches offrent un aperçu significatif des mécanismes moléculaires de la FPI et peuvent compléter les études translationnelles.

Le modèle murin de bléomycine reste le modèle in vivo de FPI6 le plus largement utilisé et le mieux caractérisé. La bléomycine est un agent peptidique qui induit des cassures de l’ADN simple et double brin. Après sa découverte en 1962, la bléomycine s’est avérée efficace dans le traitement d’un certain nombre de cancers, y compris les tumeurs testiculaires et le lymphome, mais son utilisation a été limitée par la pneumonie dose-dépendante et la fibrose pulmonaire qui en résulte 7,8. Cette toxicité pulmonaire est récapitulée chez la souris. Lorsqu’elle est administrée en une seule dose, après une phase inflammatoire initiale, la fibrose peut être observée à partir du 5e jour, avec un pic les jours 14 à 219, 10 et 11 (Figure 1). La résolution spontanée se produit après environ 6 semaines, bien que des changements fibrotiques permanents puissent être obtenus avec des doses répétitivesde 12. Étant donné sa nature transitoire et inflammatoire, le modèle de bléomycine13 présente certains inconvénients inhérents, mais il offre un système rapide, robuste et reproductible pour commencer à répondre à certaines des principales lacunes dans la compréhension de notre domaine de la PID et permet aux chercheurs de comparer les résultats des cinq dernières décennies. D’autres approches d’installation incluent les modèles asbestosis et silice murin, qui offrent des parcours temporels similaires (jours 14-28)6,14,15,16. Cependant, ces modèles génèrent un schéma histologique plus compatible avec la pneumoconiose que la FPI et nécessitent l’utilisation de particules en suspension dans l’air, ce qui nécessite une manipulation soigneuse. Alternativement, il existe des modèles animaux qui utilisent l’expression de transgènes induits par l’épithélium, tels que la toxine diphtérique et le TGF-β1. Celles-ci récapitulent les lésions non inflammatoires des cellules épithéliales alvéolaires de type 2 observées dans la FPI, mais prennent un peu plus de temps (21-30d) et nécessitent l’utilisation d’animaux spécialisés qui doivent être rétrocroisés dans tout modèle transgénique d’intérêt existant. Enfin, il a été démontré que la surexpression des cytokines médiée par l’adénovie, y compris le TGF-β1, l’IL-β1 et le TNF-α, induit une fibrose pulmonaire chez les rongeurs, généralement au jour 14,17, 18, 19. Ces modèles de surexpression de cytokines permettent une administration intranasale pratique, mais nécessitent une purification et une manipulation soigneuses.

Il existe plusieurs approches pour l’administration de la bléomycine, notamment par voie intratrachéale (IT), intranasale, intrapéritonéale, sous-cutanée et intraveineuse6. L’administration de l’IT est la méthode la plus courante, impliquant traditionnellement une intubation endotrachéale ou une trachéotomie chirurgicale20, qui nécessitent toutes deux une sédation profonde, une finesse technique et sont associées à la morbidité et à la mortalité périopératoires. Récemment, la technique d’aspiration oropharyngée (OA) s’est avérée aussi efficace que l’IT, avec beaucoup moins d’effets secondaires et une voie d’accouchement plus facile 14,21,22,23,24,25,26. Ici, nous présentons un protocole visuel détaillé pour la méthode OA d’administration de la bléomycine dans le poumon murin et mettons en évidence diverses applications potentielles en aval pour la quantification des données.

Protocole

Les études animales décrites dans ces expériences ont été menées selon des protocoles (ARC-2021-025, ARC-2010-039) approuvés par le Comité de recherche animale de l’UCLA (ARC) et le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC). Le respect total de toutes les réglementations et politiques étatiques et fédérales concernant l’utilisation d’animaux de laboratoire a été maintenu. Les animaux ont été logés dans l’installation de soins aux animaux de l’UCLA et soignés par le personnel qualifié de la Division de laboratoire et de médecine animale de l’UCLA (DLAM) dans des conditions exemptes d’agents pathogènes. Des souris C57BL/6 de type sauvage ont été obtenues dans le commerce et ont été laissées s’acclimater pendant au moins 14 jours. Des souris mâles âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées pour ces études, avec un poids corporel moyen de 20 à 25 g. Des souris femelles peuvent également être utilisées, bien qu’il soit important de faire correspondre le sexe et l’âge des animaux dans les groupes et les conditions expérimentaux27. Les détails commerciaux des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Administration oropharyngée de bléomycine

  1. Préparation de la bléomycine
    REMARQUE : Utilisez de la bléomycine de qualité pharmaceutique pour assurer l’uniformité et la reproductibilité entre les animaux et les expériences. Doser la bléomycine en unités de médicament par kg d’animal (U/kg), et non en milligrammes (mg) par kg.
    1. Dissoudre la poudre de bléomycine dans du PBS stérile de qualité pharmaceutique jusqu’à une concentration de base de 10 U/mL. La bléomycine doit être préparée sous une hotte chimique en utilisant les précautions chimiothérapeutiques appropriées. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à 6 mois.
    2. Préparez la concentration de travail finale. La dose est basée sur le poids (0,5 à 3 U/kg), et des ajustements sont apportés au besoin en fonction de la bléomycine utilisée et du but de l’expérience (p. ex., survie ou dosage létal).
    3. Ajustez le volume final d’administration au besoin. Pour ces études, diluer la bléomycine à 0,375 U/mL, ce qui équivaut à 50 μL pour une souris de 25 g, ce qui donne une concentration de travail finale de 0,75 U/kg.

2. Induction de l’anesthésie

  1. Préparez le cocktail d’anesthésie en diluant la kétamine et la xylazine dans du PBS à des concentrations de travail de 10 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement. Effectuez cette étape dans des conditions stériles à l’aide de réactifs de qualité pharmaceutique et conformément aux protocoles approuvés par l’établissement.
  2. Administrer 10 μL du cocktail par gramme de poids corporel de l’animal (concentration de travail : kétamine 100 mg/kg, xylazine 10 mg/kg) par injection intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de 27,5 g et d’une seringue de 1 mL.
    1. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée et qu’elle ne répond pas aux stimuli nocifs, tels que le pincement des orteils. Les effets devraient être visibles dans les 5 minutes. S’il réagit toujours, administrez de la kétamine/xylazine supplémentaire par incréments de 20 μL jusqu’à ce que le niveau d’anesthésie souhaité soit atteint. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire sous anesthésie.
      REMARQUE : La kétamine est préférée aux autres anesthésiques et sédatifs injectés en raison de son profil d’effets secondaires favorable. Il a des effets minimes sur l’hémodynamique, y compris la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire. L’isoflurane inhalé peut être utilisé comme agent anesthésique alternatif. Dans ces études, la kétamine/xylazine est préférée car elle entraîne une sédation prolongée et une toux ou un reflux minime de bléomycine après l’administration.

3. Administration de l’oropharynx

  1. Une fois correctement sédative, suspendez la souris sur la plate-forme procédurale à un angle de 60° à 80° en la suspendant par ses incisives avant pour ouvrir efficacement l’oropharynx (Figure 2A).
  2. Obstruez le passage nasal avec une pince microvasculaire lisse, forçant la souris à respirer par son oropharynx.
  3. Rétractez la langue de l’oropharynx à l’aide d’une pince.
  4. À l’aide d’une pipette pas à pas avec une pointe stub leur-stub, placez doucement le volume désiré de bléomycine, ou contrôle salin, à l’arrière de l’oropharynx. Assurez-vous qu’une bulle de liquide est visiblement (Figure 2B).
  5. Continuez à maintenir la langue en place jusqu’à ce que l’animal aspire la solution. Cela devrait être visible et souvent audible.
    REMARQUE : Si l’animal aspire rapidement la solution, la visualisation à l’arrière de l’oropharynx peut être transitoire, en quelques secondes. Quoi qu’il en soit, s’il réussit, l’animal démontrera un changement brusque et transitoire dans son rythme respiratoire, prenant des respirations rapides et superficielles. Des bulles peuvent se produire, ce qui indique en outre que le liquide a réussi à pénétrer dans les voies respiratoires inférieures. Une toux occasionnelle peut également survenir. Il s’agit généralement d’un volume négligeable de la solution de bléomycine et ne devrait pas affecter les résultats expérimentaux, ce qui permet à l’animal de rester inclus dans l’étude. Évitez les doses répétitives, car elles augmentent le risque d’asphyxie et modifient la dose finale basée sur le poids.
  6. Une fois l’aspiration confirmée, retirez soigneusement le pince-nez.
  7. Observez l’animal en position suspendue pendant 15 à 30 s pour éviter tout reflux de la solution de bléomycine, puis remettez-le dans sa cage.
    REMARQUE : Un volume maximal de 50 μL est recommandé pour minimiser le risque d’asphyxie. En fonction de la dose souhaitée de bléomycine et du poids de la souris, ajustez la concentration de la solution de bléomycine au besoin. Lorsque vous pratiquez cette technique, utilisez un colorant à base d’eau tel que le bleu Evans pour confirmer que la solution est administrée dans les voies respiratoires inférieures, plutôt que dans l’estomac14.

4. Récupération des animaux

  1. Après le traitement, placez l’animal sur le côté dans sa cage avec un coussin chauffant en dessous pour maintenir la thermoneutralité.
  2. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles soient pleinement conscientes. Cela prend généralement 1 à 2 heures, en fonction de la dose de kétamine utilisée et du métabolisme de l’animal. Pincez doucement les orteils et maintenez l’animal euthermique pour faciliter le réveil.
  3. Surveillez cliniquement les souris sur une base quotidienne pour détecter les changements de poids corporel, de toilettage, de niveau d’activité et d’état respiratoire. À l’instar d’autres méthodes d’administration de la bléomycine, les animaux peuvent subir une perte de poids significative au cours de la période de 14 à 21 jours, ce qui est un marqueur clé de l’efficacité du modèle.
  4. Selon les protocoles de l’ARC et de l’IACUC, euthanasier les animaux si la perte de poids dépasse 20 % du poids de départ de l’animal. La prévalence et la gravité de la perte de poids dépendent de la dose de bléomycine utilisée et de la démographie des souris (voir ci-dessus).

5. Prélèvement et traitement des tissus et analyse finale

  1. En fonction de la question expérimentale et du moment souhaité, euthanasiez les souris en suivant les protocoles de l’IACUC et prélevez leurs poumons28 au moment approprié. Les effets de la bléomycine sont souvent très apparents visuellement par rapport au contrôle, ce qui indique une administration réussie. Dans ces études, les souris ont été sacrifiées aux jours 7, 14 et 21.
  2. Pour l’histologie, disséquer les poumons en bloc et les fixer dans 4 % de PFA pendant 24 h. Procéder à l’enrobage de paraffine, à la section, à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et/ou à la coloration trichrome de Masson comme décrit précédemment 28,29,30.
  3. Pour mesurer le collagène, homogénéisez le poumon droit et utilisez un kit disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) pour mesurer la teneur en hydroxyproline comme décrit précédemment31.
  4. Pour la cytométrie en flux, digérer le poumon droit à l’aide du dissociateur tissulaire et d’une solution enzymatique pour obtenir une suspension unicellulaire. Effectuer la coloration et l’analyse par cytométrie en flux comme décrit précédemment 32,33,34.

Résultats

Le protocole décrit ici résume la voie d’administration par aspiration oropharyngée dans le modèle murin de bléomycine. Dans ces expériences, les animaux ont été traités soit avec de la bléomycine (0,75U/kg de poids corporel), soit avec du PBS pour un contrôle fictif. Les jours 7, 14 et 21, les souris ont été euthanasiées, leurs poumons ont été explantés et leurs tissus ont été réparés, comme décrit précédemment35. La fibrose a été éva...

Discussion

Un protocole vidéo détaillé est fourni sur la technique d’aspiration oropharyngée pour l’administration de la bléomycine à utiliser dans le modèle murin de fibrose pulmonaire. De plus, nous soulignons les applications potentielles en aval pour quantifier les changements fibrotiques et inflammatoires induits par la bléomycine OA.

Bien qu’aucun animal ne récapitule complètement la complexité des maladies humaines, le modèle murin de bléomycine...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention de formation en recherche institutionnelle (T32) Ruth L. Kirchstein National Research Service Award (NRSA) des NIH accordée à RW (2T32HL072752-16). Les auteurs tiennent également à souligner le soutien du Centre de santé pulmonaire de la Fondation Saul et Joyce Brandman.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD45, Brlliant Violet 605BioLegend103155
anti-mouse CD64, AlexaFluor 647BioLegend139322
anti-mouse Ly6G, AlexaFluor 700BioLegend127622
anti-mouse MerTK, PE/Cy7BioLegend151522
anti-mouse SiglecF, PEBD Biosciences552126
BD Luer-Stub AdaptorsFisher Scientific13-681-21
BleomycinMcKesson1129996From NorthStar Rx 16714088601
Endotracheal Mouse Intubation KitKent ScientificETI-MSE
Fixable Live/Dead VioletThermoL34955
FlowJo v10 SoftwareFlowJo
gentleMACS DissociatorMiltenyi130-093-235
Hydroxyproline Assay KitSigmaMAK463
Liberase TMRoche5401127001
Moria Vessel ClampFine Science Tools18350-11
Mouse Endotracheal Intubation KitKentETI-MSE
Stepper PipetteDymaxTI15469
Wildtype C57BL/6 mice Jackson LaboratoriesJAX, stain #000664

Références

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