Visualizarse los microorganismos del suelo mediante el contacto Deslice análisis y microscopia

Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Bradley Schmitz

Suelo compone de la capa delgada en la superficie terrestre, que contienen factores bióticos y abióticos que contribuyen a la vida. La porción abiótica incluye partículas inorgánicas de tamaño y forma que determinan la textura del suelo. La parte biótica incorpora residuos de plantas, raíces, materia orgánica y microorganismos. Diversidad y abundancia de microbios del suelo es expansivo, ya que un gramo de suelo contiene 10^7-8 bacterias, actinomicetos 10^6-8 , 10^5-6 hongos, levadura³ 10, 10^4-6 protozoos, algas^3-4 10 y 5 nematodos³ . Los factores bióticos y abióticos forman arquitecturas alrededor de raíces de la planta, conocidas como la rizosfera, que proporcionan condiciones favorables para los microorganismos del suelo.

Factores bióticos y abióticos promoción la vida en los suelos. Sin embargo, también contribuyen dinámica estresante que limitan microbios. Estrés biótico implica competencia entre vida para adaptarse y sobrevivir en condiciones ambientales. Por ejemplo, los microbios pueden secretar sustancias inhibidoras o tóxicas para dañar microorganismos vecinos. Penicillium notatum es un hongo notorio, ya que reduce la competencia por nutrimentos mediante la producción de un antimicrobiano, que los seres humanos cosechan para crear la penicilina farmacéutica. Abiótico surge propiedades físicas o químicas, limitando la supervivencia microbiana, tales como luz, humedad, temperatura, pH, nutrientes y textura.

Observar directamente las interrelaciones entre los organismos del suelo, las partículas y comportamientos en diferentes ambientes del suelo es difícil, pero el análisis del contacto deslizante, también conocido como la técnica del portaobjetos enterrado, desarrollada por Rossi et al. (1936) proporciona un punto de vista de instantáneas en la microbiología del suelo. Este método es útil para la observación de hongos del suelo, actinomicetos y bacterias mediante microscopía. Aunque, no está pensado para cuantificaciones microbianas, ya que sólo implica una pequeña parte de un entorno más heterogéneo.

Este método se realiza fácilmente por enterrar un portaobjetos de cristal en el suelo durante varios días, luego la fijación de los microorganismos en el portaobjetos con ácido acético. Los microbios son teñidos con el colorante Rosa de Bengala y observados mediante microscopia usando inmersión de aceite en el objetivo X 100. Pueden distinguirse tres grupos microbianos como bacterias aparecen como pequeñas formas redondeadas, filamentos de actinomicetos como cuerdas delgadas y hyphae fungicidas como hilos gruesos. En el suelo, casi todas las bacterias son más pequeños y más redondeados que los de cultivo puro debido a estrés nutricional, que provoca contracción y redondeo para una superficie más favorable: cociente del volumen. Las formas oscuras irregulares manchadas no son las partículas del suelo. Pueden añadirse diferentes enmiendas de nutrientes al suelo para proporcionar fuentes de carbono y glucosa que promueven la interacción y crecimiento microbiano. Esta técnica permite la fácil observación de la microbiología del suelo y ayuda a identificar los diversos microorganismos presentes en el medio ambiente.

1. suelo diapositiva microcosmos preparación

1. Recoger suelo de jardín de la superficie (0-6 "profundidad), y pesan 150 g suelo en dos tazas separadas.
   1. Si el suelo tiene alta densidad de la materia orgánica, peso 100 g.
2. Una taza de la etiqueta "tratamiento" y el otro "Control".
3. Calcular la cantidad de agua necesaria para modificar el contenido de humedad.
   1. Contenido de humedad está a menudo cerca de capacidad de campo.
      
4. Medir la cantidad de agua destilada con una probeta graduada.
5. Vierta la cantidad de agua destilada en dos viales.
6. Frasco de etiqueta un "Tratamiento" y el otro "Control".
7. Modificar el agua en el frasco de "Tratamiento" con suficiente glucosa a una concentración de glucosa final de suelo de 1%, según una base de peso seco en el suelo de "Tratamiento".
8. Agregar 200 mg NH₄NO₃ en el frasco de "Tratamiento" y revolver para disolver las enmiendas. El nitrato sirve como una fuente de nutrientes para los microbios del suelo.
9. No modificar el frasco de "Control".
10. En pequeñas alícuotas de 50 mg aproximadamente, mezcle el contenido del frasco de "Tratamiento" en la Copa de "Tratamiento". Revuelva con una espátula después de cada adición de la alícuota.
11. En pequeñas alícuotas, mezcle el contenido del frasco de "Control" en la Copa de "Control". Revuelva con una espátula después de cada adición de la alícuota.
12. Cuatro portaobjetos limpio de la etiqueta: dos toboganes de "Control" y dos "tratamiento".
13. Inserte las dos diapositivas de "Tratamiento" en la Copa "Tratamiento" del suelo e insertar las diapositivas de "Control" dos en la Copa del suelo "Control". Dejar 2 cm de cada diapositiva que proyecta sobre la superficie del suelo y asegúrese de dejar un espacio entre las dos diapositivas.
14. Cubrir las copas con el abrigo plástico y asegúrelo con una banda elástica.
15. Prefore la envoltura varias veces para permitir que el aire, pero todavía evitar la evaporación excesiva.
16. Registrar el peso de ambos vasos.
17. Incubar las tazas llenas de suelo a temperatura ambiente en una área designada/incubadora durante 7 días.

2. Deslice la coloración y la microscopia

1. Registrar el peso de ambos vasos.
2. Calcular la humedad del suelo en el momento de retiro de la diapositiva.
3. Retire las dos diapositivas de cada taza pulsando cada diapositiva a una posición inclinada y retirar para que no se disturbe la cara superior de la diapositiva.
4. Identifique y marque el lado de la diapositiva teñidas y observadas.
5. Golpee suavemente el portaobjetos sobre la mesa para eliminar las partículas de suciedad grandes.
6. Limpie con una toalla de papel húmeda la cara inferior de las diapositivas. Seque las diapositivas en temperatura ambiente.
7. Usar gafas protectoras y sosteniendo cada diapositiva con pinzas, sumerja los portaobjetos en ácido acético al 40% (v/v) 1-3 minutos bajo una campana de humos.
8. Lave el exceso de ácido bajo un chorro suave de agua.
9. Utilizando un gotero, cubrir la superficie de los portaobjetos con fenólico de rosa de Bengala. Apoyar la diapositiva sobre una rejilla de tinción sobre un recipiente para recoger el exceso mancha. Ten cuidado, no lave con la fuerza que puede eliminar los microorganismos de la superficie de los portaobjetos.
10. Diapositivas de 5-10 min no deje que la corredera se convierten en manchas secas. Añadir más colorante si es necesario.
11. Suavemente Lave los portaobjetos para eliminar el exceso de la mancha.
12. Deje que los portaobjetos se seca a temperatura ambiente.
13. El objetivo de inmersión de aceite, tenga en cuenta la diapositiva utilizando un microscopio (figura 1).

Figura 1. Una diapositiva bajo el microscopio.

Hongos muestran hifas gruesas, filamentosos (figura 2). Actinomycetes muestran hifas delgadas, filamentosos. Bacteria muestra cocos pequeños o formas de barra. A menudo es encontrados en macizos, en las partículas del suelo o revestimiento de hifas de los hongos. Las partículas del suelo mostrar formas irregulares, oscuros (figura 3).

Figura 2. Imagen de diapositiva contacto con objetivo de 100 X.
Foto cortesía de W.H. de Fuller.

Figura 3. Imagen de diapositiva contacto con objetivo de 100 X.
Foto cortesía de W.H. de Fuller.

El ensayo de contacto deslizante, también conocido como el portaobjetos enterrado, es una técnica simple utilizada para observar cualitativamente la biota del suelo. Este análisis cualitativo muestran las interacciones espaciales entre hifas de los hongos, filamentos actinomycete, las bacterias y las partículas del suelo. Individuos o la industria puede emplear este análisis para recopilar conocimientos sobre la salud de un suelo particular en lo que respecta a la agricultura, jardinería, compostaje, enseñar y estudiar. Sin embargo, esta técnica no cuantificar biota micro del suelo, ya que sólo abarca un pequeño retrato de un entorno más heterogéneo.

Relaciones de organismo de suelo pueden ser observadas por la realización del análisis de contacto deslizante y visualización de los resultados a través de microscopía de inmersión de aceite de 100 X (figuras 2 y 3). La simplicidad y la facilidad para realizar este análisis es una gran técnica partida para aquellos que nunca han sido expuestos a la microbiología y por primera vez se puede ver microorganismos a través de un microscopio.

1. Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
2. Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
3. Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).