Tinción de Gram de la Bacteria de fuentes ambientales

Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Luisa Ikner

El espectro de la investigación en Microbiología Ambiental es amplio en alcance y potencial de aplicación. Si el trabajo es báscula de mesa con aislamientos bacterianos conocidos, o en el campo recolectando muestras de suelo o agua que contienen aislamientos bacterianos desconocidos, la capacidad de rápidamente y visualmente discernir las poblaciones cultivables de interés sigue siendo de gran importancia para microbiólogos ambientales aún hoy con la abundancia de técnicas moleculares disponibles para su uso. Este vídeo demuestra una tal técnica, conocida como tinción de Gram.

La tinción de Gram es una clásica e importante técnica de maquillaje que sigue siendo ampliamente utilizada por los microbiólogos ambientales. Similar a una simple mancha, permite para la evaluación de la morfología celular bacteriana (p. ej., cocos, barras, formadores de espora), tamaño y la disposición (por ejemplo, cadenas o racimos). Además, permite la diferenciación de las bacterias en dos grupos distintos de principio, gram-negativas y gram positivas — según la composición de la pared celular y estructura (figura 1).

Tinción de Gram es un proceso de múltiples paso. Antes de teñir, se prepara un frotis bacteriano utilizando una placa, la inclinación o el caldo cultural. La preparación del frotis se seca y se fija sobre un portaobjetos de vidrio limpio. Una mancha principal de la violeta cristalina se aplica para el frotis fijado. Cristal violeta es una tinción básica conformada por positivamente cargado iones coloreados (es decir, cromóforos) que forman débiles enlaces iónicos con cargados negativa grupos funcionales presentes en la pared celular bacteriana. Después de enjuagar suavemente el portaobjetos con agua, yodo de Gram se aplica y forma complejos insolubles con el cristal violeta en la pared celular. Los complejos de cristal violeta-yodo más atan con peptidoglicano, un componente del principio de las paredes celulares bacterianas. Tras un segundo enjuague con agua, un agente decolorante se aplica brevemente en el borrón de transferencia. Para bacterias Gram-negativas, el complejo cristal violeta-yodo es arrastrado durante el paso de decolorante, con bacterias Gram-positivas la mancha púrpura de la retención. Un enjuague con agua de la tercera y última es seguido por una contratinción de safranina que colorea bacterias Gram negativas de color rosas o rojo.

Figura 1. Comparación de la pared celular de bacterias Gram positivas y gram negativas.

1. muestras

1. Recoger la muestra de suelo y transporte al laboratorio para su análisis microbiano.
2. En el laboratorio, pesar una muestra de 10 g con una balanza analítica.
3. Diluir la muestra 1:10 a 95 mL de solución salina con tampón fosfato (10 piezas suelo es equivalente al líquido acuoso de 5 partes) y agitar para mezclar (figura 2, paso 1).
4. Realizar posteriores 1:10 diluciones hasta por lo menos 10^-5 g de suelo por mL, y placa de extensión seleccionado diluciones en repeticiones de dos o tres en el medio agar nutriente baja (e.g., R2A) (figura 2, los pasos 2 - 3).
5. Incubar las placas durante una semana a temperatura ambiente (figura 2, paso 4).
6. Seleccione una o dos colonias para el aislamiento y la racha en placas de agar fresco (figura 3, los pasos 1-3).
7. Incubar las placas de la racha de dos o tres días a temperatura ambiente (figura 3, paso 4).

2. preparación de frotis bacteriano

1. Observar las placas de la racha de colonias aisladas.
2. Para preparar cada preparación de frotis, un asa de inoculación de la inmersión en etanol, esterilizar a la llama y coloque 1 a 2 loopfuls de agua destilada estéril en el centro del portaobjetos previamente limpiado.
3. Esterilizar el asa de inoculación una vez más como se describió anteriormente. Una vez enfriado, extraer una pequeña cantidad de cultivo de una sola Colonia aislada y se mezcla con las gotitas de agua sobre el portaobjetos (frotis deberían parecerse a leche descremada diluida). El asa de inoculación debe refrigerarse antes de aislamiento de la Colonia. Un bucle que está demasiado caliente hará que la Colonia o medio de salpicaduras, que pueden conducir a la aerosolización de las bacterias. Generalmente, cuando el bucle es demasiado caliente para su uso, un "silbido" se escuchará cuando se aplica al agar o Colonia. Enfriamiento inadecuado del bucle también puede resultar en la transferencia de cultura para Deslice menos eficiente y distorsión de la morfología de la célula.
4. Repartidos el frotis de la superficie de la diapositiva mide aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm y déjelo al aire seco. Es importante para el aire de secado se produzca bajo condiciones de flujo laminar. Diapositivas no deben ser sopladas seco para no interrumpir el borrón de transferencia. También, diapositivas no deben ser secados al fuego, para mantener la morfología de la célula.
5. Después de secar, calor fijar el frotis al pasar la diapositiva rápidamente a través de una llama de 2-3 x. La diapositiva no debe sostener inmóvil en la llama, para evitar la distorsión de la morfología celular o daño en el portaobjetos de cristal.

3. tinción de gram

1. Sujete la corredera en un extremo con una pinza para la ropa limpia.
2. Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) y mantenga durante 2 a 3 min.
3. Cuidadosamente lavar el portaobjetos con agua destilada. La corriente de agua no debe ser dirigida en el borrón de transferencia para prevenir daño o desprendimiento de lo portaobjetos de vidrio.
4. Cubrir el frotis con yodo de Gram y mantenga pulsado durante 2 minutos, luego enjuagar suavemente el portaobjetos con agua.
5. Decolorar el frotis con etanol al 95% hasta que la mancha ya no se lava de la diapositiva (esto toma generalmente no más de 20 s dependiendo el grosor del frotis), enjuagar inmediatamente con agua destilada. Este paso es vital para evitar el exceso de decolorante la diapositiva, que puede llevar a una Gram Tinción designación falsa (es decir, Gram-variable).
6. Añadir el contraste (safranina) para el borrón de transferencia y mantenga durante 30 s. Luego enjuagar suavemente el portaobjetos con agua destilada y seque con papel absorbente.

4. microscopio Observación de diapositivas

1. Observar las diapositivas utilizando baja (p. ej., 4 X o 10 X), high-dry (p. ej., 40 X) y objetivos de inmersión (100 X) de aceite. Para inmersión en aceite, agregue el aceite directamente en el frotis.
2. Para obtener resultados representativos de bacterias Gram-positivas y gram negativas del suelo, ver figuras 4 y 5.

Figura 2. Dilución y la técnica de propagación-galjanoplastia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Aislamiento de la Colonia mediante la técnica de placa de racha.

Figura 4. Bacteria de suelo Gram-positiva Staphylococcus aureus .

Figura 5. Bacteria del suelo Gram-negativas Escherichia coli.

La tinción de Gram se utiliza en los muchos subcampos de Microbiología Ambiental y clínica. Los científicos de calidad de agua pueden utilizar la tinción de Gram como herramienta confirmatoria para la detección de coliformes fecales en muestras de agua. Aislamientos bacterianos de suelos son gramo manchado con el fin de caracterizar las comunidades de suelo cultivable. Para microbiólogos ambientales, tinción de Gram SIDA en la categorización de las poblaciones bacterianas según la estructura de la pared celular. Esto, a su vez, proporciona información sobre la capacidad general de una comunidad microbiana dada para resistir la desecación y otros factores de estrés ambientales. Conocimiento de la designación de tinción de Gram es también de importancia en la investigación y desarrollo de desinfectantes y otros antimicrobianos, como bacterias Gram-positivas tienden a ser más resistente a la inactivación por química particular que las bacterias Gram-negativas.

Para las aplicaciones de la microbiología clínica, la tinción de Gram se utiliza para confirmar la identidad de agentes de enfermedades bacteriológicas junto con métodos de diagnóstico tradicionales. También es de gran ayuda cuando el cultivo ha fallado o no es una opción. Tinción de Gram de muestras clínicas puede revelar la presencia de agentes etiológicos que pueden no se han observado lo contrario.