Los autores agradecen a Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Velotta Jeff, MD, Hoyt Grant, Robert C. Robbins, MD, Yu Jin, MD, Tim Doyle, PhD, y el Stanford pequeño núcleo de imágenes de animales para la asistencia técnica. Los autores también agradecen AM Bickford, Inc. para el apoyo del equipo de veterinarios. Esta investigación fue financiada por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), el tabaco de California las enfermedades relacionadas con el Programa de Investigación de la Universidad de California (15IT-0257 y 0169-1514RT) , y el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RS1-00183). NH es apoyado por una beca de la Asociación Americana del Corazón.

1. La inducción de isquemia Miembro Posterior Unilateral <ol><li> El instrumental quirúrgico necesario para esta operación son: pinzas finas puntas, pinzas de punta, tijeras de primavera, tijeras quirúrgicas, porta agujas, y el retractor. Hacemos nuestro propio retractor con un clip, ya que es más pequeño que los retractores disponibles en el mercado. Esterilizar las herramientas antes de la cirugía por un autoclave o esterilizador de calor de perlas. Una herramienta de cauterización y estéril bastoncillos de algodón señaló también serán necesarios para esta cirugía. Se recomienda que las herramientas de ser re-esterilizados en las puntas cuando sea necesario durante el procedimiento. </li><li> Cuando los instrumentos están listos, coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene un 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100%, con un caudal de 1L/min. </li><li> Deja el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire el animal de la cámara de inducción. Se recomienda para eliminar la anestesia de la caja antes de abrir la tapa, para disminuir la exposición del operador con el isoflurano. </li><li> A continuación, coloque el animal en decúbito supino sobre la mesa antes de la operación y conectarlo a un flujo continuo de isoflurano. Usando una máquina de afeitar eléctrica, eliminar el vello de las extremidades inferiores. Aplicar crema de depilación para eliminar completamente el cabello. </li><li> Coloque el ratón en la posición de decúbito supino sobre una toalla envuelta con calefacción en la mesa de operaciones, y conectarlo a un flujo continuo de isoflurano. Ampliar y asegurar la extremidad posterior con un pedazo de cinta adhesiva. Una vez que el miembro posterior es segura, limpia la piel con tres alterna matorrales Betadine y alcohol. Para el resto del procedimiento quirúrgico, el uso de un microscopio de disección a 10X o 20X de aumento para obtener una vista ampliada de la región de las extremidades traseras. </li><li> Con unas pinzas finas y tijeras quirúrgicas, hacer una incisión de la piel, de aproximadamente 1 cm de largo, desde la rodilla hacia el muslo. </li><li> Utilizando tampón fosfato salino (PBS)-humedecido bien hisopos de algodón señaló, cepille suavemente el tejido graso subcutáneo que rodea el músculo del muslo. </li><li> A continuación, aplicar el cauterio para incidir transversalmente y disecar a través del tejido graso subcutáneo para revelar la arteria femoral subyacente. </li><li> Use un separador para abrir la herida y para obtener una mejor visión de los vasos de las extremidades inferiores. </li><li> Con unas pinzas finas y un hisopo de algodón en punta, suavemente atravesar la vaina femoral membranosa para exponer el paquete neurovascular. </li><li> Luego, utilizando un juego limpio de fórceps y un hisopo de algodón, analizar y separar la arteria femoral de la vena femoral y el nervio en la posición proximal cerca de la ingle. Después de la disección, pasar un hilo de sutura de seda 7-0 por debajo del extremo proximal de la arteria femoral. Ocluir la arteria femoral proximal con nudos dobles. Coloque el empate en el buque como proximal en la herida como sea posible a fin de dejar de longitud para el segundo empate y un segmento intermedio que se secciona. </li><li> Separada de la arteria femoral de la vena femoral en la posición distal cerca de la rodilla. Pase un hilo de sutura de 7-0 por debajo del extremo distal de la arteria femoral proximal de la arteria poplítea. Ocluir el vaso con nudos dobles. </li><li> Ocluir la arteria femoral distal con un segundo conjunto de nudos dobles proximal a la primera serie de nudos. Este segundo conjunto de puntos de sutura se utiliza para el agarre de la arteria durante el procedimiento de transacción. </li><li> Del mismo modo, a los efectos de agarre, ocluir la arteria femoral proximal con un segundo conjunto de nudos dobles justo distal a la primera serie de nudos. </li><li> Seccionar el segmento de la arteria femoral entre los nudos distales y proximales con un hisopo de algodón de punta fina y un par de tijeras de primavera. Tenga cuidado de no perforar la pared de la vena femoral. </li><li> Retire el separador y cerrará la incisión con puntos de sutura Vicryl 5-0. Estas suturas no necesitan ser removidos en un momento posterior, ya que se disuelven por sí mismos. </li><li> Una vez que se cierra la incisión, el lugar del animal en la parte superior de un cojín cubierto con calefacción en la jaula de recuperación y seguimiento de forma continua hasta que despierto. </li><li> Después de animal se ha recuperado de una hora, continúe con el paso de láser Doppler perfusión de la sangre con el fin de confirmar la inducción de isquemia. </li></ol> 2. Laser Doppler perfusión de la sangre <ol><li> Para comenzar la etapa de láser Doppler perfusión, coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene un 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100%, con un caudal de 1L/min. </li><li> Deja el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire el animal de la cámara de inducción. Se recomienda para eliminar la anestesia de la caja antes de abrir la tapa, para disminuir la exposición del operador con el isoflurano. </li><li> Colocar el animal sobre la mesa pre-operativos relacionados con el flujo continuo de isoflurano. A continuación, eliminar el vello de las extremidades inferiores con una afeitadora eléctrica seguida por la crema del retiro del pelo si es necesario. </li><li> Después de quitar el pelo,Colocar el animal en una superficie de 37 ° C se calienta durante 5 minutos con un flujo continuo de isoflurano. Monitorear la temperatura del núcleo para asegurar euthermia, como los cambios de temperatura afectan notablemente la perfusión. </li><li> Después de 5 minutos, coloque el animal en decúbito supino sobre una base no-reflectante que absorben la luz de superficie como de color verde de tela, conectado a un flujo continuo de isoflurano. Extender las extremidades posteriores. </li><li> A continuación, encienda la impresora láser Doppler y la adquisición de software e inicializar el software. Especificar el tamaño del campo de visión y resolución. Lo mejor es mantener el campo de visión y la densidad de píxeles consistente entre los animales con el fin de realizar análisis en el futuro sea más fácil. </li><li> Abra un archivo nuevo. Pulse inicio para comenzar a adquirir los datos de imagen. En general, la cámara detecta automáticamente la distancia con el ratón, pero si se le solicita, especifique la distancia del animal a la cámara. El láser se muestran los límites del campo de visión y luego iniciar la adquisición de datos. </li><li> Después de la adquisición se haya completado, la imagen empieza a mostrar una gama de colores que indican el nivel de perfusión de la sangre a las piernas. Los colores se pueden establecer en un rango de perfusión específicas para una mejor comparación de datos entre los animales. </li><li> Cuando la adquisición de datos, guarde el archivo. </li><li> A continuación, devolver el animal a la jaula de recuperación y seguimiento de los animales continuamente hasta que despierto. </li><li> Para analizar los datos, use el ajuste de umbral en el software de análisis para restar el ruido de fondo. Un umbral de 0,2 suele ser un valor razonable. Seleccione dos regiones de interés o rendimiento de la inversión, que cubren cada área de las extremidades traseras. Una variedad de puntos de referencia se pueden utilizar para normalizar el retorno de la inversión entre los miembros y los animales. A continuación, determinar el promedio de perfusión y la variabilidad en el retorno de la inversión. La diferencia de perfusión y la relación entre la perfusión de la extremidad isquémica y la integridad física de control entonces se puede determinar fácilmente. </li><li> Este procedimiento se puede repetir para seguir los cambios en la perfusión de extremidades inferiores en el tiempo. En un momento de tiempo deseado, el animal puede ser sacrificado para la evaluación de la función del tejido y la comparación de datos de imágenes de perfusión. </li></ol> 3. Los resultados representativos: La anatomía de la vasculatura extremidades inferiores se muestra en la Figura 1 2. Un esquema representativo de las extremidades inferiores después de la explantación arteria femoral se muestra en la Figura 2. Para confirmar la inducción de isquemia de las extremidades inferiores, láser Doppler de análisis de imágenes de perfusión demuestra una reducción drástica en el flujo de sangre a la extremidad isquémica, en comparación con la rama de control, como se muestra en la Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="Figura 1" width="600" height="406" /> Figura 1. Anatomía de la vasculatura extremidades inferiores. Los asteriscos indican la ubicación de la ligadura de la inducción de isquemia extremidades inferiores. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="Imagen 2" width="600" height="450" /> Figura 2. Esquema representativo que muestra la anatomía de las extremidades inferiores después de la ligadura de la arteria femoral en los sitios proximal y distal después de la eliminación de la arteria femoral. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="Figura 3" width="600" height="256" /> Figura 3. Laser Doppler imágenes que muestran el flujo de sangre antes y después de la inducción de isquemia de la extremidad posterior izquierda (indicado por la flecha).

<ol>
	<li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia.">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The anatomy of the laboratory mouse. , (1976).</li><li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization.">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li><li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li></ol>

Hay algunas fuentes de variabilidad a considerar al planear y ejecutar modelos de isquemia extremidades inferiores. En primer lugar, el nivel de la isquemia puede variar de acuerdo a la ubicación de la ligadura con respecto a la de las ramas laterales. Por lo tanto, para mantener la coherencia del modelo, los animales deben ser sometidos a un mismo nivel de la ligadura arterial. Otra fuente de variabilidad en la recuperación isquémica está relacionada con la edad de los animales, con animales jóvenes (6-8 semanas de edad) que tengan más rápida y completa recuperación de las tasas que los animales mayores (8-10 meses), según la evaluación hemodinámica (es decir, láser Doppler perfusión) o funcionales (es decir, prueba de esfuerzo) las medidas. Para los estudios en los que uno está evaluando un agente angiogénico, puede ser preferible utilizar animales de más edad, debido a una mayor diferencia entre los grupos se pueden observar con una intervención terapéutica. Por el contrario, para los estudios en los que uno está evaluando un factor anti-angiogénico, puede ser preferible utilizar los animales más jóvenes para maximizar el efecto del tamaño de tres. Si se realiza correctamente, debería haber un mínimo de complicaciones tales como sangrado, infección, o la mortalidad. Si se produce una hemorragia por la ruptura accidental de la vena femoral o de otros buques, una presión moderada con un algodón estéril con punta de aplicador o gasa debe ser aplicada en el sitio de la hemorragia hasta que el sangrado se detenga. Los animales que presenten signos de infección debe ser tratada con agentes anti-infecciosos. Los animales presentan gangrena significativa posible que tenga que beeuthanized. Esta complicación es más frecuente en los animales, y en algunas cepas, como los ratones BALB c 4. Además, el modelo de isquemia extremidades inferiores pueden causar dolor leve a moderado. Por lo tanto, los analgésicos como la buprenorfina o carprofeno se debe administrar como sea necesario para el tratamiento del dolor, de acuerdo con las recomendaciones de la IACUC. En conclusión, hemos demostrado un método simple y reproducible para el estudio de la PAD en un modelo murino de isquemia extremidades inferiores. El modelo de isquemia miembro posterior con láser Doppler de análisis de imágenes es un excelente sistema para el estudio de patologías vasculares y para la evaluación de candidatos terapéuticos.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Constix Cotton Swabs</td>
<td>Tool</td>
<td>Contec</td>
<td>SC-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine (Povidone-iodine)</td>
<td>Reagent</td>
<td>PDI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Kendall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>7-0 silk suture</td>
<td>Tool</td>
<td>Genzyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 vicryl suture</td>
<td>Tool</td>
<td>Ethicon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electric shaver</td>
<td>Tool</td>
<td>GE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cautery</td>
<td>Tool</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System</td>
<td>Equipment</td>
<td>Perimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine model of hindlimb ischemia 

En los Estados Unidos, la enfermedad arterial periférica (EAP) afecta a alrededor de 10 millones de personas en todo el mundo y es también frecuente. Tratamientos médicos para el alivio sintomático son limitados. Intervenciones quirúrgicas o endovasculares son útiles para algunas personas, pero a largo plazo resultados suelen ser decepcionantes. Como resultado, existe una necesidad para el desarrollo de nuevas terapias para tratar la enfermedad arterial periférica. La preparación miembro posterior isquemia es un modelo murino de la PAD, y es útil para probar nuevas terapias. Cuando se compara con otros modelos de isquemia tisular, tales como la ligadura de la arteria coronaria o cerebral, ligadura de la arteria femoral establece un modelo más simple de los tejidos isquémicos. Otras ventajas de este modelo son la facilidad de acceso a la arteria femoral y la baja tasa de mortalidad. En este video, se demuestra la metodología para el modelo murino de isquemia hindimb unilateral. Los materiales y procedimientos específicos para la creación y la evaluación del modelo se describe, incluyendo la evaluación de la perfusión de un miembro por láser Doppler. Este protocolo también puede ser utilizado para el trasplante y el seguimiento no invasivo de las células, lo cual es demostrado por Huang et al. 1.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of Hindlimb Ischemia at JoVE.com

Murine Model of Hindlimb Ischemia

El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

57.1K vistas.  Stanford University. El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

Video: Murine Model of Hindlimb Ischemia

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe and permanent neuropsychological sequelae, including mental retardation, cerebral palsy, and epilepsy. The outcomes of HIE are devastating and permanent, making it critical to identify and develop therapeutic strategies to reduce brain injury in newborns with HIE. To that end, the neonatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury has been developed to model this human condition. The HIE model was first validated by Vannucci et al 1 and has since been extensively used to identify mechanisms of brain injury resulting from perinatal hypoxia-ischemia 2 and to test potential therapeutic interventions 3,4. The HIE model is a two step process and involves the ligation of the left common carotid artery followed by exposure to a hypoxic environment. Cerebral blood flow (CBF) in the hemisphere ipsilateral to the ligated carotid artery does not decrease because of the collateral blood flow via the circle of Willis; however with lower oxygen tension, the CBF in the ipsilateral hemisphere decreases significantly and results in unilateral ischemic injury. The use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to stain and identify ischemic brain tissue was originally developed for adult models of rodent cerebral ischemia 5, and is used to evaluate the extent of cerebral infarctin at early time points up to 72 hours after the ischemic event 6. In this video, we demonstrate the hypoxic-ischemic injury model in postnatal rat brain and the evaluation of the infarct size using TTC staining.

The postnatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury is a well-established model of human neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). In this article, we describe the model of HIE in post-natal rat pups.

El modelo de encefalopatía isquémica hipóxica de la isquemia perinatal

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe ...

Investigación

Biología

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Células madre embrionarias-las células endoteliales derivadas de tratamiento de la isquemia Miembro Posterior

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD-Ligadura: un modelo murino de infarto de miocardio

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying disuse-atrophy in rodents 4-6. Our study evaluated an alternant method to the gold-standard Morey-Holton HU tail-traction technique in mice. Fifty-four female mice (4-8 mo.) were HU for 14 days (n=34) or 28 days (n=20). Recovery from HU was assessed after 3 days of normal cage ambulation following HU (n=22). Aged matched mice (n=76) served as weight-bearing controls.
Prior to HU a tail ring was formed with a 2-0 sterile surgical steel wire that was passed through the 5th, 6th, or 7th inter-vertebral disc space and shaped into a ring from which the mice were suspended. Vertebral location for the tail-ring was selected to appropriately balance animal body weight without interfering with defecation.
We determined the success of this novel HU technique by assessing body weight before and after HU, degree of soleus atrophy, and adrenal mass following HU. Body weight of the mice prior to HU (24.3 &plusmn; 2.9g) did not significantly decline immediately after 14d of HU (22.7 &plusmn; 1.9g), 28d of HU (21.3 + 2.1g) or after 3 days recovery (24.0 &plusmn; 1.8g). Soleus muscle mass significantly declined (-39.1%, and -46.6%) following HU for 14 days and 28 days respectively (p&lt;0.001). Following 3 days of recovery soleus mass significantly increased to 74% of control values. Adrenal weights of HU mice were not different compared to control mice.
The success of our novel HU method is evidenced by the maintenance of animal body weight, comparable adrenal gland weights, and soleus atrophy following HU, corresponding to expected literature values 2, 7, 8. The primary advantages of this HU method include: 1) ease of tail examination during suspension; 2) decreased likelihood of cyanotic, inflamed, and/or necrotic tails frequently observed with tail-taping and HU; 3) no possibility of mice chewing the traction tape and coming out of the suspension apparatus; and 4) rapid recovery and normal cage activity immediately after HU.

We developed an alternant hindlimb unloading model in mice. The primary advantage of our hindlimb unloading tail-ring method over the conventional Morey-Holton tail-traction technique is a simple straightforward procedure that minimizes stress upon the animal.

Un método de alternante a la modelo tradicional de la NASA Miembro Posterior descarga en ratones

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

El murino colina deficientes, suplementada con Ethionine (CDE) dieta de modelo de la lesión hepática crónica

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. Bariatric surgery is currently the most effective long-term treatment for obesity. In addition to weight loss, bariatric surgery produces additional health benefits such as remission of type 2 diabetes, remission of hypertension, and decreased risk of developing certain types of cancer. The mechanisms beyond weight loss for these benefits remain incompletely defined. Therefore, animal models of bariatric surgery are being developed and validated to identify the mechanisms leading to these benefits, with the goal of improving understanding of gastrointestinal physiology and identifying new therapeutic targets. VSG has become the most commonly performed bariatric procedure in the clinic in the United States because it is highly effective at producing weight loss and metabolic improvement, and is simpler to perform than other bariatric procedures. Therefore, we have developed and validated a murine model of VSG. This murine VSG model recapitulates many of the effects of VSG seen in humans, including improved glucose and blood pressure regulation. The method is based on isolation of the stomach, ligation of gastric vessels, and removal of 70% of the stomach by transecting along the greater curvature of the stomach. We have successfully applied this surgical protocol to various genetically modified mouse lines to define the mechanistic contributors to the benefits of VSG. Furthermore, this murine VSG model has been combined with other surgical techniques, to achieve deeper mechanistic insight. Therefore, this is a simple and versatile model for studying gastrointestinal physiology and the health benefits of bariatric surgery.

The following describes the performance of vertical sleeve gastrectomy in mice. This is a type of weight-loss surgery that involves removal of approximately 70% of the stomach.

Un modelo murino de gastrectomía en manga Vertical

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Un modelo murino de una herida de quemadura reconstruida con un injerto de piel alogénico

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most animal laboratories.&#160;Contrary to the conventional approach for double ligation of the femoral artery (DLFA), a smaller incision on the right inguinal region was made to expose the proximal femoral artery (FA) to perform DLFA. Then, using a 7-0 suture, the incision was dragged to the knee region to expose the distal FA. Magnetic resonance imaging (MRI) on bilateral hind limbs was used to detect FA occlusion after the surgery. At 0, 1, 3, 5, and 7 days after the surgery, functional recovery of the hind limbs was visually assessed and graded using the Tarlov scale. Histologic evaluation was performed after euthanizing the animals 7 days after DLFA. The procedures were successfully performed on the right leg in ten ApoE-/- mice, and no mice died during subsequent observation. The incision sizes in all 10 mice were less than 5 mm (4.2 &#177; 0.63 mm). MRI results showed that FA blood flow in the ischemic side was clearly blocked. The Tarlov scale results demonstrated that hind limb function significantly decreased after the procedure and slowly recovered over the following 7 days. Histologic evaluation showed a significant inflammatory response on the ischemic side and reduced microvascular density in the ischemic hind limb. In conclusion, this study introduces a modified technique using a miniature incision to perform hind limb ischemia (HLI) using DLFA.

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

This article demonstrates an efficient surgical approach to establish acute ischemia in mice with a small incision. This approach can be applied by most research groups without any laboratory upgrades.

Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...