Este protocolo presenta cómo crear un modelo de gangrena de almohadilla de pie de ratón mediante la administración de inhibidores de masa y coagulación de la arteria femoral. La perfusión DiI permite la visualización de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie. Este modelo es clínicamente relevante y se puede utilizar para pruebas preclínicas de drogas y para estudiar la isquemia de las extremidades.
La visualización de alta resolución de la vasculatura ofrece un medio técnicamente fácil de evaluar la neovascularización. Este modelo de gangrena de la almohadilla del pie tiene importantes aplicaciones en la investigación preclínica de la enfermedad arterial periférica y la isquemia crítica de las extremidades. La perfusión DiI es una herramienta útil para estudiar la neovascularización en modelos animales.
Demostrando el procedimiento estarán Antoine Ribieras, de residente quirúrgico, y Yulexi Ortiz, investigador asociado de mi laboratorio. Primero, haga una solución de trabajo DiI agregando 200 microlitros de solución madre DiI a 10 mililitros de la solución de diluyente de trabajo inmediatamente antes de su uso. Agitar a mano para mezclar bien.
Conecte dos o tres llaves de paso de tres vías y una aguja de mariposa de calibre 25 en serie. Prepare jeringas de 10 mililitros con cuatro mililitros de PBS, 10 mililitros de solución de DiI y 10 mililitros de formalina tamponada al 10% neutra. Conecte la jeringa con formalina al puerto de entrada proximal e inyecte la solución para eliminar el aire de la línea.
A continuación, gire la llave de paso para cerrar el puerto. Repita el mismo procedimiento, conectando las jeringas con DiI y luego PBS a los puertos de entrada medio y distal, respectivamente. Después de la eutanasia, coloque al animal en posición supina sobre una almohadilla absorbente y asegure las axilas y las extremidades inferiores con agujas.
Usando tijeras, haga una incisión transversal para abrir la cavidad abdominal, luego exponga y divida el diafragma izquierdo y derecho para acceder a la cavidad torácica. Corte la pared torácica a cada lado del esternón desde las costillas inferiores hasta la primera o segunda costilla. Use un hemostático para agarrar el extremo inferior del esternón y reflejarlo hacia la cabeza del animal para exponer la cavidad torácica.
Identifique el ventrículo izquierdo, que parece de color más claro que el derecho. Agarre suavemente el corazón con fórceps contundentes e inserte la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo. Use tijeras o una aguja de calibre 18 para perforar la aurícula derecha, permitiendo que la sangre y las soluciones de perfusión regresen al corazón para drenar.
Abra el puerto de la jeringa con PBS e inyecte manualmente de dos a cuatro mililitros a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto durante uno o dos minutos para eliminar la sangre del sistema vascular. Asegure una perfusión exitosa mediante la observación del sangrado de la aurícula derecha. Después de la inyección, cierre el puerto de la jeringa PBS.
Abra el puerto de la jeringa con DiI e inyecte de cinco a 10 mililitros a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto durante cinco minutos. Después de la inyección, cierre el puerto de la jeringa DiI y espere dos minutos para permitir la incorporación del tinte antes de la inyección del fijador. Abra el puerto de la jeringa con formalina e inyecte de cinco a 10 mililitros a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto durante cinco minutos.
Después de la inyección, retire la aguja del ventrículo izquierdo. Usando tijeras pesadas, disloque la tibia en el tobillo, separando completamente los pies izquierdo y derecho de la parte inferior de las piernas. Coloque los pies cosechados en una placa de 12 pocillos con uno o dos mililitros de solución de formalina al 10%.
Envuelva el plato con papel de aluminio y guárdelo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, reemplace la solución fijadora en una placa de 12 pocillos con uno o dos mililitros de PBS por pozo. Haga una incisión longitudinal con un bisturí en la parte plantar y dorsal del pie.
Luego, usando pinzas dentadas y un pequeño hemostático, retire cuidadosamente toda la piel del pie y los dedos, sin dañar los tejidos blandos subyacentes. Para montar tejidos, coloque individualmente los pies entre dos portaobjetos de microscopio de vidrio con una almohadilla de biopsia de espuma doblada sobre sí misma en cada extremo. Use dos pequeños clips aglutinantes para comprimir las diapositivas de vidrio juntas en cada extremo.
Alternativamente, devuelva la almohadilla del pie a una placa de 12 pocillos con uno o dos mililitros de PBS. Después de cubrirlo con papel de aluminio, guárdelo a cuatro grados centígrados para mantener la fluorescencia hasta por un mes. Encienda el sistema de imágenes, inicie el software de adquisición y use un objetivo de baja ampliación o apertura numérica baja para capturar imágenes.
Haga clic en sí al cuadro de diálogo Activar etapa. Active el láser de 561 nanómetros en la pestaña de configuración. En la pantalla principal, active una trayectoria de haz visible haciendo clic en el botón visible.
Configure un detector en el rango de 570 a 600 nanómetros haciendo clic en la casilla de verificación activa correspondiente. Seleccione el icono de escaneo de mosaico en la pestaña de adquisición y establezca la resolución deseada. Coloque la muestra de tejido montada en seco comprimida entre portaobjetos de vidrio en la etapa del microscopio y enfoque el tejido.
Desplácese hasta una esquina de la muestra. En el menú de escaneo de mosaico, haga clic en el botón marcar posición. Navegue hasta la esquina opuesta y haga clic en el botón marcar posición nuevamente configurando los límites de escaneo.
Para establecer la profundidad de la pila Z, haga clic en el botón en vivo. Desplácese hasta el centro de la muestra y utilice la perilla del eje Z para desplazarse hasta la parte inferior de la muestra. En la pestaña de adquisición, en el menú Z-stack, haga clic en el botón Comenzar.
Desplácese hasta la parte superior de la muestra y haga clic en el botón final. Haga clic en el tamaño del paso z y configúrelo en el valor deseado. Luego haga clic en comenzar para comenzar la adquisición de imágenes.
La figura muestra la variación en la pérdida de tejido que se puede esperar de este modelo una semana después de la cirugía con puntuaciones FABER registradas en la esquina inferior derecha de cada imagen. Las imágenes de microscopía de reconstrucción revelan una anatomía vascular normal en la almohadilla del pie de control no ligada en comparación con la perfusión severamente disminuida a la almohadilla del pie de la extremidad posterior ligada cinco días después de la cirugía. 20 días después de la cirugía, la perfusión en la almohadilla del pie ha mejorado significativamente, aunque no en la medida del control no ligado.
El vídeo muestra que la representación de superficies se creó utilizando la funcionalidad de animación. Enjuague todas las burbujas de aire del conjunto de perfusión. Si los pulmones se expanden y se vuelven rosados durante la perfusión, la aguja ha penetrado en el ventrículo derecho y debe retraerse ligeramente.
Los tejidos de las extremidades se pueden utilizar para la inmunotinción para evaluar la necrosis muscular, la regeneración de tejidos, la densidad de los vasos y el reclutamiento de células progenitoras y otras células de reparación de tejidos. La técnica de perfusión DiI en este modelo de gangrena murina se ha utilizado en estudios de terapias génicas y celulares. La investigación tiene como objetivo mejorar la perfusión en extremidades de pacientes con isquemia crítica de extremidades.
