Esta investigación fue financiada por becas-en-Ayudas a Jóvenes Científicos (A) (# 16680015), Grant-en-Ayudas a la investigación exploratoria (# 16653065), Grant-en-Ayudas a la Investigación Científica en las áreas prioritarias (# 18023022, # 18016012 y 18053015 #) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, Grant-in-Aid de Promoción de Estudios Fundamentales en Ciencias de la Salud del Instituto Nacional de la innovación biomédica (NIBIO), Grant-in- La ayuda de Japón Neuroinformática Center (NIJC), RIKEN

<ol><li> El aparato utilizado para la prueba de la transición de luz / oscuridad consistió en una jaula (21x42x25 cm) dividida en dos secciones de igual tamaño de una partición con la puerta (Ohara &amp; Co., de Tokio). </li><li> Los ratones se encuentran tres o cuatro por jaula en una habitación con un 12 hr luz / oscuridad ciclo (luces a las 7:00 AM) con acceso ad libitum al alimento y agua. Idealmente, dos controles y dos mutantes se encuentran juntos, por la reorganización de los ratones tan pronto como se genotipo en el momento del destete. Las pruebas de comportamiento se lleva a cabo 09 a.m.-06:00 PM Todos los jaulas de ratones se transfieren a la sala de pruebas de comportamiento de 30 minutos antes de la primera prueba comienza. </li><li> Una cámara es iluminado por diodos blancos (390 lux), mientras que la otra cámara es oscuro (2 lux). Los ratones se colocan en el lado oscuro y la puerta se abre automáticamente 3 segundos después de que el ratón es detectado por la cámara infrarroja. La puerta se utiliza para que los ratones no entran en la cámara de luz inmediatamente después de la liberación con su motivación para escapar de experimentador, ya que la latencia para entrar en la cámara de luz puede servir como un índice de ansiedad-como comportamiento. </li><li> Los ratones se les permite moverse libremente entre las dos cámaras con la puerta abierta durante 10 minutos. La aplicación que se utiliza para obtener y analizar los datos de comportamiento (imagen LD4) se basa en el programa J dominio público de la imagen (desarrollado byWayne Rasband en el Instituto Nacional de Salud Mental y está disponible en http://rsb.info.nih.gov/ij /), que fue modificada por Tsuyoshi Miyakawa (disponible a través de O&#39;Hara &amp; Co., Tokio, Japón). </li><li> La distancia recorrida en cada cámara, el número total de transiciones, el tiempo empleado en la cámara de cada uno, y la latencia para entrar en el chamberare de luz registrados por la imagen LD4 programa. </li><li> Después de cada ensayo, todas las cámaras se limpian con agua hipocloroso súper para evitar un sesgo sobre la base de señales olfativas. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Uso de Animales y el Comité de Atención de la Universidad de Kyoto. Tsuyoshi Miyakawa está asociado con el pájaro, Japonesa de Ciencia y Tecnología de la Agencia, Saitama, Japón.

A pesar de todas las secuencias del genoma del ratón ha sido determinado, las funciones de la mayoría de estos genes no se conocen. Gen de metas técnicas, sin embargo, se puede utilizar para suprimir o manipular un gen específico en ratones (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004).. La influencia de un determinado gen en una determinada conducta puede ser determinada por la realización de análisis de comportamiento de los ratones mutantes (Takao y Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Como una prueba para el fenotipo de comportamiento de los ratones mutantes, la prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones (Crawley, 2000). La prueba se basa en la aversión natural de los ratones a las zonas muy iluminadas y en su comportamiento espontáneo de exploración en nuevos ambientes (Crawley, 1985). La prueba es sensible al tratamiento con fármacos ansiolíticos (Crawley, 1985). El aparato consiste en una cámara oscura y una cámara iluminada. Una apertura restringida, 3 cm de alto por 5 cm de ancho, une las dos cámaras. Los ratones se les permite moverse libremente entre las dos cámaras. El número de entradas en la cámara de brillantes y la duración del tiempo pasado allí se utilizan como índices de brillantes-el espacio de ansiedad en los ratones. La prueba de la transición de luz / oscuridad fue desarrollado originalmente por Crawley et al (Crawley y Goodwin, 1980). Hay dos diferencias entre su versión original y nuestra prueba. En primer lugar, la cámara de luz es mayor que la cámara oscura en la versión original, mientras que el tamaño de las dos cámaras es el mismo que en nuestra versión de la prueba. En segundo lugar, en la versión original, la cámara de luz no tenía techo y las paredes de la cámara de luz eran transparentes (Crawley y Goodwin, 1980), mientras que el uso de plástico blanco opaco para el techo y las paredes de la cámara de luz. Estas diferencias, a saber, el tamaño y la apertura de la cámara de luz, permite la detección simultánea de brillantes espacio ansiedad, así como espacios abiertos de ansiedad en la versión original de la prueba. En nuestro laboratorio, sin embargo, de espacio abierto de ansiedad-como el comportamiento de los ratones se probó en un laberinto elevado. Las paredes y el techo opaco, tamaño de la cámara de luz, y nuestra luz específica / oscuridad protocolo de transición de la prueba es más específico para la detección de brillantes-el espacio de ansiedad en comparación con la versión original. Aunque la prueba de transición claro / oscuro y elevado más laberinto son utilizados para la evaluación de la ansiedad-como el comportamiento, los resultados no siempre son coherentes. Por ejemplo, el prosencéfalo específicos ratones knockout calcineurina pasar una disminución en la cantidad de tiempo en la cámara de luz en la prueba de la transición de luz / oscuridad, pero una mayor cantidad de tiempo en los brazos abiertos en el laberinto elevado más (Miyakawa et al., 2003) . La hipótesis de que nuestra luz / oscuridad de prueba de transición y las pruebas más elevada laberinto evaluar los diferentes aspectos de la ansiedad-como el comportamiento, tales como brillante del espacio ansiedad y espacios abiertos de ansiedad-como comportamiento. Para probar esta hipótesis, se utilizó un gran conjunto de datos recolectados a través de los mismos ratones en ambas pruebas. En nuestro laboratorio, realizamos las baterías del comportamiento de prueba que abarcan muchos ámbitos para la detección de la importancia del comportamiento de los genes. La batería de pruebas requiere varias semanas para completar. Durante el período de prueba, las jaulas de ratones se mantienen en un estante en nuestras instalaciones. Si los ratones son transportados a nuestro laboratorio de otras instituciones, que están habituados al medio ambiente de nuestras instalaciones por lo menos durante una semana. Después del período de habituación, los ratones son sometidos a un chequeo médico general y neurológico de detección (Miyakawa et al., 2003), y después de estos exámenes sencillos, los ratones son sometidos a la prueba de la transición de luz / oscuridad. La prueba se realiza en una habitación a prueba de sonido experimental a los 30 minutos de habituación a la sala experimental, como se muestra en la película. Hemos evaluado más de 60 cepas de ratones mutantes modificados genéticamente mediante el protocolo se muestra en la película y tiene un gran conjunto de datos en bruto para más de 3.000 ratones (incluidos de tipo salvaje y ratones mutantes). Se realizaron análisis de los factores para tomar ventaja de la gran cantidad de datos en bruto. De hecho, se han detectado diversos factores de cada prueba (datos no publicados), aunque hubo algunas correlaciones significativas entre los índices (datos no publicados) .. Esos datos serán divulgados como parte de una base de datos pública que ahora estamos construyendo. En nuestra batería de pruebas, de tipo salvaje camada suelen ser utilizados como control. Como una cepa de fondo, los ratones C57BL/6J se utilizan comúnmente. Se recogieron los datos de los ratones C57BL/6J utilizó como control de ratones mutantes en la batería de pruebas. Los índices obtenidos de ratones C57BL/6J en nuestra prueba de la transición de luz / oscuridad fueron como sigue (n = 795; media ± SEM), la distancia recorrida: 846.5 8,88 cm en la cámara de luz, 1478,5 9,53 cm en la cámara oscura, la duración del tiempo pasado : 215,8 1,85 s en la luz, 395,8 1,86 s en la oscuridad, el número de transiciones entre los compartimientos: 30,52 0,43; latencia para entrar en la cámara de luz: 64,94 2,40 s. Movimiento de los ratones alrededor de las entradas a las cámaras es detectado por la cámara y se cuenta como tiempo de permanencia en los cHambers. Debido a esto, la suma de la duración media del tiempo dedicado a la luz y que en los compartimentos de oscuridad fue mayor que el de toda la duración de la prueba (600 s). En nuestro protocolo, un ratón se coloca primero en la cámara oscura. Tres segundos después de colocar el ratón en la cámara oscura, la puerta entre las cámaras de forma automática se abre y el ratón se puede mover libremente entre las dos cámaras. Ratones C57BL/6J pasar menos tiempo en la cámara de luz que en la cámara oscura (p &lt;0,0001, la duración si el tiempo dedicado a la luz: 215,8 1,85 s, la duración del tiempo pasado en la oscuridad: 316,3 2,11 s [el tiempo transcurrido en la oscuridad se no incluye el tiempo inicial dedicado a la oscuridad antes de entrar en la cámara de la luz por primera vez], n = 795, a la par-t test). Esto indica que los ratones C57BL/6J tienden a evitar la cámara de luz, y que el tiempo empleado en la luz es un buen índice de la ansiedad-como comportamiento. Los resultados obtenidos de las distintas cepas de ratones mutantes son fácilmente comparables, porque todos los datos se han obtenido utilizando el mismo protocolo. Para obtener resultados fenotipo de una cepa de ratones mutantes que pueden reproducirse fácilmente y en comparación con los datos de otros mutantes, los métodos de ensayo de comportamiento debe ser lo más parecido posible entre los laboratorios. Crabbe y sus colegas evaluaron la interacción entre el comportamiento del ratón y el medio ambiente de laboratorio utilizando exactamente las mismas cepas puras y una cepa mutante nulo. En su estudio, los aparatos, protocolos de prueba, y muchas otras variables ambientales fueron rigurosamente estandarizado. A pesar de la estandarización, se encontraron diferencias sistemáticas en el comportamiento a través de los laboratorios, aunque también se detectaron diferencias de tensión en todos los comportamientos (Crabbe et al., 1999). Se informó de que las variables incontrolables y caracterización de los experimentos mutantes pueden producir resultados que son idiosincrásicos a un laboratorio particular. Las diferencias de procedimiento que existe entre los laboratorios hacen que sea difícil de replicar o comparar los resultados entre laboratorios. Aquí, presentamos nuestro protocolo de la prueba de la transición de luz / oscuridad como una película para que los detalles del protocolo se puede demostrar. El establecimiento de la documentación visual del protocolo facilitará una mejor comprensión de los detalles de los procedimientos experimentales, lo que permite la estandarización de los protocolos utilizados en laboratorios y para la comparación de los fenotipos del comportamiento de las distintas cepas de ratones mutantes evaluó a través de esta prueba. Películas de otros protocolos, como por el laberinto elevado, además, prueba de campo abierto, Porsolt prueba de natación forzada, el condicionamiento del miedo, que utilizamos en nuestra batería de pruebas de comportamiento se están haciendo actualmente para su publicación en futuros artículos de revistas de vídeo.

light/dark transition test for mice

A pesar de todas las secuencias del genoma del ratón ha sido determinado, que aún no conocen las funciones de la mayoría de estos genes. Gen de metas técnicas, sin embargo, se puede utilizar para suprimir o manipular un gen específico en ratones. La influencia de un determinado gen en una determinada conducta puede ser determinada por la realización de análisis de comportamiento de los ratones mutantes. Como una prueba para el fenotipo de comportamiento de los ratones mutantes, la prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. La prueba se basa en la aversión natural de los ratones a las zonas muy iluminadas y en su comportamiento espontáneo de exploración en ambientes nuevos. La prueba es sensible al tratamiento con medicamentos ansiolíticos. El aparato consiste en una cámara oscura y una cámara iluminada. Los ratones se les permite moverse libremente entre las dos cámaras. El número de entradas en la cámara de brillantes y la duración del tiempo que pasó allí están los indicadores de brillantes-el espacio de ansiedad en los ratones. Para obtener resultados fenotipo de una cepa de ratones mutantes que pueden reproducirse fácilmente y en comparación con los de otros mutantes, los métodos de ensayo de comportamiento debe ser lo más parecido posible entre los laboratorios. Las diferencias de procedimiento que existe entre los laboratorios, sin embargo, hacen que sea difícil de replicar o comparar los resultados entre laboratorios. Aquí, presentamos nuestro protocolo de la prueba de la transición de luz / oscuridad como una película para que los detalles del protocolo se puede demostrar. En nuestro laboratorio, hemos evaluado más de 60 cepas de ratones mutantes utilizando el protocolo se muestra en la película. Esos datos serán divulgados como parte de una base de datos pública que ahora estamos construyendo. Visualización del protocolo facilitará la comprensión de los detalles del procedimiento experimental completa, que permite la estandarización de los protocolos utilizados en los laboratorios y las comparaciones de los fenotipos del comportamiento de las distintas cepas de ratones mutantes evaluó a través de esta prueba.

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Light/dark Transition Test for Mice

La prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. A continuación, presentamos una película que muestra los procedimientos detallados sobre cómo realizar la prueba.

Luz / oscuridad de transición de prueba para ratones

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

51.7K vistas.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. La prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. A continuación, presentamos una película que muestra los procedimientos detallados sobre cómo realizar la prueba.

Video: Light/dark Transition Test for Mice

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Laberinto elevado Plus para ratones

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Investigación

Biología

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Modelo murino de enfermedad de Parkinson: de la lesión 6-OH dopamina a prueba de comportamiento

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.