이 연구에 의해 지원되었다 기금 - - 에이드의 젊은 과학자 탐험 연구 (A) (# 16680015), 보조금 (# 16653065), 우선 분야에 대한 학술 연구를위한 보조금 (# 18023022를위한 # 교육부, 문화, 스포츠, 과학, 그리고 일본의 기술, 그랜트 - - 에이드의 바이오 메디컬 혁신의 국립 연구소 (NIBIO)의 건강 과학 기초 연구의 추진에서 그랜트 -에 -에서 18016012와 # 18053015) Neuroinformatics 일본 센터 (NIJC), RIKEN에서 원조

<ol><li> 어둠 / 빛으로 전환 테스트에 사용되는 장치는 문이있는 파티션 (오하라 &amp; (주), 도쿄)에서 동일한 크기의 두 부분으로 나누어 케이지 (21x42x25 cm)로 구성되어. </li><li> 마우스는 음식과 물이 광고 libitum 접속 12 시간 라이트 / 어두운주기 (오전 7시 불을)와 한 방에 케이지 당 3-4 거주하고 있습니다. 이상적으로, 두 컨트롤 두 돌연변이 바로 그들이 이유 시에 genotyped 그대로 생쥐를 다시 구성하여 함께 위치해있다. 행동 검사는 오전 9시 사이에 수행하고 첫 번째 재판이 시작되기 전에 마우스를 포함한 모든 연습장이 동작 테스트 룸으로 30 분 전송됩니다 PM 6시입니다. </li><li> 다른 챔버 (2 룩스) 어두운 반면 하나의 챔버는 밝은, 백색 다이오드 (390 룩스)의 조명입니다. 생쥐는 어둠의 세력에 배치하고 마우스가 적외선 카메라 감지 후 문이 자동으로 삼초를 개설합니다. 문이 빛을 챔버를 입력 지연이 불안과 같은 행동의 인덱스 역할을 수 있기 때문에 마우스가 실험자에서 탈출하기 위해 동기와 함께 출시 직후 빛을 챔버를 입력하지 않도록하는 데 사용됩니다. </li><li> 생쥐 10 분 개방과 함께 두 실 사이에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. 행동 데이터 (이미지 LD4)를 취득하고 분석에 사용되는 응용 프로그램은 공개 도메인 이미지 J 프로그램 (정신 건강의 국립 연구소 byWayne Rasband을 개발하고 http://rsb.info.nih.gov/ij에서 구할 수를 기반으로 츠요시 미야 카와 (오하라 &amp; (주), 일본 도쿄를 통해 제공되는)로 바뀌었습니다 /). </li><li> 거리는 각각의 챔버에서 여행 전환의 총 개수는 시간은 각 챔버의 소비, 이미지 LD4 프로그램에 의해 기록된 조명 chamberare를 입력 대기. </li><li> 각각의 시험 후, 모든 여왕님 후각 단서에 따라 편견을 방지하기 위해 슈퍼 hypochlorous 물로 세척합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

모든 절차가 교토 대학의 동물 사용 및 관리위원회에 의해 승인되었습니다. 츠요시 미야 카와는 새, 일본의 과학 기술 기관, 사이 타마, 일본과 관련된 것입니다.

마우스 게놈 시퀀스의 모든 결정되었습니다 있지만, 이러한 유전자의 대부분의 기능은 알려져 있지 않습니다. 유전자는 타겟팅 기법을하지만, 마우스의 특정 유전자 (.; 오스틴 외, 2004. 아이바 외, 2007) 삭제하거나 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 특정 행동에 특정 유전자의 영향은 다음 돌연변이 생쥐의 행동 분석을 (.; 타카오 외, 2007 타카오와 미야 카와, 2006) 실시에 의해 결정하실 수 있습니다. 돌연변이 생쥐의 행동 phenotyping을위한 시험으로, 어둠 / 불빛 전이 검사는 생쥐의 행동 (크롤리, 2000)와 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 시험은 밝게 조명 영역에 생쥐의 자연 혐오감과 소설 환경에서 자연 탐험 행동 (크롤리, 1985)을 기반으로합니다. 시험은 anxiolytic 약물 치료 (크롤리, 1985)에 민감합니다. 장치는 어두운 챔버와 밝은 조명 챔버로 구성되어 있습니다. 5cm 너비로 3cm 높이 제한 개방은 두 방을 연결합니다. 생쥐 두 실 사이에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. 밝은 챔버에 항목과 시간의 기간의 숫자는 생쥐에 밝은 공간 불안 지수가 거기에 사용됩니다 보냈다. 어둠 / 빛으로 전환 시험은 원래 크롤리와 동료 (크롤리와 굿윈, 1980)에 의해 개발되었습니다. 자신의 원래 버전 및 테스트 사이를 둘 다 차이가 있습니다. 두 챔버의 크기가 시험 우리의 버전에서 동일한 반면 첫째, 조명 챔버는 원래 버전의 어두운 챔버보다 큽니다. 둘째, 원래 버전에서 빛이 챔버는 천정에 없었다 우리가 빛을 챔버의 천장과 벽면에 대한 불투명 흰색 플라스틱을 사용하면서 조명 챔버의 성벽 (크롤리와 굿윈, 1980) 투명했다. 즉 이러한 차이, 빛의 챔버의 크기와 개방은 동시 밝은 공간 불안의 탐지뿐만 아니라 시험의 원래 버전에서 오픈 스페이스에 대한 불안감 수 있습니다. 저희 연구실에서는, 그러나, 오픈 스페이스 생쥐의 행동과 같은 불안이 높은 플러스 미로에서 테스트됩니다. 불투명 벽, 천정, 조명 챔버의 크기, 그리고 구체적인 가벼운 / 어두운 전환 테스트 프로토콜의 원래 버전에 비해 밝은 공간 불안 검출에 대한 더 전문입니다. 어둠 / 빛으로 전환 테스트 및 고가 플러스 미로 모두 행동과 같은 불안을 평가에 사용되고 있지만, 결과는 항상 일관성이 없습니다. 예를 들어, forebrain 특정 calcineurin의 녹아웃 마우스는 어둠 / 빛으로 전환 시험에서 조명 챔버의 시간의 감소 금액을 지출하지만, 고가 플러스 미로에서 쌍수를 시간의 증가 금액 (미야 카와 외., 2003) . 우리는 우리의 빛 / 어둠 전이 테스트 및 고가 플러스 미로 테스트 같은 밝은 공간 불안과 개방 공간 불안과 같은 행동으로 불안과 같은 행동의 다양한 측면을 평가하는 것이 가상. 이 가설을 테스트하기 위해, 우리는 큰 데이터를 모두 테스트에서 동일한 생쥐를 사용하여 수집된 세트를 사용합니다. 저희 연구실에서는, 우리는 유전자의 행동 중요성에 대한 화면으로 여러 도메인을 다루는 행동 테스트 배터리를 실시합니다. 테스트 배터리는 몇 주를 완료해야합니다. 테스트 기간 동안, 마우스 케이지는 우리 시설에 선반에 보관됩니다. 생쥐가 다른 기관에서 우리 실험실로 운반하는 경우, 그들은 적어도 1 주일 우리 시설의 환경에 길들여지지하고 있습니다. 요법 이니 기간 후, 마우스는 일반 건강 진단 및 neurologic 심사 (미야 카와 외., 2003)를 받게되며, 다음의 간단한 시험 후, 생쥐는 어둠 / 빛으로 전환 테스트를 받게됩니다. 영화 같이 시험, 실험 방에 요법 이니, 30 분 후 사운드 증명 실험 실에서 실시됩니다. 우리는 영화에 표시된 프로토콜을 사용하여 유전자 조작 돌연변이 생쥐의 60 개 이상 변종을 평가하고보다 3000 마우스 (야생 - 타입과 돌연변이 생쥐 포함)에 대한 원시 데이터의 큰 세트를 가지고있다. 우리는 원시 데이터의 큰 집합을 활용 요소 분석을 실시했다. 색인 (게시되지 않은 데이터) 사이에 중요한 상관 관계가 있었지만 실제로, 우리는 각 테스트 (게시되지 않은 데이터) 다른 요소를 감지 ... 이러한 데이터는 지금 우리가 건설하는 공공 데이터베이스의 일부로 공개되지 않습니다. 우리의 테스트 배터리에 야생 형 littermates은 일반적으로 컨트롤로 사용됩니다. 배경 스트레인으로 C57BL/6J 마우스는 일반적으로 사용됩니다. 우리는 시험 배터리의 돌연변이 쥐를의 제어로 사용 C57BL/6J 마우스의 데이터를 수집. 다음과 같이 우리의 어두운 / 라이트 전이 시험 C57BL/6J 마우스에서 얻은 색인 있었다 (n은 = 795이; 의미 SEM), 거리 여행 : 조명 챔버의 846.5 8.88 cm, 어두운 실내에서 1478.5 9.53 cm, 시간의 기간 동안 : 빛 가운데 215.8 1.85 S, 어둠 속에서 395.8 1.86들, 구획 사이의 전환의 개수 : 30.52 0.43; 빛을 챔버를 입력 대기 시간 : 64.94 2.40 S. 방으로 입구 주변 생쥐의 움직임은 카메라에 의해 감지와 C 모두에서 보낸 시간으로 계산됩니다hambers. 이 때문에, 시간의 의미 기간의 합계가 빛 가운데 지출과 어두운 구획의 테스트 (600 S)의 전체 기간의보다 큰 것을. 우리의 프로토콜에서는, 마우스는 처음 어두운 챔버에 배치됩니다. 세 초 어둠 챔버에 마우스를 배치 후 챔버 사이의 문이 자동으로 열리고 마우스 두 실 사이를 자유롭게 이동할 수 있습니다. 215.8 1.85 초, 어둠 속에서 보낸 시간 소요 시간 : 316.3 2.11 S [시간 어둠 속에 보냈다 않습니다 C57BL/6J 마우스가 (P &lt;0.0001, 기간 시간이 조명에 보낸 경우 어두운 챔버에 비해 빛의 챔버에 적은 시간을 보내고 처음으로 빛을 챔버], N = 795, 이점 - T 테스트)를 입력하기 전에 어둠 속에서 보낸 초기 시간을 포함하지 않습니다. 이것은 C57BL/6J 마우스가 빛을 챔버를 방지하는 경향을 나타냅니다, 그리고 빛 속에서 보낸 시간이 불안과 같은 행동을 좋은 인덱스입니다. 모든 데이터가 같은 프로토콜을 사용하여 얻은 돌연변이 때문에 마우스의 다양한 변종에서 얻은 결과는 쉽게 비교됩니다. 쉽게 재현 및 기타 돌연변이의 데이터와 비교할 수 있습니다 돌연변이 생쥐의 변형의 결과를 얻으려면 phenotyping, 행동 테스트 방법은 실험실 간의 가능한 동일해야합니다. 크래브 및 동료 정확히 같은 근친 변종 하나의 NULL 돌연변이 변종을 사용하여 마우스 동작 및 실습 환경 사이의 상호 작용을 테스트했습니다. 그들의 연구에서, 장치, 시험 프로토콜 및 여러 환경 변수를 엄격하게 표준화되었다. 그들은 또한 모든 동작 (크래브 외., 1999)의 변형의 차이를 감지하지만, 표준화에도 불구하고 그들은 실험실에 걸쳐 행동의 체계적인 차이를 발견했습니다. 그들은 돌연변이를 특성화 통제 변수와 실험 특정 실험실에 사안별로 다르며, 결과를 얻을 수 있습니다 보도했다. 실험실 사이에 존재하는 절차적 차이점은 어려운 실험실 간의 결과를 복제하거나 비교합니다. 여기에서 우리는 프로토콜의 세부 사항을 증명 할 수 있도록 동영상으로 어둠 / 빛으로 전환 테스트를위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜의 시각 설명서를 구축하는 것은 실험실 걸쳐 돌연변이 생쥐의 다양한 변종의 행동 phenotypes의 비교에 사용되는 프로토콜의 표준화를위한 수 있도록 실험 절차의 세부 사항의 이해를 촉진이 테스트를 사용하여 평가됩니다. 이러한 우리의 행동 테스트 전지에서 사용하는 고가 플러스 미로, 오픈 필드 테스트 porsolt 강제 수영 검사, 공포 컨디셔닝을 위해 다른 프로토콜의 동영상은 현재 미래의 비디오 저널 기사로 게시를 위해 만들어지고 있습니다.

light/dark transition test for mice

마우스 게놈 시퀀스의 모든 결정했지만, 아직이 유전자의 대부분의 기능을 모르겠어요. 유전자는 타겟팅 기법을하지만, 마우스에서 특정 유전자를 삭제하거나 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 특정 행동에 특정 유전자의 영향은 다음 돌연변이 생쥐의 행동 분석을 실시하여 결정하실 수 있습니다. 돌연변이 생쥐의 행동 phenotyping을위한 시험으로, 어둠 / 불빛 전이 검사는 생쥐의 행동과 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 시험은 밝게 조명 영역에 생쥐의 자연 혐오감과 소설 환경에서 자연 탐험 행동을 기반으로합니다. 시험은 anxiolytic 약물 치료에 민감합니다. 장치는 어두운 챔버와 밝은 조명 챔버로 구성되어 있습니다. 생쥐 두 실 사이에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. 밝은 챔버에 항목과 시간의 기간의 숫자는 생쥐에 밝은 공간 불안의 인덱스가있다 보냈다. 쉽게 재현과 다른 돌연변이의 기능과 비교할 수 있습니다 돌연변이 생쥐의 변형의 결과를 얻으려면 phenotyping, 행동 테스트 방법은 실험실 간의 가능한 동일해야합니다. 실험실 사이에 존재하는 절차적 차이점은, 그러나, 어려운 실험실 간의 결과를 복제하거나 비교합니다. 여기에서 우리는 프로토콜의 세부 사항을 증명 할 수 있도록 동영상으로 어둠 / 빛으로 전환 테스트를위한 프로토콜을 제시한다. 저희 연구실에서는, 우리는 영화에 표시된 프로토콜을 사용하여 돌연변이 생쥐의 60 개 이상 변종을 평가했습니다. 이러한 데이터는 지금 우리가 건설하는 공공 데이터베이스의 일부로 공개되지 않습니다. 프로토콜의 시각화는 실험실과 돌연변이 생쥐의 다양한 변종의 행동 phenotypes의 비교에서 사용 프로토콜의 표준화에 대한 허용, 전체 실험 절차의 세부 사항의 이해를 촉진이 테스트를 사용하여 평가됩니다.

Watch this Scientific Journal Video about Light/dark Transition Test for Mice at JoVE.com

Light/dark Transition Test for Mice

어둠 / 빛으로 전환 시험은 마우스의 동작과 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리가 테스트를 실시하는 방법에 대한 자세한 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

마우스에 대한 진한 / 라이트 전환 테스트

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

52.3K 조회수.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. He did. So what?

비디오: Light/dark Transition Test for Mice

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

마우스에 대한 고가 플러스 메이즈

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

연구

생물학

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

파킨슨병에 대한 Murine 모델 : 6 - OH 도파민의 병변에서 행동 테스트

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.