Esta pesquisa foi apoiada pela Grants-in-Aid para Jovens Cientistas (A) (# 16680015), Grant-in-Aid para a Investigação exploratória (# 16653065), Grant-in-Aid para a Investigação Científica em Áreas Prioritárias (# 18023022, # 18016012 e # 18053015) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão, Grant-in-Aid de Promoção de Estudos Fundamentais em Ciências da Saúde do Instituto Nacional de Inovação Biomédica (NIBIO), Grant-in- ajuda de Neuroinformática Japão Center (NIJC), RIKEN

<ol><li> O aparelho utilizado para o teste de transição claro / escuro consistiu em uma gaiola (21x42x25 cm) dividida em duas secções de igual tamanho de uma partição com porta (Ohara &amp; Co., Tokyo). </li><li> Os ratos são alojados 03:57 por gaiola em uma sala com um 12 horas de ciclo claro / escuro (luzes acesas às 07:00) com acesso ad libitum à água e comida. Idealmente, dois controles e dois mutantes estão alojados juntos, re-organizar os ratos logo que são genotipados no momento do desmame. Testes comportamentais é realizada 09h00 - 18:00 Todas as gaiolas de camundongos são transferidos para a sala de testes de comportamento 30 min antes do primeiro julgamento começa. </li><li> Uma câmara é profusamente iluminado por diodos branco (390 lux), enquanto a outra câmara escura (2 lux). Os ratos são colocados no lado escuro ea porta é aberta automaticamente 3 segundos após o mouse é detectado pela câmera infravermelha. A porta é usado para que os ratos não entram na câmara de luz imediatamente após a liberação com a sua motivação para escapar do pesquisador, uma vez que a latência para entrar na câmara de luz pode servir como um índice de ansiedade-como o comportamento. </li><li> Os ratos são autorizados a circular livremente entre as duas câmaras com a porta aberta por 10 min. O aplicativo utilizado para a aquisição e análise de dados comportamentais (Image LD4) é baseado no programa público de domínio J Imagem (desenvolvido byWayne Rasband no Instituto Nacional de Saúde Mental e disponível em http://rsb.info.nih.gov/ij /), que foi modificado por Tsuyoshi Miyakawa (disponível através de O&#39;Hara &amp; Co., Tóquio, Japão). </li><li> A distância percorrida em cada câmara, o número total de transições, o tempo gasto na câmara de cada um, ea latência para entrar no chamberare luz gravada pelo programa Imagem LD4. </li><li> Depois de cada julgamento, todas as câmaras são limpos com água super-hipocloroso para evitar uma polarização com base em pistas olfactivas. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso Animal e Cuidados da Universidade de Kyoto. Tsuyoshi Miyakawa está associada com BIRD, Ciência Japão e Agência de Tecnologia, Saitama, Japão.

Apesar de todas as seqüências do genoma do rato foram determinadas, as funções da maioria destes genes não são conhecidas. Gene-targeting técnicas, no entanto, pode ser usado para apagar ou manipular um gene específico em camundongos (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004).. A influência de um determinado gene em um comportamento específico pode ser determinada através da realização de análises comportamentais dos camundongos mutantes (Takao e Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Como um teste para fenotipagem comportamental de ratos mutantes, o teste de transição claro / escuro é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos (Crawley, 2000). O teste se baseia na aversão natural dos ratos para áreas iluminadas brilhantemente e em seu comportamento espontâneo exploratório em ambientes novos (Crawley, 1985). O teste é sensível ao tratamento com medicamentos ansiolíticos (Crawley, 1985). O aparelho consiste de uma câmara escura e uma câmara iluminada. A abertura restrita, 3 cm de altura por 5 cm de largura, liga as duas câmaras. Os ratos são autorizados a circular livremente entre as duas câmaras. O número de entradas na câmara clara e da duração do tempo que passei lá são usados ​​como índices de brilhante espaço ansiedade em camundongos. O teste de transição claro / escuro foi originalmente desenvolvido pela Crawley e colegas (Crawley e Goodwin, 1980). Há duas diferenças entre a sua versão original e nosso teste. Primeiro, a câmara de luz é maior do que a câmara escura na versão original, enquanto que o tamanho das duas câmaras é o mesmo em nossa versão do teste. Segundo, na versão original, a câmara de luz não tinha teto e as paredes da câmara de luz eram transparentes (Crawley e Goodwin, 1980), enquanto nós usamos plástico branco opaco para o teto e as paredes da câmara de luz. Essas diferenças, ou seja, o tamanho ea abertura da câmara de luz, permite a detecção simultânea de brilhante espaço ansiedade, bem como abrir espaço ansiedade na versão original do teste. Em nosso laboratório, no entanto, abrir espaço ansiedade-como o comportamento em camundongos é testado em um labirinto em cruz elevado. As paredes eo teto opaco, tamanho da câmara de luz, e nossa específicas de luz / escuro protocolo de teste de transição é mais especializado para detectar brilhante espaço ansiedade em relação à versão original. Embora o teste de transição claro / escuro e labirinto em cruz elevado são utilizados para avaliar a ansiedade-como o comportamento, os resultados nem sempre são consistentes. Por exemplo, prosencéfalo específicos camundongos knockout calcineurina passar uma diminuição da quantidade de tempo na câmara de luz no teste de transição claro / escuro, mas um aumento da quantidade de tempo nos braços abertos no labirinto em cruz elevado (Miyakawa et al., 2003) . Nossa hipótese é que a nossa luz / escuro de transição do teste e testes de labirinto em cruz elevado avaliar diferentes aspectos da ansiedade-como o comportamento, como o brilhante espaço ansiedade e de espaço aberto a ansiedade-como o comportamento. Para testar essa hipótese, usamos um grande conjunto de dados coletados com os ratos mesmo em ambos os testes. Em nosso laboratório, realizamos baterias de testes comportamentais que abrangem vários domínios para a tela para o significado do comportamento dos genes. A bateria de testes requer várias semanas para ser concluído. Durante o período de testes, gaiolas de rato são mantidos em um rack nas nossas instalações. Se os ratos são transportados para o nosso laboratório de outras instituições, que estão habituados ao ambiente das nossas instalações por pelo menos uma semana. Após o período de habituação, os ratos são submetidos a um exame de saúde geral e exames neurológicos (Miyakawa et al., 2003), e após esses exames simples, os ratos são submetidos ao teste de transição claro / escuro. O teste é realizado em uma sala à prova de som experimental, após 30 min de habituação à sala experimental, como mostrado no filme. Avaliou-se a mais de 60 linhagens de ratos mutantes geneticamente modificados usando o protocolo mostrado no filme e tem um grande conjunto de dados brutos para mais de 3000 ratos (incluindo do tipo selvagem e camundongos mutantes). Realizamos análises fatoriais para tirar proveito do grande conjunto de dados brutos. Na verdade, nós detectamos diversos fatores de cada teste (dados não publicados), embora houvesse algumas correlações significativas entre os índices (dados não publicados) .. Esses dados serão divulgados como parte de um banco de dados público que estamos construindo agora. Em nossa bateria de testes, do tipo selvagem littermates são normalmente utilizados como controle. Como uma tensão de fundo, os camundongos C57BL/6J são comumente usados. Foram coletados os dados de camundongos C57BL/6J usado como um controle de ratos mutantes na bateria de testes. Os índices obtidos de camundongos C57BL/6J em nosso teste de transição claro / escuro foram os seguintes (n = 795; SEM média), a distância percorrida: 846,5 8,88 centímetros na câmara de luz, 1478,5 9,53 centímetros na câmara escura; duração do tempo gasto : 215,8 s 1,85 na luz, 395,8 1,86 s no escuro; número de transições entre compartimentos: 30,52 0,43; latência entre na câmara de luz: 64,94 2,40 s. Movimento de ratos em torno das entradas para as câmaras é detectado pela câmera e é contado como tempo gasto em ambos os cHambers. Devido a isso, a soma da duração média de tempo gasto na luz e que em compartimentos escuros foi maior do que a de toda a duração do teste (600 s). Em nosso protocolo, um rato é o primeiro colocado na câmara escura. Três segundos depois de colocar o mouse na câmara escura, a porta entre as câmaras e abre automaticamente o rato pode se mover livremente entre as duas câmaras. Camundongos C57BL/6J gastar menos tempo na câmara de luz do que na câmara escura (p &lt;0,0001, duração, se o tempo gasto em luz: 215,8 1,85 s, duração do tempo gasto no escuro: 316,3 2,11 s [o tempo gasto no escuro faz não inclui o tempo inicial gasto no escuro antes de entrar na câmara de luz pela primeira vez], n = 795, teste T pareado). Isto indica que os camundongos C57BL/6J tendem a evitar a câmara de luz, e que o tempo gasto na luz é um bom índice de ansiedade-como o comportamento. Os resultados obtidos a partir de várias linhagens de ratos mutantes são facilmente comparados, porque todos os dados são obtidos utilizando o mesmo protocolo. Para obter fenotipagem resultados de uma linhagem de camundongos mutantes que podem ser facilmente reproduzidos e comparados com dados de outros mutantes, os métodos de teste comportamental deve ser o mais idêntico possível entre laboratórios. Crabbe e seus colegas testaram a interação entre o comportamento do mouse e ambiente de laboratório usando exatamente as mesmas cepas puras e uma cepa mutante nulo. Em seu estudo, o aparelho, os protocolos de teste, e muitas variáveis ​​ambientais foram rigorosamente padronizado. Apesar da padronização, eles encontraram diferenças sistemáticas no comportamento em laboratório, embora também detectou diferenças tensão em todos os comportamentos (Crabbe et al., 1999). Eles relataram que as variáveis ​​incontroláveis ​​e experiências que caracterizam os mutantes podem produzir resultados que são idiossincráticos a um laboratório particular. As diferenças que existem entre processuais laboratórios tornam difícil replicar ou comparar os resultados entre laboratórios. Aqui, apresentamos nosso protocolo para o teste de transição claro / escuro como um filme para que os detalhes do protocolo pode ser demonstrada. Elaboração de documentação visual do protocolo vai facilitar uma melhor compreensão dos detalhes de procedimentos experimentais, permitindo a padronização dos protocolos utilizados em laboratórios e para as comparações dos fenótipos comportamentais de várias linhagens de ratos mutantes avaliados através deste teste. Filmes de outros protocolos, como para o labirinto em cruz elevado, teste de campo aberto, teste de natação forçada porsolt, o condicionamento do medo, que nós usamos em nossa bateria de testes comportamentais estão sendo feitos para publicação como artigos de periódicos futuro vídeo.

light/dark transition test for mice

Apesar de todas as seqüências do genoma do rato foram determinadas, nós não sabemos ainda as funções da maioria desses genes. Gene-targeting técnicas, no entanto, pode ser usado para apagar ou manipular um gene específico em camundongos. A influência de um determinado gene em um comportamento específico pode ser determinada através da realização de análises comportamentais dos ratos mutantes. Como um teste para fenotipagem comportamental de ratos mutantes, o teste de transição claro / escuro é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos. O teste se baseia na aversão natural dos ratos para áreas iluminadas brilhantemente e em seu comportamento espontâneo exploratório em ambientes novos. O teste é sensível ao tratamento com drogas ansiolíticas. O aparelho consiste de uma câmara escura e uma câmara iluminada. Os ratos são autorizados a circular livremente entre as duas câmaras. O número de entradas na câmara clara e da duração do tempo gasto há índices de brilhante espaço ansiedade em camundongos. Para obter fenotipagem resultados de uma linhagem de camundongos mutantes que podem ser facilmente reproduzidos e comparados com os de outros mutantes, os métodos de teste comportamental deve ser o mais idêntico possível entre laboratórios. As diferenças processuais que existem entre laboratórios, no entanto, torná-lo difícil de replicar ou comparar os resultados entre laboratórios. Aqui, apresentamos nosso protocolo para o teste de transição claro / escuro como um filme para que os detalhes do protocolo pode ser demonstrada. Em nosso laboratório, temos avaliados mais de 60 linhagens de camundongos mutantes usando o protocolo mostrado no filme. Esses dados serão divulgados como parte de um banco de dados público que estamos construindo agora. Visualização do protocolo vai facilitar a compreensão dos detalhes de todo o procedimento experimental, permitindo a padronização dos protocolos utilizados em laboratórios e comparações dos fenótipos comportamentais de várias linhagens de ratos mutantes avaliados através deste teste.

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Light/dark Transition Test for Mice

O teste de transição claro / escuro é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos. Aqui, apresentamos um filme que mostra os procedimentos detalhados de como realizar o teste.

Claro / escuro Teste de transição para Ratos

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

51.8K visualizações.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. He did. So what?

Vídeo: Light/dark Transition Test for Mice

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Labirinto elevado para Ratos

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Biologia

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Modelo murino para a doença de Parkinson: a partir de 6-OH lesão dopamina para teste comportamental

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Um alelo-específico do ensaio Expressão Gênica para testar as bases funcionais das Associações de Genética

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A longo prazo de Teste de toxicidade letal com o crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.