מחקר זה נתמך על ידי מענקים-in-Aid למדענים צעירים (א) (# 16680015), גרנט-in-Aid למחקר גישוש (# 16653065), גרנט-in-Aid למחקר מדעי על אזורי עדיפות (# 18023022, # ו # 18016012 18053015) מטעם משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, הטכנולוגיה ביפן, גרנט-in-Aid מן קידום ללימודי יסוד למדעי הבריאות של המכון הלאומי של חדשנות ביו (NIBIO), גרנט ב- סיוע מן Neuroinformatics יפן מרכז (NIJC), RIKEN

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנגנון המשמש מבחן אור / חושך המעבר כללה בכלוב (21x42x25 ס&quot;מ) מחולק לשני חלקים בגודל שווה על ידי מחיצה עם דלת (אוהרה ושות&#39;, טוקיו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים הם שוכנו 03:57 לכל כלוב בחדר עם מחזור אור / חושך 12 לשעה (אורות בשעה 07:00) עם גישה כרצונך מודעה מזון ומים. באופן אידיאלי, שני פקדים שני מוטנטים הם שוכנו יחד, על ידי ארגון מחדש עכברים ברגע שהם genotyped בזמן הגמילה. הבדיקה מבוצעת ההתנהגות 9:00-18:00 כל הכלובים המכיל עכברים מועברים לחדר בדיקות התנהגות 30 דקות לפני המשפט הראשון מתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת קאמרית הוא מואר על ידי דיודות לבן (390 לוקס), ואילו החדר השני חשוך (2 lux). עכברים ממוקמות אל הצד האפל, והדלת נפתחה באופן אוטומטי לאחר 3 שניות את העכבר הוא זוהה על ידי מצלמת אינפרא אדום. הדלת משמשת כך העכברים לא להיכנס לחדר אור מיד לאחר שחרורו עם המוטיווציה שלהם לברוח הנסיין, מכיוון חביון להיכנס לחדר האור יכול לשמש כמדד להתנהגות חרדה וכדומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים רשאים לנוע בחופשיות בין שני חדרים עם דלת פתוחה 10 דקות. היישום משמש עבור רכישת וניתוח נתונים התנהגותיים (תמונה LD4) מבוססת על תוכנית J הציבור תמונה תחום (שפותחה byWayne Rasband במכון הלאומי לבריאות הנפש וזמין בכל http://rsb.info.nih.gov/ij /), אשר שונה על ידי Tsuyoshi Miyakawa (זמין באמצעות אוהרה ושות&#39;, טוקיו, יפן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרחק נסעו בתא אחד, המספר הכולל של מעברים, משך הזמן בחדר אחד, ואת חביון להיכנס chamberare אור נרשם על ידי תוכנית תמונה LD4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל משפט, כל החדרים מנקים עם מים hypochlorous סופר כדי למנוע הטיה על בסיס רמזים חוש הריח. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

כל ההליכים אושרו על ידי שימוש בבעלי חיים ועדת Care מאוניברסיטת קיוטו. Tsuyoshi Miyakawa קשורה בירד, יפן המדע והטכנולוגיה הסוכנות, סאיטמה, יפן.

למרות כל רצפי גנום העכבר נקבעו, פונקציות של רוב הגנים הללו אינם ידועים. ג&#39;ין במיקוד טכניקות, לעומת זאת, יכול לשמש כדי למחוק או לשנות גן מסוים בעכברים (Aiba et al, 2007;. אוסטין et al, 2004).. השפעתו של גן מסוים על התנהגות ספציפית אז יכול להיות נקבע על ידי ביצוע ניתוח התנהגותי של עכברים שעברו מוטציה (טאקאו ו Miyakawa, 2006;. טאקאו et al, 2007). כמבחן עבור phenotyping התנהגותיים של עכברים שעברו מוטציה, המבחן אור / חושך המעבר הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדוד התנהגות כמו חרדה בעכברים (קרולי, 2000). הבדיקה מבוססת על שנאת הטבעי של העכברים לאזורים המואר על התנהגות גישוש ספונטנית שלהם בסביבות רומן (קרולי, 1985). המבחן הוא רגיש טיפול תרופתי לטיפול בחרדות (קרולי, 1985). מנגנון מורכב חדר חושך וחדר מואר. פתיחה מוגבלת, 3 ס&quot;מ על 5 ס&quot;מ, המחברת בין שני החדרים. עכברים רשאים לנוע בחופשיות בין שני החדרים. מספר רשומות לתוך תא בהיר את משך הזמן המושקע שם משמשים מדדי חרדה בהיר מרחב בעכברים. המבחן אור / חושך מעבר פותחה במקור על ידי קרולי ועמיתיו (קרולי גודווין, 1980). ישנם שני הבדלים בין הגירסה המקורית שלהם במבחן שלנו. ראשית, תא אור גדול יותר חדר חושך בגרסה המקורית, ואילו את הגודל של שני חדרים הוא אותו בגרסה שלנו הבדיקה. שנית, בגרסה המקורית, את החדר באור לא התקרה ועל הקירות של החדר באור היו שקופים (קרולי גודווין, 1980), בעוד אנו משתמשים פלסטיק לבן אטום על התקרה והקירות של החדר באור. הבדלים אלו, כלומר את גודל ופתיחות של החדר אור, לאפשר זיהוי סימולטני של חרדה בהיר בחלל, כמו גם שטח פתוח חרדה בגרסה המקורית של המבחן. במעבדה שלנו, לעומת זאת, שטח פתוח חרדה כמו התנהגות בעכברים נבדק במבוך פלוס גבוהות. קירות אטומים התקרה, גודל החדר אור, אור הספציפי שלנו / פרוטוקול כהה מבחן המעבר מתמחה יותר לאיתור בהיר מרחב חרדה לעומת הגירסה המקורית. למרות המבחן אור / חושך המעבר במבוך גבוהות פלוס הן בשימוש להערכת חרדה כמו התנהגות, התוצאות הן לא תמיד עקבית. לדוגמה, forebrain ספציפיים בעכברים calcineurin בנוקאאוט להוציא סכום קטן של זמן בחדר אור במבחן אור / חושך המעבר, אך כמות מוגברת של זמן בזרועות פתוחות במבוך פלוס גבוהות (Miyakawa et al., 2003) . החוקרים שיערו כי האור שלנו / מבחן מעבר כהה בדיקות גבוהות פלוס מבוך להעריך אספקטים שונים של התנהגות, כמו חרדה, כגון חרדה בהיר מרחב פתוח בחלל חרדה כמו התנהגות. כדי לבחון סברה זו, היינו נתונים גדול שנאסף להגדיר באמצעות עכברים באותו בדיקות שניהם. במעבדה שלנו, אנו עורכים סוללות מבחן התנהגותי מכסה תחומים רבים למסך את המשמעות התנהגותיים של גנים. הסוללה הבדיקה דורשת מספר שבועות כדי להשלים. במהלך תקופת הבדיקה, כלובים עכבר נשמרים על מדף במתקן שלנו. אם עכברים מועברים במעבדה שלנו ממוסדות אחרים, הם מורגלים לסביבה של המתקן שלנו במשך שבוע לפחות 1. לאחר תקופת התרגלות, עכברים כפופים לבדיקה בריאות כללית ההקרנה נוירולוגית (Miyakawa et al. 2003), ואחרי בדיקות פשוטות אלה, עכברים כפופים מבחן אור / חושך המעבר. הבדיקה מתבצעת בחדר קול הוכחה ניסויית לאחר 30 דקות של התרגלות לחדר ניסיוני, כפי שמוצג בסרט. יש לנו להעריך יותר מ -60 זנים של עכברים מהונדסים גנטית מוטציה באמצעות פרוטוקול שמוצג בסרט יש קבוצה גדולה של נתונים גולמיים עבור יותר מ 3000 עכברים (כולל wild-type ועכברים שעברו מוטציה). ערכנו ניתוחים גורם לנצל להגדיר את גדולה של נתונים גולמיים. ואכן, זיהינו גורמים שונים כל בדיקה (נתונים שלא פורסמו), אם כי היו כמה מתאמים משמעותיים בין מדדי (נתונים שלא פורסמו) .. נתונים אלה יחשף כחלק מסד נתונים ציבורי שעכשיו אנחנו בונים. בשנת סוללה הבדיקה שלנו, wild-type להמלטה משמשים בדרך כלל כביקורת. כמו זן רקע, עכברים C57BL/6J משמשים בדרך כלל. אספנו את הנתונים של עכברים C57BL/6J לשמש מלאה של עכברים מוטנטים סוללה הבדיקה. המדדים המתקבלים עכברים C57BL/6J במבחן שלנו אור / חושך המעבר היו כדלקמן (n = 795; SEM אומר); המרחק: 846.5 8.88 ס&quot;מ בחדר אור, 1478.5 9.53 ס&quot;מ בחדר חשוך, משך הזמן המושקע : 215.8 1.85 s לאור, 395.8 1.86 s בחושך; מספר מעברים בין תאים: 30.52 0.43; חביון להיכנס לחדר אור: 64.94 2.40 ש &#39; התנועה של עכברים סביב הכניסות לתאי מזוהה על ידי המצלמה נחשבת הזמן המושקע הן גhambers. בגלל זה, סכום ממוצע של משך הזמן המושקע לאור וכי תאים כהה היה גדול יותר מזה של כל תקופת הבדיקה (600 י). בפרוטוקול שלנו, עכבר הוא במקום הראשון בחדר חשוך. שלוש שניות לאחר הצבת העכבר בחדר חשוך, את הדלת בין החדרים באופן אוטומטי נפתח העכבר יכולים לנוע בחופשיות בין שני החדרים. עכברים C57BL/6J להשקיע פחות זמן בחדר אור מאשר בחדר חשוך (p &lt;0.0001, אם משך הזמן המושקע לאור: 215.8 1.85 שניות, משך הזמן המושקע בחושך: 316.3 2.11 s [את הזמן בחושך עושה לא כולל את פרק הזמן הראשוני ביליתי בחושך לפני הכניסה לתא אור בפעם הראשונה], n = 795, לזווג-t מבחן). זה מעיד כי עכברים C57BL/6J נוטים להימנע תא האור, כי משך הזמן לאור היא מדד טוב של התנהגות, כמו חרדה. התוצאות שהתקבלו זנים שונים של עכברים מוטנטים מושווים בקלות, כי כל הנתונים מתקבלים באמצעות פרוטוקול זהה. כדי להשיג תוצאות phenotyping זן של עכברים מוטנטים שניתן לשחזרו בקלות, לעומת הנתונים של מוטנטים אחרים, שיטות בדיקה התנהגותית צריך להיות זהה ככל האפשר בין המעבדות. קראב ועמיתיו בדקו את האינטראקציה בין התנהגות העכבר באמצעות סביבת מעבדה בדיוק זנים טהורים באותו זן אחד מוטנטי null. במחקר שלהם, את המנגנון, פרוטוקולי הבדיקה, משתנים סביבתיים רבים היו סטנדרטיים בקפדנות. למרות הסטנדרטיזציה, הם מצאו הבדלים שיטתיים בהתנהגות מול מעבדות, למרות שהם גם זוהה זן הבדלים בכל התנהגויות (קראב et al., 1999). הם דיווחו כי משתנים בלתי נשלט וניסויים ואפיון מוטנטים עשוי להניב תוצאות שאינן ייחודי למעבדה מסוימת. ההבדלים הקיימים בין פרוצדורליים מעבדות להקשות לשכפל או ולהשוות את התוצאות בין המעבדות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלנו למבחן אור / חושך המעבר כסרט כך את הפרטים של פרוטוקול ניתן להדגים. הקמת תיעוד חזותי של הפרוטוקול יאפשר הבנה טובה יותר של הפרטים של הפרוצדורות, המאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להשתמש בה בכל מעבדות להשוואות של פנוטיפים התנהגותיים של זנים שונים של עכברים מוטנטים הוערכה באמצעות בדיקה זו. סרטים של פרוטוקולים אחרים, כגון עבור במבוך פלוס גבוהות הבדיקה, שדה פתוח, מבחן porsolt נאלץ לשחות, מיזוג פחד, כי אנו משתמשים בסוללה מבחן ההתנהגות שלנו כרגע נעשים לפרסום כמו מאמרים בעתיד וידאו.

light/dark transition test for mice

למרות כל רצפי גנום העכבר נקבעו, אנחנו עדיין לא יודעים את הפונקציות של רוב הגנים האלה. ג&#39;ין במיקוד טכניקות, לעומת זאת, יכול לשמש כדי למחוק או לשנות גן מסוים בעכברים. השפעתו של גן מסוים על התנהגות ספציפית אז יכול להיות נקבע על ידי ביצוע ניתוח התנהגותי של עכברים שעברו מוטציה. כמבחן עבור phenotyping התנהגותיים של עכברים שעברו מוטציה, המבחן אור / חושך המעבר הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדוד התנהגות כמו חרדה בעכברים. הבדיקה מבוססת על שנאת הטבעי של העכברים לאזורים המואר על התנהגות גישוש ספונטנית שלהם בסביבות רומן. המבחן הוא רגיש טיפול תרופתי לטיפול בחרדות. מנגנון מורכב חדר חושך וחדר מואר. עכברים רשאים לנוע בחופשיות בין שני החדרים. מספר רשומות לתוך תא בהיר את משך הזמן המושקע ישנם מדדים של חרדה בהיר מרחב בעכברים. כדי להשיג תוצאות phenotyping זן של עכברים מוטנטים שניתן לשכפל בקלות בהשוואה לאלו של מוטנטים אחרים, שיטות בדיקה התנהגותית צריך להיות זהה ככל האפשר בין המעבדות. ההבדלים הקיימים בין פרוצדורליים מעבדות, לעומת זאת, מקשה לשכפל או ולהשוות את התוצאות בין המעבדות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלנו למבחן אור / חושך המעבר כסרט כך את הפרטים של פרוטוקול ניתן להדגים. במעבדה שלנו, יש לנו להעריך יותר מ -60 זנים של עכברים מוטנטים באמצעות פרוטוקול שמוצג בסרט. נתונים אלה יחשף כחלק מסד נתונים ציבורי שעכשיו אנחנו בונים. ויזואליזציה של פרוטוקול תאפשר הבנה של פרטי הליך הניסוי כולו, המאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להשתמש בה בכל מעבדות השוואות של פנוטיפים התנהגותיים של זנים שונים של עכברים מוטנטים הוערכה באמצעות בדיקה זו.

Watch this Scientific Journal Video about Light/dark Transition Test for Mice at JoVE.com

Light/dark Transition Test for Mice

המבחן אור / חושך המעבר הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדוד התנהגות כמו חרדה בעכברים. כאן, אנו מציגים סרט שמראה נהלים מפורט על איך אנו עורכים את הבדיקה.

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

52.3K Views.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. He did. So what?

Video: Light/dark Transition Test for Mice

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

מבוך פלוס גבוהות עבור עכברים

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

דגם Murine עבור מחלת פרקינסון: מן הנגע 6-OH דופמין מבחן ההתנהגות

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Transcript

Summary

Explore More Videos