Ce travail a été soutenu par le NIH et PKD Foundation pour ZS. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées en fonction de Yale Centre de Ressources animales (YARC) et institutionnel de protection des animaux et utilisation comité (IACUC) des lignes directrices.

Partie 1: Préparation de micropipettes, et les plaques de la chambre de microinjection <ol><li> Fabriquer micropipettes en chauffant et en tirant des tubes capillaires en verre borosilicate (World Precision Instruments, Inc, 1B100-4) dans un dispositif extracteur micropipette (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown P-97). Conserver dans une boîte de Pétri sur le dessus d&#39;une petite quantité d&#39;argile ou de ruban adhésif. </li><li> Verser 1,5% d&#39;agarose (American Bioanlytical, Inc, AB00972-00500) dans des plaques de milieu 1x E3 moulé avec des creux en forme de coin qui servira une méthode facile pour la tenue des embryons lors de l&#39;injection (comme décrit dans &#39;Le Livre Zebrafish &quot;) 1. Laisser les plaques d&#39;agar chambre de solidifier avant l&#39;utilisation et la conserver à 4 º C. </li></ol> Partie 2: Préparation de l&#39;ARN Une approche puissante pour les études de la fonction des gènes est de microinject ARN transcrit in vitro plafonnés dans embryons de poissons zèbres. Plafonné ARN se comporte comme ARNm eucaryotes trouvés in vivo en raison de la présence de l&#39;analogue de la PAC. Chercheurs Zebrafish systématiquement utiliser cette méthode pour surexprimer ou misexpress leur gène d&#39;intérêt. Dans cette démonstration, nous allons microinject une transcription EGFP-marqués et l&#39;utilisation d&#39;embryons vivre ensemble-GFP-expression comme un affichage visible pour une injection réussie. <ol><li> Effectuer une étude in vitro de la PAC réaction de transcription ARN sur votre relevé de notes d&#39;intérêt. Dans notre laboratoire, nous avons l&#39;habitude d&#39;insérer un ADNc d&#39;intérêt dans un vecteur pCS2 + et effectuer une réaction de synthèse in vitro de grandes quantités d&#39;ARN coiffé en utilisant le kit mMessage mMachine SP6 (Ambion, Inc, AM1340). </li><li> Purifier l&#39;échantillon d&#39;ARN en l&#39;exécutant à travers le kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc, 74104) ou par le phénol: extraction au chloroforme et précipitation isopropanol. </li><li> Soigneusement déterminer la concentration de la préparation d&#39;ARN et de stocker à -80 º C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Le jour de l&#39;injection, le dégel de l&#39;échantillon d&#39;ARN, vortex légèrement et centrifuger brièvement. </li><li> Préparer une solution de travail avec de l&#39;eau stérile et une concentration finale de 0,025 à 0,050% de rouge de phénol (Sigma-Aldrich, P0290). Rouge de phénol sert de marqueur visible pour l&#39;injection de la solution dans l&#39;embryon. Dans cet article, nous allons préparer une solution de travail de 100 ARNm EGFP ng / uL avec le rouge de phénol à 0,050%. </li><li> Gardez l&#39;échantillon de travail sur la glace et le retour des stocks ARN à -80 ° C. </li><li> Passez à la partie 4 lorsque vous êtes prêt à injecter cet échantillon. </li></ol> Partie 3: Préparation du morpholino Morpholino oligonucléotides antisens sont largement utilisés pour modifier l&#39;expression des gènes en bloquant la traduction d&#39;une protéine cible ou en modifiant l&#39;épissage de pré-ARNm 2,3. Morpholinos dans le poisson zèbre servir d&#39;outil de la génétique inverse puissante en faisant tomber la fonction des gènes. Dans cet article, nous allons microinject un oligo morpholino ciblé au site d&#39;initiation de translation de PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Basé sur le travail déjà établies, nous nous attendons à des embryons injectés au phénotypiquement imitent PKD2 4 poissons mutants. <ol><li> Nous avons régulièrement afin 300 nmol d&#39;un oligo morpholino spécialement conçu pour un gène d&#39;intérêt à partir des outils Gene, LLC (Philomath, OU). </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;eau stérile pour obtenir une solution à 3 mM. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Le jour de l&#39;injection, chauffer la solution morpholino à 65 ° C pendant 5 minutes. Aligner refroidir sur glace immédiatement et centrifuger brièvement. Cette étape dénature toutes les structures secondaires dans les oligo et s&#39;assure que la solution est totalement solubilisé. </li><li> Préparer une solution de travail en diluant la solution dans l&#39;eau stérile morpholino et une concentration finale de 0,025 à 0,050% de rouge de phénol. Dans cette démonstration, nous allons préparer une solution de travail de 0,50 mm PKD2 morpholino avec le rouge de phénol à 0,050%. </li><li> Continuez à travailler solution à température ambiante. </li><li> Passez à la partie 4 lorsque vous êtes prêt à injecter cet échantillon .---- </li></ol> Partie 4: Remplissage de la micropipette avec votre solution de travail <ol><li> Coupez l&#39;extrémité distale d&#39;une micropipette avec une pince ou une lame de rasoir chirurgicale afin de créer une ouverture qui est tout juste visible sous un microscope à dissection (Nikon Instruments, Inc, SM2645) à un grossissement de 50X. </li><li> Placer 2 uL de votre solution de travail comme une goutte sur une lamelle. </li><li> Fixez l&#39;arrière d&#39;une micropipette pour une seringue de 5 ml équipé avec des tubes sur une aiguille hypodermique et légèrement plonger l&#39;extrémité distale de la micropipette dans votre goutte de solution de travail. Prenez soin de ne pas casser la pointe de la micropipette. </li><li> Siphon la solution de travail à travers l&#39;extrémité distale de la micropipette en tirant le piston de la seringue. </li></ol> Partie 5: Calibrage du volume d&#39;injection micropipette <ol><li> Déposer une goutte d&#39;huile minérale (American bioanalytiques, Inc, AB00921-00025) sur une lame micromètre (FiSher, 12-561-SM1). </li><li> Tournez sur la puissance et la fourniture d&#39;air à la pression pulsé micro injecteur appareil (World Precision Instruments Inc, PV830). </li><li> Fixez la micropipette pour le détenteur de l&#39;appareil micropipette micro injecteur. L&#39;injecteur est micro pression régulée et les rejets sont activées en appuyant sur la pédale. </li><li> Sous le microscope de dissection, de tester le volume d&#39;injection en utilisant l&#39;injecteur micro à placer une goutte de votre solution de travail sur l&#39;huile micromètre. Mesurez le diamètre de la goutte comme il flotte comme une sphère sur le dessus de l&#39;huile. </li><li> Ajustez la durée et la pression d&#39;injection de bien calibrer votre volume d&#39;injection. Cette étape aides à la reproductibilité de l&#39;expérience de microinjection. Dans cette démonstration, tous les micro-injections seront faites avec un diamètre d&#39;une goutte de 0,15 mm (environ 1,76 nL en volume). </li><li> Une fois votre volume d&#39;injection a été calibré, utilisez le &quot;hold&quot; bouton sur le micro injecteur pour empêcher le remblayage et la fuite de la micropipette. </li></ol> Partie 6: Préparation du poisson zèbre fécondés pour la microinjection <ol><li> Le poisson zèbre au hasard compagnon dans les premières heures de chaque matin. Recueillir des embryons au stade 1-cellule et les placer dans 1x moyennes E3. </li><li> Aide d&#39;une pipette de transfert de 3 ml (Becton Dickinson Labware, 357524), organiser les embryons ainsi que les auges en forme de coin dans la chambre de plaques de micro-injection. </li><li> Retirez le support de telle sorte que les embryons sont immergés et non superficiellement inondés. Cette étape aides dans le règlement des embryons au fond des creux, ainsi que dans la pénétration du chorion par la micropipette. </li></ol> Partie 7: microinjection dans le chorion <ol><li> Manipuler les embryons à la micropipette pour que le cytoplasme de l&#39;embryon au stade 1-cellule est visible sous le microscope à dissection. Prenez soin de ne pas casser la pointe de la micropipette. </li><li> Pénétrer le chorion puis le jaune avec la micropipette afin d&#39;injecter dans l&#39;embryon. Dans cette démonstration, nous serons les premiers micro-injection dans le jaune juste en dessous de la cellule, et permettre l&#39;écoulement cytoplasmique et la diffusion d&#39;apporter la solution de travail dans la cellule. Ce flux est visible en raison de la rouge de phénol ajoutée à la solution de travail. </li><li> Nous allons également démontrer l&#39;injection directe dans le cytoplasme des cellules. Micro-injection directe dans la cellule est plus robuste, mais de temps que l&#39;orientation appropriée et l&#39;embryon technique de microinjection est nécessaire. Comme la membrane cellulaire est plus rigoureux que la membrane du jaune, il est souvent plus rapide pour entrer dans la micropipette dans le jaune pour atteindre le cytoplasme de la cellule. Orienter le pôle animal vers le fond de l&#39;auge et de travailler avec les mains stables peut aider à cette méthode d&#39;injection. </li><li> Après microinjection, placer les embryons dans une boîte de Pétri avec un milieu de l&#39;E3 et les incuber à 28,5 ° C pour un développement normal. </li><li> Au cours des prochaines heures et les jours de développement embryonnaire, d&#39;observer les embryons pour votre phénotypes d&#39;intérêt. </li></ol> Partie 8: Les résultats représentatifs Surexpression d&#39;ARNm EGFP: Pour vérifier le succès de la micro-injection, nous allons suivre l&#39;expression de la GFP dans les embryons en développement commence au stade du bouclier (~ 6 HPF) par la microscopie par fluorescence in vivo entier embryon (Leica Microsystems Gmbh, MZFLIII). Expression de la construction est la plus forte au cours des événements précoces du développement embryonnaire et diminue souvent pendant le développement que l&#39;injection de l&#39;ARN plafonné est progressivement dégradée et dépend de la stabilité de la protéine exprimée. PKD2 translationnelle bloquant morpholino: Basé sur les résultats publiés précédemment, nous prévoyons que le PKD2 morphants pour imiter la courbure dorsale du corps axe comme dans PKD2 zèbre mutant et kystes rénaux présent à environ 2 - 3 dpf 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Figure 1" /> Figure 1: Les résultats représentatifs de la micro-injection d&#39;ARNm EGFP et PKD2 août morpholino. (A) Les embryons ont été microinjectés TAB au stade 1-cellule avec 0,17 ng d&#39;ARNm EGFP et visualisées à 1 dpf pour la GFP in vivo l&#39;expression. (B, c) les embryons ont été microinjectés TAB au stade 1-cellule avec ~ 1,7 nl d&#39;une PKD2 translationnelle bloquant morpholino à 0,50 mM et a marqué pour la courbure dorsale du corps à 4 dpf.

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

Microinjection dans des embryons de poisson zèbre est une technique bien établie et solide pour explorer le rôle d&#39;un gène particulier dans le développement. Les applications incluent la surexpression, misexpression, et des dosages knockdown de votre gène d&#39;intérêt ainsi que l&#39;analyse épistatique entre les gènes multiples. Microinjection chez le poisson zèbre a été largement utilisé pour générer des animaux transgéniques, et la cartographie du destin cellulaire au début embryons blastula <s...

Tous les autres matériaux sont énumérés dans le protocole.

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

Un outil essentiel pour étudier le rôle d&#39;un gène au cours du développement est la capacité à effectuer inactivation génique, surexpression, et des études misexpression. Dans le poisson zèbre (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), La micro-injection d&#39;ARN, d&#39;ADN, protéines, oligonucléotides antisens et autres petites molécules dans l&#39;embryon en développement fournit aux chercheurs un test rapide et robuste pour explorer la fonction des gènes<em&gt; In vivo</em&gt;. Dans cette vidéo, article, nous allons montrer comment préparer et microinject<em&gt; In vitro</em&gt; Synthétisé ARNm EGFP et un blocage de translation morpholino oligo contre<em&gt; PKD2</em&gt;, Un gène associé à rénale autosomique dominante polykystiques (PKRAD), dans une cellule embryons de poissons zèbres scène. Nous allons ensuite analyser le succès de l&#39;ARNm et microinjections morpholino en vérifiant expression de la GFP et l&#39;analyse du phénotype. De vastes applications de cette technique comprennent générer des animaux transgéniques et chimères germinales, des cellules sort de cartographie et de dépistage génétique. Ici, nous décrivons un protocole pour la surexpression de EGFP et knockdown des<em&gt; PKD2</em&gt; Par l&#39;ARNm et l&#39;injection d&#39;oligonucléotides morpholino.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. at JoVE.com

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d&#39;ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K vues.  Yale University School of Medicine. La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.

Vidéo: Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Recherche

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.