עבודה זו נתמכה על ידי NIH ו PKD יסוד ZS. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי ייל מרכז משאבים בעלי חיים (YARC) ו Animal Care מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) הנחיות.

חלק 1: הכנת micropipettes, קאמרית צלחות microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק micropipettes ידי חימום ומושכים צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי (World Precision מכשירים, Inc, 1B100-4) במכשיר חולץ micropipette (סאטר מכשירים בע&quot;מ, Flaming / בראון P-97). חנות בצלחת פטרי על גבי כמות קטנה של חומר או דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים agarose 1.5% (אמריקאי Bioanlytical, Inc, AB00972-00500) ב 1x צלחות בינוני E3 יצוק עם בצורת טריז שקתות שישמש שיטה קלה לקיום עוברים במהלך הזריקה (כפי שמתואר בספר &quot;דג הזברה&quot;) 1. תנו קאמרית צלחות אגר לחזק לפני השימוש ולאחסן ב 4 º C. </li></ol> חלק 2: עריכת RNA גישה אחת חזקה ללימודי תפקוד הגן היא microinject ב-RNA במבחנה כתרים עיבד עוברי דג הזברה. RNA כתרים מתנהג בדומה mRNAs אוקריוטים מצאו in vivo בשל נוכחותם של אנלוגי CAP. החוקרים דג הזברה שגרתי לנצל בשיטה זו כדי overexpress או misexpress הגן העניין שלהם. בהפגנה זו, אנו microinject תמליל EGFP-tagged ולהשתמש לחיות כולו עובר GFP ביטוי כמו readout גלוי עבור זריקה מוצלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בתגובה במבחנה תעתיק הרנ&quot;א CAP על תמליל העניין שלך. במעבדה שלנו, אנחנו באופן קבוע להוסיף cDNA עניין לתוך וקטור pCS2 + ולבצע בתגובה סינתזה במבחנה של כמויות גדולות של RNA כתרים באמצעות mMachine mMessage SP6 Kit (Ambion, Inc, AM1340). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את דגימת רנ&quot;א ידי הפעלת אותו באמצעות ערכת מיני RNeasy (Qiagen, Inc, 74104) או על ידי פנול: מיצוי כלורופורם משקעים isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקבוע את הריכוז של הכנת RNA ולאחסן ב -80 º C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הזריקה, ההפשרה מערבולת, RNA מדגם קלות ספין למטה בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון לעבוד עם מים סטריליים וריכוז הסופי של 0.025 - 0.050% פנול אדום (סיגמא אולדריץ ושות&#39;, P0290). פנול אדום משמש כסמן גלוי עבור הזרקה של הפתרון לתוך העובר. במאמר זה, נכין פתרון העבודה של ה-mRNA ng / UL 100 EGFP עם פנול אדום 0.050%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מדגם עובדים על קרח מניות RNA לחזור -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חלק 4 כאשר מוכן להזרים מדגם זה. </li></ol> חלק 3: הכנת morpholino Morpholino מולקולות אנטיסנס הן בשימוש נרחב לשנות ביטוי גנים על ידי חסימת תרגום של חלבון ממוקד או על ידי שינוי טרום mRNA splicing 2,3. Morpholinos של דג הזברה משמשים כלי רב עוצמה גנטיקה הפוכה על ידי דריסה תפקוד הגן. במאמר זה, אנו microinject אוליגו morpholino ממוקדות לאתר החניכה translational של pkd2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &quot;). בהתבסס על העבודה שהוקמו קודם לכן, אנו מצפים העוברים מוזרק אל phenotypically לחקות pkd2 4 דגים מוטנטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו באופן שגרתי כדי 300 nmol של אוליגו morpholino שתוכננו במיוחד עבור הגן של עניין מתוך כלים ג&#39;ין, LLC (Philomath, OR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים סטריליים 100 UL לעשות 3 מניות פתרון מ&quot;מ. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הזריקה, חום הפתרון morpholino על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הצמד מגניב על קרח מיד ספין בקצרה. צעד זה denatures כל המבנים משני אוליגו ומבטיח כי הפתרון הוא solubilized לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד על ידי דילול פתרון morpholino במים סטריליים ריכוז סופי של 0.025 - 0.050% פנול אדום. בהפגנה זו, נהיה הכנת פתרון עבודה של 0.50 mM pkd2 morpholino עם פנול אדום 0.050%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לעבוד פתרון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חלק 4 כאשר מוכן להזרים מדגם זה .---- </li></ol> חלק 4: מילוי micropipette עם פתרון העבודה שלך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קצה דיסטלי של micropipette עם מלקחיים או ניתוח בסכין גילוח כדי ליצור הפתיחה כי הוא גלוי רק תחת מיקרוסקופ לנתח (ניקון מכשירים, Inc, SM2645) בהגדלה של 50X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 UL של פתרון העבודה שלך כמו ירידה על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את החלק האחורי של micropipette כדי מזרק 5 מ&quot;ל מצויד בצינור על מחט המזרק ואת מעט להטביע את קצה דיסטלי של micropipette לתוך ירידה של הפתרון שלך עובד. תשמרי על עצמך לא לשבור את קצה micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון עובד עד סוף דיסטלי של micropipette על ידי משיכת על הבוכנה של המזרק. </li></ol> חלק 5: כיול נפח הזרקה micropipette <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה של שמן מינרלי (American Bioanalytical, Inc, AB00921-00025) בשקופית מיקרומטר (Fiשר, 12-561-SM1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הכוח ואת אספקת אוויר בלחץ פעמו מיקרו מנגנון ההזרקה (World Precision מכשירים בע&quot;מ, PV830). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את micropipette לבעל micropipette המנגנון מיקרו ההזרקה. מזרק מיקרו הוא הלחץ מוסדר הפרשות מופעלים על ידי לחיצה על דוושת רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, לבדוק את עוצמת הזריקה באמצעות מזרק מיקרו למקום ירידה של פתרון העבודה שלך על הנפט מיקרומטר. מדוד את הקוטר של ירידה כפי שהוא מרחף כמו כדור על גבי השמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את משך הלחץ של זריקה כדי לכייל את עוצמת הקול בזהירות של זריקה. צעד זה מסייע שחזור הניסוי microinjection. בהפגנה זו, microinjections כל ייעשה בקוטר ירידה של 0.15 מ&quot;מ (כ 1.76 NL בנפח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע נפח הזרקה שלך כבר מכויל, השתמש כפתור &quot;החזק&quot; על מיקרו ההזרקה כדי למנוע דליפה של למלא את משבצות ו micropipette. </li></ol> חלק 6: הכנת עוברי דג הזברה מופרית עבור microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה רצון להזדווג באופן אקראי בשעות הראשונות של בוקר. איסוף עוברים בשלב 1-התא למקם אותם בינוני 1x E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet 3 מ&quot;ל ההעברה (בקטון דיקינסון labware, 357,524), לסדר את העוברים לאורך בצורת טריז שקתות של צלחות קאמרית microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום, כך עוברים הם שקועים שטחית ולא מוצף. צעד זה מסייע ליישוב עוברים לחלק התחתון של שקתות כמו גם חדירה של סיסית על ידי micropipette. </li></ol> חלק 7: Microinjection דרך סיסית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפעל את העוברים עם micropipette כך הציטופלסמה של העובר 1-תא הבמה גלוי מתחת למיקרוסקופ לנתח. תשמרי על עצמך לא לשבור את קצה micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור סיסית ולאחר מכן את החלמון עם micropipette כדי להזריק לתוך העובר. בהפגנה זו, נוכל להיות הראשון microinjecting בחלמון ישירות מתחת לתא, ולאפשר זרימת דיפוזיה cytoplasmic ולהביא את הפתרון עובד לתוך התא. תזרים זה גלוי עקב האדום פנול הוסיף הפתרון עובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו גם להפגין הזרקה ישירה לתוך הציטופלסמה של התא. Microinjection ישיר לתוך התא הוא חזק יותר אבל זמן רב כמו אוריינטציה העובר תקין טכניקה microinjection נדרשת. כאשר קרום התא הוא קפדני יותר קרום החלמון, היא לעתים קרובות יותר מהר להיכנס micropipette דרך החלמון להגיע אל הציטופלסמה התא. המכוונת את הקוטב חיה לעבר החלק התחתון של השוקת ועבודה עם ידיים יציבות עשוי לסייע שיטה זו של זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר microinjection, המקום עוברים לתוך צלחת פטרי עם המדיום E3 ו דגירה אותם 28.5 ° C להתפתחות נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כמה שעות, ימים של התפתחות העובר, להתבונן בעוברים פנוטיפים העניין שלך. </li></ol> חלק 8: תוצאות נציג EGFP overexpression mRNA: כדי לוודא את הצלחת microinjection, אנו תפקח את הביטוי של ה-GFP של עוברי בפיתוח תחילת בשלב מגן (~ hpf 6) על ידי במיקרוסקופ כולו עובר vivo פלואורסצנטי (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). הביטוי של הקמת חזקה ביותר במהלך האירועים המוקדמים של ההתפתחות העוברית לעיתים קרובות להפחית במהלך הפיתוח כמו רנ&quot;א כתרים מוזרק מתפרק בהדרגה תלוי ביציבות של החלבון לידי ביטוי. pkd2 translational חוסמות morpholino: בהתבסס על התוצאות שפורסמו בעבר, אנו מצפים pkd2 morphants לחקות את הגוף הגבי ציר העקמומיות כפי שנמצאו על כ 2 ב דג הזברה pkd2 מוטציה לבין ציסטות בכליות ההווה - 3 DPF 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="איור 1" /> איור 1: תוצאות נציגת microinjection של mRNA EGFP ו pkd2 אוגוסט morpholino. (א) היו עוברים TAB microinjected בשלב 1 תאים עם 0.17 ננוגרם של mRNA EGFP ו דמיינו ב DPF 1 עבור הביטוי GFP vivo. (ב, ג) היו עוברים TAB microinjected בשלב 1 תאים עם ~ 1.7 nl של pkd2 morpholino חסימת translational ב mM 0.50 ו הבקיע עבור עקמומיות הגוף הגבי ב DPF 4.

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

Microinjection לתוך עוברי דג הזברה היא טכניקה מבוססת היטב וחזק לחקור את תפקידו של גן מסוים בהתפתחות. היישומים כוללים overexpression, misexpression, מבחני מציאה של הגן העניין שלך, כמו גם ניתוח epistatic בין גנים רבים. Microinjection של דג הזברה כבר בשימוש נרחב עבור יצירת חיות טרנסגניות, מיפוי גורל תא ?...

כל החומרים האחרים המופיעים בפרוטוקול.

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

כלי הכרחי לחקירת תפקידו של הגן במהלך הפיתוח היא היכולת לבצע מציאה גן, overexpression, ומחקרים misexpression. בשנת דג הזברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Microinjection של רנ&quot;א, דנ&quot;א, חלבונים, מולקולות אנטיסנס ומולקולות קטנות אחרות לתוך העובר המתפתח מספק לחוקרים assay מהירה וחזקה לבחינת תפקוד הגן<em&gt; In vivo</em&gt;. במאמר-video זה, אנו מדגימים כיצד להכין microinject<em&gt; במבחנה</em&gt; מסונתז EGFP mRNA ו-translational חסימת morpholino אוליגו נגד<em&gt; Pkd2</em&gt;, גן הקשור למחלת כליה פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית (ADPKD), אל 1 תאים בשלב עוברי דג הזברה. נמשיך לנתח את ההצלחה של ה-mRNA ו microinjections morpholino ידי אימות ביטוי של GFP וניתוח פנוטיפ. יישומים רחב של טכניקה זו כוללות יצירת חיות טרנסגניות ונבט קו מפלצות, התא גורל מיפוי וסינון גן. בזאת אנו מתארים פרוטוקול עבור overexpression של EGFP ו מציאה של<em&gt; Pkd2</em&gt; על ידי ה-mRNA הזרקת morpholino oligonucleotide.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. at JoVE.com

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K Views.  Yale University School of Medicine. Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Video: Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.